Размеры всех объектов, являющихся предметом изучения микробиологии и вирусологии, лежат далеко за пределами разрешающей способности человеческого глаза. Морфология микроорганизма (его форма, размеры, взаиморасположение клеток, поверхностные структуры, внутренняя организация) является чрезвычайно важной его характеристикой и лежит в основе таксономии. Поэтому одним из главных методов исследования в области микробиологии является микроскопия. Основу микроскопических методов исследования составляют световая микроскопия со всеми ее разновидностями (темнопольная, фазово-контрастная, аноптральная, люминесцентная и др.) и электронная микроскопия. Выбор метода определяется целями, стоящими перед исследователем.

В основе световой микроскопии лежат различные свойства света. Современные световые микроскопы представляют собой довольно сложные приборы, совершенствуемые в течение 400 лет с момента создания первого прототипа микроскопа. Современный биологический световой микроскоп состоит из следующих основных элементов: штатива, состоящего из массивного основания (башмака), и тубусодержателя, на котором смонтирована механическая система грубой и тонкой настройки, револьвер с 3 – 4 сменными объективами, предметный столик с конденсором и диафрагмой и под ним светонаправляющее зеркало, концентрирующее естественный или искусственный свет на объект исследования, находящийся на предметном столике. Тубусодержатель микроскопа заканчивается головкой, на которой крепится монокулярный или бинокулярный тубус с окуляром или окулярами. Предметный столик имеет приспособление для крепления предметного стекла с препаратом и механизма для его перемещения.

Иммерсионная световая микроскопия

Важнейшей характеристикой каждого объектива, как и любой оптической системы, является его разрешающая способность. Под разрешающей способностью понимают минимальное расстояние между двумя точками, при котором они еще видны раздельно, т. е. не сливаются в одну. Разрешающая способность объектива ограничивается такими недостатками оптической системы, как сферическая и хроматическая аберрация, дифракция и т. д. Если первые два явления устранимы, то явление дифракции наблюдается в любой оптической системе. Она ограничивает разрешающую способность оптических систем. Разрешающая способность объектива с учетом явлений дифракции описывается следующей формулой:

где А – разрешающая способность; n – показатель преломления среды между препаратом и фронтальной линзой объектива (в случае масляной иммерсии n = 1,51);

α – угол между оптической осью объектива и самым крайним лучом, попадающим в объектив из центра препарата; λ – длина световой волны; 0,61 – коэффициент учета геометрических факторов при вычислении освещенности первого дифракционного максимума от круглого отверстия.

Величина n · sin α постоянна для каждого объектива и называется числовой, или нумерической, апертурой. Она выгравирована на оправе объектива. В монобромнафталиновых иммерсионных объективах нумерическая апертура может варьировать в пределах от 1,25 до 1,60. При наличии воздуха между фронтальной линзой и покровным стеклом нумерическая апертура не превышает 0,95 (сухие объективы). Из приведенной выше формулы видно, что разрешающая способность объектива прямо пропорциональна его числовой апертуре и обратно пропорциональна длине волны света, используемого для микроскопии. При микроскопии в видимом свете с длиной волны 0,55 мкм (550 нм) и иммерсионным объективом с нумерической максимальной апертурой 1,60 разрешающая способность равна:

Таким образом, даже в идеальном световом микроскопе нельзя увидеть объекты размером менее 0,2 мкм.

Величина угла, при котором глаз способен различать раздельно две точки, называется углом резкого зрения. Для получения на сетчатке четкого раздельного изображения двух точек световые лучи должны попасть в глаз под углом зрения, который стягивает дугу от 2 до 4 минут.

Изображение структур, разрешенных объективом, может быть увеличено окуляром лишь настолько, чтобы было различимо под углом, стягивающим дугу величиной от 2 до 4 минут. Это полезное увеличение микроскопа. Полезное увеличение микроскопа не может превышать числовую апертуру более чем в 1000 раз. Поэтому максимальное полезное увеличение для микроскопов, имеющих иммерсионные объективы с апертурой 1,4 – 1,6, составляет 1400 – 1600. Применение в таких микроскопах более сильных окуляров не выявляет никаких дополнительных деталей в разрешаемой объективом структуре препарата.

Фазово-контрастная микроскопия

Обыкновенные окрашенные препараты поглощают часть проходящего через них света, в результате чего амплитуда световых волн снижается, и частицы препарата выглядят темнее фона. При прохождении света через неокрашенный препарат амплитуда световых волн не меняется, происходит лишь изменение фазы световых волн, прошедших через частицы препарата. Однако человеческий глаз улавливать это изменение фазы света не способен, поэтому неокрашенный препарат при правильной установке освещения в микроскопе будет невидим.

Фазово-контрастное устройство позволяет превратить изменение фазы лучей, прошедших через частицы неокрашенного препарата, в изменения амплитуды, воспринимаемые человеческим глазом, и, таким образом, позволяет сделать неокрашенные препараты отчетливо видимыми.

Приспособление для фазово-контрастной микроскопии включает в себя конденсор с набором кольцевых диафрагм, обеспечивающих освещение препарата полным конусом света, и фазово-контрастные объективы, которые отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе располагается полупрозрачная фазовая пластинка в виде кольца, вызывающая сдвиг фазы проходящего через нее света. Установку освещения проводят так, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, в дальнейшем прошел через расположенное в объективе фазовое кольцо.

При рассмотрении препарата весь свет, прошедший через участки препарата, в которых нет каких-либо объектов, пройдет через фазовое кольцо и даст светлое изображение фона. Свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например бактериальные клетки, получит некоторое изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча – недифрагированный и дифрагированный. Недифрагированные лучи, пройдя в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе, получат дополнительный сдвиг фазы. Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция (наложение) дифрагированного и недифрагированного лучей, а так как эти лучи идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение и уменьшение амплитуды. Благодаря этому микробные клетки будут выглядеть темными на светлом фоне.

Существенными недостатками фазово-контрастной микроскопии являются слабая контрастность получаемых изображений и наличие светящихся ореолов вокруг объектов. Фазово-контрастная микроскопия не увеличивает разрешающей способности микроскопа, но помогает выявить детали структуры живых бактерий, стадии их развития, изменения в них под действием различных агентов (антибиотики, химические вещества и т. д.).

Аноптральная микроскопия (амплитудно-контрастная, фазово-темнопольная)

Аноптральная микроскопия – разновидность фазово-контрастной микроскопии, при которой применяют объективы со специальными пластинками, нанесенными на одну из линз в виде затемненного кольца.

Принцип аноптральной микроскопии тот же, что и фазово-контрастной, но первая обладает большей разрешающей способностью при микроскопировании объектов, вызывающих незначительный фазовый сдвиг, и открывает новые возможности использования обычного светового микроскопа для прижизненного исследования бактерий, простейших и т. д.

Широкое центральное отверстие в слое копоти или меди, нанесенном на линзу объектива, является как бы люком, выпускающим из объектива бwольшую часть дифрагированного света, в то время как широкий темный слой кольца, покрывающий остальную поверхность линзы, играет роль ловушки для нежелательного периферического дифрагированного света. За счет этого в значительной степени устраняется ореол вокруг исследуемого объекта, фон поля зрения имеет коричневато-серый цвет, а сами объекты имеют различные оттенки от светло-коричневого до белого.

Интерференционная микроскопия

Интерференционная микроскопия решает те же задачи, что и фазово-контрастная, но если последняя позволяет наблюдать лишь контуры объектов исследования, то с помощью интерференционной микроскопии можно изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный анализ. Это достигается благодаря раздвоению луча света в микроскопе: один из лучей проходит через частицу объекта, а другой мимо нее. В окуляре микроскопа оба луча соединяются и интерферируют между собой. Разность возникающих фаз можно измерить, определив таким образом массу различных клеточных структур. Последовательное измерение разности фаз света с известными показателями преломления дает возможность определять толщину живых объектов, концентрацию в них воды и сухого вещества и т. д. На основании данных интерференционной микроскопии можно косвенно судить о проницаемости мембран, активности ферментов, клеточном метаболизме объектов исследования.

Поляризационная микроскопия

Поляризационная микроскопия позволяет изучать объекты исследования в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях, т. е. в поляризованном свете. Для этого используют пленчатые поляроиды или призмы Николя, которые помещают в микроскопе между источником света и препаратом. Поляризация меняется при прохождении лучей света через различные структурные компоненты клеток и тканей, свойства которых неоднородны, или при отражении от них. В оптически изотропных структурах скорость распространения поляризованного света не зависит от плоскости поляризации, в анизотропных структурах она меняется в зависимости от направления света по продольной или поперечной оси объекта. Если показатель преломления света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает положительное двойное лучепреломление, при обратных взаимоотношениях – отрицательное двойное лучепреломление. Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, являются анизотропными и вызывают положительное двойное преломление света.

Темнопольная микроскопия

При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив. В объектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо).

Для микроскопии в темном поле используют специальный конденсор (параболоид-конденсор или кардиоид-конденсор) и обычные объективы. Поскольку апертура иммерсионного объектива больше, чем апертура конденсора темного поля, внутрь иммерсионного объектива вставляется специальная трубчатая диафрагма, снижающая его апертуру.

Этот метод микроскопии удобен при изучении живых бактерий, спирохет и их подвижности.

Люминесцентная микроскопия

Метод основан на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света. При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждающего люминесценцию. Так, если освещать объект синим светом, он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого и зеленого цвета. Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными светящимися красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый, изотиоцианат флуоресцеина и др.). Лучи света от сильного источника (обычно ртутной лампы сверхвысокого давления) пропускают через сине-фиолетовый светофильтр. Под действием этого коротковолнового излучения окрашенные флуорохромом клетки или бактерии начинают светиться красным или зеленым светом. Для того чтобы синий свет, вызвавший люминесценцию, не мешал наблюдению, над окуляром ставят запирающий желтый светофильтр, задерживающий синие, но пропускающий желтые, красные и зеленые лучи. В результате при наблюдении в люминесцентном микроскопе на темном фоне будут видны клетки или бактерии, светящиеся желтым, зеленым или красным светом. Например, при окраске акридиновым оранжевым ДНК клетки (ядерное вещество) будет светиться ярко-зеленым светом. Метод люминесцентной микроскопии позволяет изучать живые нефиксированные бактерии, окрашенные сильно разведенными флуорохромами, не причиняющими вреда микробным клеткам. По характеру свечения могут быть дифференцированы отдельные химические вещества, входящие в состав микробной клетки. Метод с успехом может быть использован для ускоренной диагностики ряда заболеваний (см. также раздел «Реакция иммунофлуоресценции» в гл. 42).

Электронная микроскопия

Для изучения структуры клеток на субклеточном и молекулярном уровнях, а также для изучения вирусов используют электронную микроскопию. Ценность электронной микроскопии заключается в ее способности разрешать объекты, не разрешаемые оптическим микроскопом в видимом или ультрафиолетовом свете. Малая длина волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, позволяет разрешать, т. е. различать как отдельные объекты, отстоящие друг от друга всего на 2 2 (0,2 нм, или 0,0002 мкм) или даже меньше, в то время как предел разрешения световой оптики лежит вблизи 0,2 мкм (он зависит от длины волны используемого света). Электронная микроскопия, при которой изображение получают благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называется просвечивающей (трансмиссионной). При сканирующей (растровой), или туннельной, электронной микроскопии пучок электронов быстро сканирует (просматривает) поверхность образца, вызывая излучение (отражение), которое посредством катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране микроскопа по аналогии с формированием телевизионного изображения.

Принципиальная оптическая схема электронного микроскопа аналогична схеме светового, в котором все оптические элементы заменены соответствующими электрическими: источник света – источником электронов, стеклянные линзы – линзами электромагнитными. В электронных микроскопах просвечивающего типа различают три системы: электронно-оптическую, вакуумную, электропитания. Фотографирование изображений при всех видах исследований проводится на фотопластинки или фотопленку. Источником электронов является электронная пушка, состоящая из V-образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900 °C при подаче постоянного напряжения до 100 кВ в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом. Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его разной толщины и электроноплотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое полезное увеличение объекта.

После объективной линзы электроны попадают в промежуточную линзу, которая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения дифракции с участков исследуемого образца. Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение объекта, которое направляется на флуоресцирующий экран. Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экрана на нем возникает видимое изображение объекта. После наведения резкости сразу проводят фотографирование. Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточной и проекционной линзами.

Электронно-микроскопическому исследованию могут быть подвергнуты как ультратонкие срезы различных тканей, клеток, микроорганизмов, так и целые бактериальные клетки, вирусы, фаги, а также субклеточные структуры, выделяемые при разрушении клеток различными способами.

Современные модели электронных микроскопов устроены так, что сочетают в себе возможности как просвечивающего, так и сканирующего микроскопов, и их легко можно переоборудовать с одного типа на другой. При просвечивающей электронной микроскопии получают плоскостные изображения объекта, а при сканирующей – удается получить трехмерное объемное изображение (с помощью компьютера). В бактериологии сканирование наиболее эффективно для выявления отростков и других поверхностных структур, для определения формы и топографических отношений как в колониях, так и на поверхности инфицированных тканей.

Электронная микроскопия требует специальной подготовки объектов исследования, в частности: фиксации тканей или микроорганизмов, обезвоживания (так как вода сильно рассеивает электроны), заливки в твердые среды (эпоксидные смолы), приготовления ультратонких срезов. С целью повышения четкости наблюдаемой картины используют методы позитивного или негативного контрастирования, а также метод оттенения.

При сканирующей микроскопии образец фиксируют, высушивают на холоде и напыляют в вакууме золотом или другими тяжелыми металлами. Таким образом получают реплику (отпечаток), повторяющую контуры образца и впоследствии сканируемую.

Четыре царства жизни

Мир микроорганизмов чрезвычайно разнообразен. По мере их открытия и изучения они были разделены на следующие группы:

1. Бактерии – Schizomycetes (грибы-дробянки; лат. schizo – расщепляю и mycetes – грибы).

2. Лучистые грибы – Actinomycetes (лат. actino – луч).

3. Нитчатые грибы – Trichomycetes (греч. trichos – волос).

4. Дрожжевые грибы – Blastomycetes (греч. blastos – почка, размножаются почкованием).

5. Сине-зеленые водоросли – Cyanophyta, они же цианобактерии (Cyanobacteria).

6. Спирохеты – Spirochaeta (греч. speira – спираль и chaite – волос).

7. Простейшие – Protozoa.

8. Риккетсии – Rickettsia.

9. Микоплазмы – Mycoplasma.

10. Вирусы.

11. Плазмиды.

Единственное, что их всех объединяет, – микроскопические размеры. Однако эти организмы существенным образом различаются по многим признакам и прежде всего по уровню организации геномов, наличию и составу белоксинтезирующих систем и клеточной стенки.

Все известные живые организмы в природе можно разделить на 4 существенно отличающиеся друг от друга царства: вирусы и плазмиды, архебактерии, эубактерии и эукариоты. Архебактерии и эубактерии по признаку отсутствия оформленного клеточного ядра объединяют в группу прокариот. К ним относятся бактерии, синезеленые водоросли, спирохеты, актиномицеты, риккетсии и подобные им бактерии, а также микоплазмы. Простейшие, дрожжи, нитчатые грибы и все другие группы живых существ с более высоким уровнем организации, имеющие оформленное клеточное ядро, называются эукариотами. В связи с таким разнообразием дать краткое и исчерпывающее определение понятия «микроорганизм» достаточно сложно, тем более, что к ним относятся вирусы и плазмиды, о природе которых шла продолжительная дискуссия. Нужно было определить главный критерий, который бы отличал живое от неживого. Современное представление о жизни связано с понятием гена. Ген является единственным носителем и хранителем жизни. Таким образом, главное отличие живого от неживого – наличие собственной генетической системы, которая обеспечивает наследственную непрерывность и эволюцию данного организма, т. е. его существование – жизнь. Все, кто имеет свою генетическую систему, должны рассматриваться как организмы. В свете всего сказанного и с учетом того, что уже известно о микроорганизмах, представляется возможным дать им такое определение.

Микроорганизмы – это невидимые простым глазом представители всех царств жизни: эукариоты, прокариоты (эубактерии и архебактерии), вирусы и плазмиды. Они занимают низшие ступени эволюции, но играют важную и разнообразную роль в общей экономике природы, в круговороте веществ, в патологии человека, животных и растений.

Отличительные особенности перечисленных царств жизни следующие.

К царству вирусов и плазмид относят организмы, у которых геном представлен либо ДНК, либо РНК; у них отсутствуют собственные системы биосинтеза белка и мобилизации энергии, поэтому они являются абсолютными внутриклеточными паразитами.

Прокариоты (эубактерии и архебактерии) – это организмы, у которых еще нет оформленного ядра, а есть лишь его предшественник – нуклеоид. Он представлен одной или несколькими хромосомами, которые состоят из ДНК и свободно располагаются в цитоплазме, не отграниченные от нее никакой мембраной. Прокариоты не имеют дифференцированного аппарата митоза, у них нет ядрышка. Кроме того, они имеют рибосомы 70S, и большинство их имеет клеточную стенку, содержащую пептидогликан, который отсутствует у эукариот. Размеры прокариот варьируют в пределах 1 – 20 мкм. У прокариот нет митохондрий и хлоропластов. Среди них есть аэробные и анаэробные организмы.

Архебактерии. В 70 – 80 гг. XX в. были использованы новые признаки при создании дендрограмм (древа жизни); сравнивали гены (или их продукты), выполняющие одну и ту же функцию, у разных классов организмов, например нуклеотидные последовательности 16S рРНК (18S рРНК) из 6 или большего числа остатков. Построенные по этим признакам дендрограммы выявили три высшие таксономические группы (домена): эубактерий, архебактерий и эукариот. При этом оказалось, что архебактерии отличаются от эубактерий и эукариот в такой же степени, в какой последние отличаются друг от друга. Основные отличия архебактерий от эубактерий: химический состав жесткой клеточной стенки различный, у архебактерий она не содержит пептидогликана; у архебактерий особая химическая структура липидов, иной компонентный состав РНК-полимераз; есть повторяющиеся последовательности в составе хромосомной ДНК; наличие интронов в генах тРНК и рРНК; различие в химическом составе и строении рибосом.

Сходство архебактерий с эукариотами: наличие интронов в генах тРНК и рРНК; наличие в хромосомных ДНК повторяющихся последовательностей; сходный компонентный состав РНК-полимераз; чувствительность белоксинтезирующих систем к дифтерийному токсину; сходство ферментных систем, участвующих в процессах репликации, транскрипции и трансляции. Рибосомы архебактерий имеют сходство с рибосомами 70S и 80S.

Таким образом, существуют четыре царства жизни: эукариоты; эубактерии; архебактерии; вирусы и плазмиды.

Среди архебактерий выделяют следующие группы:

1. Метаногены – организмы, являющиеся строгими анаэробами. Энергию для роста получают путем восстановления СО₂ до метана по реакции: СО₂ + 4Н₂ = СН₄ + + 2Н₂О, ΔG° = – 31,3 ккал/моль (водород потребляется из атмосферы).

2. Экстремальные галофилы – аэробные бактерии, способные расти в насыщенном растворе NaCl (до 32 %), нижняя пороговая концентрация NaCl = 12 – 15 %. Обладают системой фотосинтеза, отличной от таковой у других фотосинтезирующих бактерий (в мембране галофильных бактерий присутствует не хлорофилл, а бактериородопсин).

3. Термоацидофилы – характеризуются высокими оптимальными температурами (от 75 до 90 °C) и низкими значениями рН (от 5 – 6 до 1 – 2), опимальными для своего роста. Сумма Г + Ц у архебактерий варьирует от 28 до 68 мол%. Экстремальные условия существования архебактерий, вероятнее всего, указывают на то, что их предки возникли тогда, когда физические условия существенно отличались от современных. Патогенных для человека видов среди архебактерий не обнаружено.

Эубактерии. Длина хромосомы Escherichia coli составляет 1,6 мм; хромосома организована в форме нуклеоида длиной в 1 мкм, т. е. в структуру в 1600 раз более короткую. Упаковка ДНК в пределах нуклеоида существует в двух вариантах: в виде длинных суперспирализованных доменов (по 1000 000 п. н. в каждом), у E. coli таких доменов 43; и в виде коротких доменов из нескольких сот пар нуклеотидов. Стабилизирующую роль в такой упаковке играют специфические белки. У энтеробактерий известно не менее 5 таких белков: H, H1, HU, IFN, HLP1, которые имеют сходство с гистонами.

Эукариоты имеют рибосомы 80S, митохондрии или хлоропласты (в этих структурах содержатся рибосомы 70S), не содержат пептидогликана; все они – аэробные организмы. К эукариотам относятся все высшие растения и животные. Жгутики у эукариот состоят из белка тубулина и представляют собой систему микротрубочек, распологающихся по типу 9 + 2 и связанных с базальным телом. Жгутики у прокариот не содержат систем микротрубочек и построены из белка флагеллина.

Принципы систематики и классификации микроорганизмов

Систематика занимается всесторонним описанием видов организмов, выяснением степени родственных отношений между ними и объединением их в различные по уровню родства классификационные единицы (таксоны). Классификация – составная часть систематики. Она сводится к распределению организмов в соответствии с их общими признаками по различным таксонам. Таксономия – наука о принципах и методах распределения (классификации) организмов в иерархическом плане. Основной таксономической единицей в биологии является вид (species). Виды объединяют в таксоны более высоких рангов: род (genus), триба (tribus), семейство (familia), порядок (ordo), класс (classis), тип (phylum). Помимо этих основных категорий, используются также дополнительные – подрод, подтриба, подсемейство, подпорядок, подкласс, подтип. Иногда употребляются также неформальные категории «отдел» и более общая – «группа».

Общее для всех живых существ определение понятия «вид» дать чрезвычайно трудно в связи с многообразием форм жизни. В микробиологии были предложены различные понятия вида. Н. А. Красильников, автор фундаментального труда «Определитель бактерий и актиномицетов» (1949), дал следующее определение вида: «Вид – группа или совокупность близких между собой организмов, которые имеют общий корень происхождения, на данном этапе эволюции характеризуются определенными морфологическими, биохимическими и физиологическими признаками, обособлены отбором от других видов и приспособлены к определенной среде обитания». Это определение подвергалось различными авторами модификациям. Сейчас, когда стало понятно, что степень родства бактерий, их свойства и признаки зависят от их собственных геномов, можно дать более краткое определение вида: Вид – совокупность микроорганизмов, имеющих общий корень происхождения, сходный генотип (степень гомологии ДНК 60 % и более, близкое суммарное содержание пар Г + Ц) и максимально близкие фенотипические признаки.

Специфические особенности микроорганизмов определили и набор тех признаков и свойств, которые используются для их систематики и классификации.

1. Морфологические признаки – величина, форма, характер взаиморасположения.

2. Тинкториальные свойства – способность окрашиваться различными красителями. Особенно важным признаком является отношение к окраске по Граму, которое зависит от структуры и химического состава клеточной стенки бактерий. По этому признаку все бактерии делятся на грамположительные и грамотрицательные. Морфологические свойства и отношение к окраске по Граму определяют принадлежность к крупным таксонам – роду, семейству и т. д.

3. Культуральные свойства – особенности роста бактерий на жидких (образование пленки, осадок, помутнение) и плотных (форма, размеры, консистенция, края, поверхность, прозрачность колоний, образование пигмента и другие свойства) питательных средах. В микробиологии широко используют такие специфические термины, как «колония», «культура», «штамм», «типы» или «варианты». Под колонией принято понимать видимую простым глазом изолированную структуру, образующуюся в результате размножения и накопления бактерий за определенный срок инкубации. Колония образуется обычно из одной родительской клетки или из нескольких идентичных клеток. Поэтому пересевом из изолированной колонии может быть получена чистая культура возбудителя. Под культурой понимают всю совокупность бактерий, выросших на плотной или жидкой питательной среде. Как колония, так и культура каждого вида характеризуются определенными признаками. Основной и главный принцип бактериологии – во избежание ошибок изучать свойства только чистых, однородных культур. Каждая выделенная культура данного вида бактерий называется также штаммом, т. е. конкретным образцом данного вида (нем. stammen – происходить). Штаммы одного и того же вида бактерий, различающиеся по антигенному строению, называют серотипами (сероварами, серовариантами), по чувствительности к фагу – фаготипами (фаговарами), по биохимическим или культуральным признакам – биотипами (биоварами) и т. п. Штамм можно считать низшей таксономической единицей бактерий.

4. Подвижность бактерий. Различают бактерии подвижные и неподвижные. Подвижные бактерии подразделяют на ползающие, или скользящие, они передвигаются за счет волнообразного сокращения клеток; и плавающие бактерии, у которых активная подвижность связана с наличием жгутиков.

5. Спорообразование – форма и характер расположения споры в клетке.

6. Физиологические свойства – способы углеродного (аутотрофы, гетеротрофы), азотного (аминоавтотрофы, аминогетеротрофы) питания; тип дыхания: аэробы, факультативные анаэробы, строгие анаэробы, микроаэрофилы.

7. Биохимические свойства – способность ферментировать различные углеводы, протеолитическая активность, образование индола, сероводорода, наличие уреазы и других ферментов и т. д.

8. Чувствительность к специфическим бактериофагам.

9. Антигенные свойства. Они зависят от химического состава клеточной стенки и жгутиков бактерий.

10. Химический состав клеточных стенок (содержание и состав основных сахаров и аминокислот).

11. Липидный и жирнокислотный состав. Изучение состава жирных кислот проводят с помощью газовой хроматографии, которая обладает высокой разделительной способностью и чувствительностью.

12. Белковые спектры. С помощью различных методов фракционирования, а главным образом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле, разделяют сложные смеси рибосомных, мембранных или внутриклеточных белков и получают электрофореграммы, или белковые спектры, соответствующей фракции данного вида бактерий.

В связи с тем, что количество фенотипических признаков, используемых для классификации микроорганизмов, значительно возросло, в конце 50-х гг. ХХ в. возникла нумерическая (численная) таксономия. Ее возникновению способствовало появление более совершенных компьютерных систем, которые позволяют быстро и точно производить громоздкие математические расчеты. В основе нумерической таксономии лежит принцип сопоставления организмов по возможно большему количеству учитываемых признаков при допущении, что все они для систематики равноценны. Однако принцип равнозначности является основным недостатком этого метода.

В последние годы для классификации бактерий помимо изучения их фенотипических свойств все более широко используют методы геносистематики. В ее основе лежит изучение нуклеотидного состава ДНК и наиболее важных характеристик генома, в частности его размера (величина, объем, молекулярная масса) и других параметров. Наиболее точным методом установления генетического (геномного) родства между бактериями является определение степени гомологии ДНК. Чем больше идентичных генов, тем выше степень гомологии ДНК и ближе генетическое родство.

Метод молекулярной гибридизации ДНК – ДНК считается сейчас наиболее важным для систематики бактерий. Однако четких и твердо установленных критериев степени гомологии ДНК для таких рангов, как вид и род бактерий, еще нет. Допускают, что диапазон гомологии ДНК от 60 до 100 % говорит о принадлежности к одному и тому же виду, степень гомологии от 40 до 60 % – к разным родам одного семейства. Таким образом, подобно тому, как фенотип и генотип отражают сущность организма, феносистематика и геносистематика отражают сходство и различие организмов, степень их генетического родства. Признаки, используемые для систематики бактерий, используют и для их идентификации, т. е. для установления их таксономического положения и прежде всего видовой принадлежности, что является решающим моментом бактериологической диагностики инфекционных заболеваний. Чаще всего для идентификации патогенных бактерий изучают их морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические и антигенные свойства, а при необходимости и некоторые другие, например отношение к специфическим фагам, антибиотикам и т. д.

Современные методы микробиологической диагностики инфекционных заболеваний

Основные требования, предъявляемые к современным методам микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, – высокая специфичность и чувствительность. Эти методы следующие.

Микроскопический. С помощью микроскопии нативного патологического материала, полученного от больного, определяют вид возбудителя по его форме, взаиморасположению клеток и способности окрашиваться определенными красителями.

Бактериологический. Метод основан на выделении чистой культуры возбудителя и его идентификации.

В настоящее время разработаны различные автоматические системы, позволяющие в течение нескольких часов определить вид возбудителя и изучить его антибиотикограмму (см. с. 184).

Серологический. Метод основан на определении в крови больных или переболевших специфических антител к соответствующим возбудителям с помощью различных реакций: агглютинации, преципитации, связывания комплемента, иммунной флуоресценции, иммуноферментного и радиоиммунного методов и др. Серологические реакции, кроме того, могут быть использованы и для непосредственного обнаружения антигенов возбудителя в исследуемом материале (реакции пассивной гемагглютинации, коагглютинации, латекс-агглютинации, агрегат-гемагглютинации, иммунофлуоресценции и т. д.).

Биологический. В основе метода лежит заражение лабораторных животных исследуемым материалом с целью воспроизведения у них инфекционного заболевания и (или) последующего выделения возбудителя.

Аллергические пробы. С помощью этих проб обнаруживают повышенную чувствительность макроорганизма к определенным возбудителям или продуктам их жизнедеятельности. Аллергические реакции характеризуются антигенной специфичностью, для их выявления применяют препараты, называемые аллергенами.

За последние годы самое широкое применение для идентификации и дифференциации микроорганизмов получили молекулярно-биологические методы: методы молекулярных, или генных, зондов, особенно в сочетании с полимеразной цепной реакцией; метод геномной дактилоскопии (ДНК-фингерпринт, англ. finger-print – отпечаток пальца) и др.

Метод генных зондов (ДНК– и РНК-зондов) – основан на реакции гибридизации между фрагментом нуклеотидной последовательности (зондом), несущим наиболее специфический для определенного вида бактерий или вирусов ген (гены), и ДНК (РНК) микроорганизма, находящегося в исследуемом субстрате. Точность метода зависит от качества зонда (его чистоты). Наилучшими ДНК– и РНК-зондами служат полученные путем химического синтеза олигонуклеотидные последовательности (о. п.), расположение нуклеотидов в которых полностью соответствует таковому участка гена (или всего гена), ответственного за определенную функцию микроорганизма. ДНК-зонды метят различными способами: изотопами, специальным белком биотином, флуорохромами и т. п.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, или ЦПР). Выдающуюся роль для создания новых типов ДНК-зондов (ДНК-маркеров) сыграло использование метода амплификации (англ. amplification – увеличение) in vitro определенного участка ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов полимеразной реакции. Кэри Мюллису, предложившему в 1983 г. метод ПЦР, в 1993 г. была присуждена Нобелевская премия. Метод ПЦР позволяет быстро получить более 10 млн копий определенной о. п. ДНК, первоначально представленной одной или несколькими молекулами. Модификации метода ПЦР легли в основу создания различных типов ДНК-маркеров – праймеров (англ. primer – запал, средство воспламенения). ПЦР используют для обнаружения любого агента, если для него имеется соответствующий праймер. ПЦР незаменима в тех случаях, когда трудно или даже невозможно выделить чистую культуру возбудителя. Предложен метод генотипирования, который основан на количественном анализе многолокусных генотипов бактерий (MLVA – анализ многолокусных вариантов) бактерий. Один из его вариантов используют для генотипирования бактерий, содержащих вариабельное число тандемных повторов (variable number of tandem repeats – VNTR).

Геномная дактилоскопия (ДНК-фингерпринт) основана на рестрикционном анализе ДНК микроорганизмов с применением специфических зондов. Этот метод позволяет исследовать полиморфизм множества локусов повторяющихся о. п. (мультилокусный анализ) в ДНК различных организмов. С его помощью можно выявить в геноме млекопитающих более 30 высокополиморфных локусов, что достаточно для индивидуальной идентификации человека, животных и растений.

Современная классификация бактерий

В «Определителе бактерий-9» (1984 – 1989) прокариоты в зависимости от строения клеточной стенки разделены на 17 частей:

Часть 1. Спирохеты (5 родов).

Часть 2. Аэробные (микроаэрофильные), подвижные, вибрионоподобные грамот рицательные бактерии (7 родов).

Часть 3. Неподвижные (иногда подвижные) грамотрицательные изогнутые бакте рии (7 родов).

Часть 4. Грамотрицательные аэробные палочки и кокки (8 семейств, в том числе Pseudomonadaceae; 37 родов).

Часть 5. Факультативно анаэробные грамотрицательные палочки (3 семейства: Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Pasteurellaceae; 34 рода).

Часть 6. Анаэробные грамотрицательные, прямые и изогнутые палочки (семей ство Bacteroidaceae – 13 родов).

Часть 7. Сульфат или серувосстанавливающие бактерии (7 родов).

Часть 8. Анаэробные грамотрицательные кокки (семейство Veillonellaceae – 3 рода).

Часть 9. Риккетсии и хламидии (2 порядка, 4 семейства, 3 трибы, 15 родов).

Часть 10. Микоплазмы. Отдел Tenericutes. Класс Mollicutes (3 семейства, 6 родов).

Часть 11. Эндосимбионты простейших (реснитчатых, жгутиковых, амеб – 5 родов), грибов, насекомых и других беспозвоночных.

Часть 12. Грамположительные кокки (2 семейства, 15 родов, в том числе Stаphylococcus и Streptococcus).

Часть 13. Грамположительные палочки и кокки, образующие споры (6 родов, в том числе Bacillus и Clostridium).

Часть 14. Не образующие спор грамположительные правильные палочки (7 родов).

Часть 15. Грамположительные неправильные палочки, не образующие спор (21 род, в том числе Corynebacterium).

Часть 16. Микобактерии (семейство Mycobacteriaceae, род Mycobacterium).

Часть 17. Нокардиоподобные бактерии (9 родов).

Однако уже в 1993 г. в определитель Берги были внесены новые изменения. Все 4 отдела («главные категории») были разделены на группы, перечисленные ниже.

ОТДЕЛ I. Грамотрицательные эубактерии, имеющие клеточную стенку, или Gracilicutes

Группа 1. Спирохеты. Роды: Borrelia, Brachyspira, Cristispira, Leptonema, Leptospira, Serpulina, Spirochaeta, Treponema.

Группа 2. Аэробные (или микроаэрофильные), подвижные, вибриоидные грамотрицательные бактерии. Роды: Alteromonas, Aquaspirillum (кроме A. fasciculus), Azospirillum, Bdellovibrio, Campylobacter, Cellvibrio, Halovibrio, Helicobacter, Herbaspirillum, Marinomonas, Micavibrio, Oceanospirillum, Spirillum, Sporospirillum, Vampirovibrio, Wolinella.

Группа 3. Неподвижные (или редко подвижные) грамотрицательные изогнутые бактерии. Роды: Ancylobacter, «Brachyarcus», Cyclobacterium, Flectobacillus, Meniscus, «Pelosigma», Runella, Spirosoma.

Группа 4. Грамотрицательные аэробные (или микроаэрофильные) палочки и кокки.

Подгруппа 4а. (Аэробы, палочки и кокки, которые растут в атмосфере воздуха, содержащего 21 % кислорода). Роды: Acetobacter, Acidophilium, Acidomonas, Acidothermus, Acidovorax, Acinetobacter, Afipia, Agrobacterium, Agromonas, Alcaligenes, Alteromonas, Aminobacter, Aquaspirillum fasciculus, Azomonas, Azorhizobium, Azotobacter, Beijerinckia, Bordetella, Bradyrhizobium, Brucella, Chromohalobacter, Chryseomonas, Comamonas, Cupriavidus, Deleya, Derxia, Ensifer, Erythrobacter, Flavimonas, Flavobacterium, Francisella, Frateuria, Gluconobacter, Halomonas, Hydrogenophaga, Janthinobacterium, Kingella, Lampropedia, Legionella, Marinobacter, Marinomonas, Mesophilobacter, Methylobacillus, Methylobacterium, Methylococcus, Methylomonas, Methylophaga, Methylophilus, Methylovorus, Moraxella, Morococcus, Neisseria, Oceanospirillum, Ochrobacterium, Oligella, Paracoccus, Phenylobacterium, Phyllobacterium, Pseudomonas, Psychrobacter, Rhizobacter, Rhizobium, Rhizomonas, Rochalimaea henselae, Roseobacter, Rugamonas, Serpens, Sinorhizobium, Sphingobacterium, Thermoleophilum, Thermomicrobium, Thermus, Variovorax, Volcaniella, Weeksella, Xanthobacter, Xanthomonas, Xylella, Xylophilus, Zoogloea.

Подгруппа 4б. (Микроаэрофилы, не растут при концентрации кислорода в воздухе 21 %). Роды: Taylorella, Wolinella, Bacteroides (B. urealyticus и B. gracilis).

Группа 5. Факультативно-анаэробные грамотрицательные палочки.

Подгруппа 1. Семейство Enterobacteriaceae. Роды: Arsenophonus, Budvicia, Buttiauxella, Cedecea, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclerica, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Salmonella, Serratia, Shigella, Tatumella, Xenorhabdus, Yersinia, Yokenella.

Подгруппа 2. Семейство Vibrionaceae. Роды: Aeromonas, Enhydrobacter, Photobacterium, Plesiomonas, Vibrio (14 видов).

Подгруппа 3. Семейство Pasteurellaceae. Роды: Actinobacillus, Haemophilus, Pasteurella.

Подгруппа 4. Другие роды: Callymatobacterium, Cardiobacterium, Chromobacterium, Eikenella, Gardnerella, Streptobacillus, Zymomonas.

Группа 6. Грамотрицательные, анаэробные прямые, изогнутые и спиральные палочки. Роды: Acetivibrio, Acetoanaerobium, Acetofilamentum, Acetogenium, Acetomicrobium, Acetothermus, Acidaminobacter, Anaerobiospirillum, Anaerorhabdus, Anaerovibrio, Bacteroides, Butyrivibrio, Centipeda, Fervidobacterium, Fibrobacter, Fusobacterium, Haloanaerobium, Halobacteroides, Llyobacter, Lachnospira (см. также группу 20), Leptotrichia, Malonomonas, Megamonas, Mitsuokella, Oxalobacter, Pectinatus, Pelobacter, Porphyromonas, Prevotella, Propionigenium, Propionispira, Rikenella, Roseburia, Ruminobacter, Sebaldella, Selenomonas, Sporomusa, Succinimonas, Succinivibrio, Syntrophobacter, Syntrophomonas, Thermobacteroides, Thermosipha, Thermotoga, Tissierella, Wolinella, Zymophilus.

Группа 7. Диссимилирующие сульфат или серуредуцирующие бактерии. Роды: Desulfuromonas, Desulfovibrio, Desulfomonas, Desulfococcus, Desulfobacter, Desulfosarcina, Desulfobulbus.

Группа 8. Анаэробные грамотрицательные кокки. Семейство Veillonellaceae. Роды: Acidaminococcus, Megasphaera, Syntrophococcus, Veillonella.

Группа 9. Риккетсии и хламидии.

Порядок I. Rickettsiales. Pиккетсии. Семейство Rickettsiaceae. Роды: Rickettsia,

Rochalimaea, Coxiella, Ehrlichia, Cowdria, Neorickettsia, Wolbachia, Rickettsiella. Семейство Bartonellaceae. Роды: Bartonella, Grahamella. Семейство Anaplasmataceae. Роды: Anaplasma, Aegyptianella, Haemobartonella, Eperythrozoon.

Порядок II. Chlamydiales. Хламидии. Семейство Chlamydiaceae, род Chlamydia.

Группа 10. Аноксигенные (не образующие кислорода) фототрофные бактерии. Содержат бактериохлорофилл и каротиноидные пигменты, но не содержат фикобилипротеинов. Могут использовать свет как источник энергии. Фотоаутотрофы или фотоорганотрофы в анаэробных или микроаэрофильных условиях, не образуют при фотосинтезе О₂. В отличие от оксигенного фотосинтеза аноксигенный фотосинтез зависит от внешних доноров электронов (восстановленные серные соединения, молекулярный водород или органические соединения).

Группа 11. Оксигенные (образующие кислород) фототрофные бактерии.

Содержат хлорофилл а, могут использовать свет как источник энергии и образуют О₂ по такому же способу, как и зеленые растения. Различают две подгруппы: 1. Cодержат хлорофилл а и имеют фикобилипротеины (аллофикоцианин, фикоцианин и иногда фикоэритрин). Эти организмы называют цианобактериями, или синезелеными водорослями. 2. Cодержат хлорофилл а и хлорофилл b, но не содержат фикобилипротеинов.

Группа 12. Аэробные хемолитотрофные бактерии и родственные организмы. Нефототрофные организмы. Различают следующие подгруппы: 1. Нитрифицирующие. Могут использовать в качестве источника энергии для своего роста восстановленные неорганические соединения азота (соли аммония и нитриты). 2. Серуокисляющие. Могут окислять восстановленные неорганические соединения серы, и большинство организмов использует их в качестве единственного источника энергии. 3. Облигатные окислители водорода. Используют газообразный водород (Н₂) как источник энергии для роста, но не используют органических соединений углерода. 4. Бактерии, которые образуют или откладывают железо и/или оксиды марганца на клетках или внутри них. 5. Магнитоподвижные бактерии. Проявляют магнитотаксис в магнитных полях. Бактерии содержат богатые железом электронно-плотные внутриклеточные включения (магнитосомы).

Группа 13. Почкующиеся и/или образующие придатки бактерии. Нефототрофные бактерии, которые подразделяются на следующие подгруппы: 1. Бактерии, имеющие простеки (лат. prosteca) – полужесткое удлинение клеточной стенки, цитоплазматической мембраны и цитоплазмы, которое имеет диаметр меньший, чем сама клетка. А. Размножающиеся асимметрично путем почкования. Почки могут образовываться на кончике простека или на клеточной поверхности. Б. Размножающиеся путем бинарного поперечного деления. 2. Бактерии, не образующие простека. А. Почкующиеся бактерии. Б. Непочкующиеся бактерии, имеющие стебельки. В отличие от простека, стебелек представляет собой лентовидную или трубчатую структуру, образуемую из материала, секретируемого бактериальной клеткой. С помощью стебелька бактерии прикрепляются к поверхностям. В. Другие бактерии: а) бактерии, несущие тонкие нити, покрытые оксидами марганца; б) бактерии, несущие тонкие волокнистые структуры, не покрытые оксидами металлов; в) бактерии, имеющие стебельки (полые конические выросты, видимые с помощью световой микроскопии и имеющие поперечные полосы, которые обнаруживаются при электронной микроскопии).

Группа 14. Бактерии, образующие футляры. Нефототрофы. Аэробы. Не обладают скользящей подвижностью. Бактерии растут в виде цепочек клеток в нитях. Нити растут в трубках-футлярах из экзоклеточного материала. В типичных случаях футляр прозрачный; когда рассматривается во влажной среде с помощью фазово-контрастной микроскопии, очень похож на микроскопическую пластиковую трубочку или дудку. Иногда футляр настолько тонкий и тесно связан с клеткой, что он с трудом выявляется при фазовоконтрастной микроскопии. Добавление 95 %-ного этанола в «висячую» или «раздавленную» каплю облегчает выявление футляра. Другим способом футляр может быть обнаружен, если в нити имеются разрывы между клетками. Футляры могут иметь окраску от желтого до темно-коричневого цвета, созданную отложениями железа или оксидов марганца. Одиночные клетки могут быть неподвижными или подвижными, когда имеют жгутики с полярным или субполярным расположением. Роды: «Clonothrix», Crenothrix, Haliscomenobacter, Leptothrix, «Lieskella», «Phragmidiothrix», Sphaerotilus.

Группа 15. Нефотосинтезирующие, не образующие плодов скользящие бактерии. Нефототрофные палочки или нити, лишенные жгутиков, но обладающие скользящей подвижностью на твердых поверхностях.

Группа 16. Образующие плоды скользящие бактерии. Миксобактерии.

ОТДЕЛ II. Грамположительные эубактерии, имеющие клеточную стенку, или Firmicutes

Группа 17. Грамположительные кокки. Роды: Aerococcus, Coprococcus, Deinobacter, Deinococcus, Enterococcus, Gemella, Lactococcus, Leuconostoc, Marinococcus, Melissococcus, Micrococcus, Pediococcus, Peptostreptococcus, Planococcus, Ruminococcus, Saccharococcus, Salinicoccus, Sarcina, Staphylococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Trichococcus, Vagococcus.

Группа 18. Эндоспорообразующие грамположительные палочки и кокки. Роды: Amphibacillus, Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Oscillospira, Sporohalobacter, Sporolactobacillus, Sporosarcina, Sulfidobacillus, Syntrophospora.

Группа 19. Правильные, неспорообразующие грамположительные палочки. Роды: Brochothrix, Carnobacterium, Caryophanon, Erysipelothrix, Kurthia, Lactobacillus, Listeria, Renibacterium.

Группа 20. Неправильные, неспорообразующие грамположительные палочки. Роды: Асеtobacterium, Acetogenium, Actinomyces, Aeromicrobium, Agromyces, Arachnia, Arcanobacterium, Arthrobacter, Aureobacterium, Bifidobacterium, Brachybacterium, Brevibacterium, Butyrivibrio (могут также окрашиваться по Граму отрицательно – см. группу 6, с. 29), Caseobacter, Cellulomonas, Clavibacter, Coriobacterium, Corynebacterium, Curtobacterium, Dermabacter, Eubacterium, Exiguobacterium, Falcivibrio, Gardnerella, Jonesia, Lachnospira, Microbacterium, Mobiluncus, Pimelobacter, Propionibacterium, Rarobacter, Rothia, Rubrobacter, Sphaerobacter, Terrabacter, Thermoanaerobacter, Thermoanaerobium.

Группа 21. Микобактерии. Семейство Mycobacteriaceae. Род Mycobacterium.

Группы 22 – 29. Актиномицеты. В зависимости от морфологических свойств, по хемотипу клеточной стенки и другим химическим признакам подразделяются на 8 групп.

Группа 22. Нокардиоформные актиномицеты, включает 19 родов, в том числе Nocardia, Oerscovia, Pseudonocardia.

Группа 23. Актиномицеты с множественно расположенными спорангиями. Роды: Dermatophilus, Frankia, Geodermatophilus.

Группа 24. Актинопланеты. Включает 6 родов.

Группа 25. Стрептомицеты и близкие к ним роды, всего 5 родов.

Группа 26. Мадуромицеты, всего 7 родов.

Группа 27. Актиномицеты, образующие термоустойчивые споры. Включает 5 родов.

Группа 28. Термоактиномицеты. Один род – Thermoactinomyces, все виды термофилы.

Группа 29. Роды, которые не могут быть отнесены к какой-либо группе (3 рода).

ОТДЕЛ III. Эубактерии, лишенные клеточной стенки, или Tenericutes

Группа 30. Микоплазмы. Класс Mollicutes. Порядок Mycoplasmatales. Разделен на две подгруппы:

Подгруппа 1. Факультативные анаэробы, или микроаэрофилы. Роды: Acholeplasma, Mycoplasma, Spiroplasma, Ureaplasma.

Подгруппа 2. Облигатные анаэробы. Роды: Anaeroplasma, Asteroleplasma.

ОТДЕЛ IV. Архебактерии, или Mendosicutes

Группа 31. Метаногены. Строгие анаэробы, образуют метан как основной конечный метаболический продукт. В качестве субстратов могут служить Н₂– СО₂, формиат, ацетат, метанол, метиламины или Н₂-метанол. Серу восстанавливают до H₂S. Клетки флуоресцируют при длине волны 420 нм голубовато-зеленым цветом; имеют коэнзим М, фактор 420, фактор 430 и метанопротеин. Тип РНК-полимеразы – AB'B''.

Группа 32. Сульфатвосстанавливающие архебактерии. Строгие анаэробы, образуют H₂S из солей серной кислоты путем их восстановления. Образуют также очень немного метана. Проявляют голубовато-зеленую флуоресценцию при 420 нм. В клетках содержатся фактор 420 и метанопротеин, но отсутствуют коэнзим М и фактор 430. Тип РНК-полимеразы – (А+С)B'B''. Экстремальные термофилы – растут при температуре 92 °C.

Группа 33. Экстремальные галофильные архебактерии (галоархебактерии). Аэробы или факультативные анаэробы, хемоорганотрофы, клетки могут быть грамотрицательными или грамположительными, правильной или очень неправильной формы. Требуют для роста высокой концентрации NaCl (1,5 М или выше). Нейтрофилы или алкалифилы, мезофилы или слабые термофилы (растут при t выше 55 °C). Некоторые виды содержат пурпурно-красный фотоактивный пигмент бактериородопсин и способны использовать свет для синтеза АТФ. РНК-полимераза типа AB'B''C.

Группа 34. Архебактерии, лишенные клеточной стенки. Термоацидофилы, аэробы, клетки кокковидной формы, клеточная стенка отсутствует. Цитоплазматическая мембрана содержит богатый маннозой гликопротеин и липогликан. РНК-полимераза типа ВАС.

Группа 35. Экстремально термофильные и гипертермофильные архебактерии, метаболизирующие серу. Облигатные термофилы, оптимальная температура для роста – между 70 и 105 °C. Аэробы, или факультативные анаэробы, или строгие анаэробы. Ацидофилы и нейтрофилы. Аутотрофы или гетеротрофы. Большинство видов метаболизирует серу. РНК-полимераза типа ВАС.

В 2001 г. классификация бактерий Берги вновь претерпела большие изменения. Первые 3 отдела (Gracilicutes, Firmicutes и Tenericutes) были объединены в новую неформальную группу – домен эубактерий (Bacteria), а 4-й отдел (Mendosicutes) выделен как самостоятельный домен архебактерий (Archaea) с двумя типами – AI Crenarchaeota (1 класс, 25 родов) и AII Euryarchaeota (8 классов, 55 родов). Основные группы архебактерий перечислены на с. 23, 31.

Домен эубактерий поделен на 24 типа, которые разделены на 33 класса. Бактерии, описанные в учебнике и чаще всего вызывающие инфекционные заболевания людей, включены в следующие типы, классы и роды. Тип Proteobacteria. Класс Alphaproteobacteria [роды Rickettsia, Orientia (к которому теперь относят возбудителя лихорадки цуцугамуши Rickettsia orientalis (= R. tsutsugamushi), Ehrlichia, Bartonella, Brucella]. Класс Betaproteobacteria [роды Alcaligenus, Bordetella, Burkholderia (включающий возбудителей сапа и мелиоидоза, ранее называвшихся Pseudomonas mallei и P. pseudomallei), Neisseria, Kingella, Spirillum]. Класс Gammaproteobacteria (роды Francisella, Legionella, Coxiella, Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter, Vibrio, Enterobacter, Citrobacter, Edwardsiella, Erwinia, Escherichia, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia, Pasteurella). Класс Epsilonproteobacteria (роды Campylobacter и Helicobacter). Тип Firmicutes. Класс Clostridia (роды Clostridium, Sarcina, Peptostreptococcus, Eubacterium, Peptococcus, Veilonella). Класс Mollicutes (роды Mycoplasma и Ureaplasma). Класс Bacilli (роды Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Streptococcus). Тип Actinobacteria (роды Actinomyces, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Propionobacterium, Bifidobacterium). Тип Chlamidiae (род Chlamidia). Тип Spirochaetes (роды Spirochaeta, Borrelia, Treponema, Leptospira). Тип Bacteroidetes. Класс Bacteroidetes (роды Bacteroides и Prevotella). Тип Fusobacteria (род Fusobacterium).

Таким образом, в классификации Берги-2001 (George M. Garrity, Julia A. Bell, Timothy G. Lilburn. Taxonomic Outline of the Prokaryotes. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition. Release 5.0, May 2004) выделены и охарактеризованы 2 домена, 26 типов, 42 класса и большое количество семейств и родов бактерий.

В определителе Берги дано следующее определение бактерий (прокариот): «единичные клетки или простые скопления сходных клеток размером 0,2 × × 10,0 мкм, которые образуют своеобразные групповые структуры. Ядерный аппарат (нуклеоид, или генофор) никогда не отделен от цитоплазмы системой унитарных (элементарных) мембран. Клеточное деление не связано с циклическими изменениями строения клетки или изменением окрашиваемости ядерного аппарата или цитоплазмы; система микротрубочек (нитей веретена) не образуется. Цитоплазматическая мембрана обычно представляет собой топологический комплекс (элементарная мембрана) и образует ячеистые, ламеллярные (пластинчатые) или трубчатые впячивания в цитоплазму; вакуоли и репликативные цитоплазматические органеллы не связаны с системой плазматической мембраны, встречаются относительно редко (газовые вакуоли; хлоробиум-везикулы, т. е. пузырьки, окруженные однослойной мембраной и содержащие аппарат фотосинтеза у некоторых фотобактерий) и окружены неунитарными мембранами. Дыхательные и фотосинтетические функции связаны с системой плазматической мембраны у тех организмов, которые обладают этими физиологическими функциями, хотя у цианобактерий они могут быть и не связаны с плазматической и тилакоидными (тилакоиды – двойные ламеллы) мембранами. Рибосомы типа 70S, кроме одной группы бактерий – архебактерий, у которых они имеют более высокое значение S и распределены по цитоплазме; эндоплазматического ретикулума с прикрепленными рибосомами нет. Цитоплазма неподвижна, ее переливания, образования псевдоподий, эндо– и экзоцитоза не происходит. Питательные вещества потребляются в молекулярной форме. Клетки окружены ригидной стенкой, хотя она имеется не у всех бактерий (ее нет у микоплазм и некоторых архебактерий). Клетки могут быть неподвижными или могут обладать плавательной подвижностью, обеспечиваемой жгутиками бактериального типа, или скользящей подвижностью на плотной поверхности. Прокариоты – преимущественно одноклеточные организмы, однако образование нитевидных мицелиальных и колониальных форм также происходит. Они обладают механизмами переноса генов и рекомбинации, но эти процессы происходят без образования гамет (половых клеток) и зигот».

Основные признаки, по которым дифференцируют прокариот и эукариот, приведены в табл. 1.

Для обозначения видов бактерий используют бинарную номенклатуру, состоящую из названия рода (пишется с заглавной буквы) и вида (пишется всегда со строчной буквы и состоит из одного слова), например, Shigella flexneri (возбудитель дизентерии – род Shigella, вид flexneri). Когда название вида неоднократно повторяется, то первый раз название рода пишется полностью, а затем пишется только начальная буква его. Например, Shigella flexneri – S. flexneri. В связи со сложностью классификации бактерий названия внутривидовых форм (подвидов, серотипов и подсеротипов) часто используются как видовые, т. е. в качестве второго слова биномена – Salmonella enteritica (видовое), S. indica (подвидовое), S. typhimurium (серотип).

Таблица 1

Некоторые дифференциальные признаки прокариот и эукариот¹ (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology–9)

² Некоторые бактерии (например, определенные трепонемы, микоплазмы, Haemobartonella) могут иметь ширину меньше 0,1 мкм, а другие бактерии (например, Achromatium, Macromonas) – больше 10 мкм.

³ Газовые вакуоли не ограничиваются элементарной мембраной. Везикулы, составляющие вакуоль, могут подвергаться коллапсу при внезапном гидростатическом воздействии – свойство, существенное для их идентификации.

⁴ Некоторые внутриклеточные фибриллы, которые могут быть микротрубочками, были описаны у Spiroplasma, цианобактерий Anabaena, некоторых спирохет и у L-форм бактерий.

⁵ Эндоспоры бактерий обычно устойчивы при температуре 80 °C или выше в течение 10 мин. Однако некоторые эндоспоры могут погибать при такой температурной обработке и должны быть испытаны при более низкой температуре.

⁶ Кроме мембран большинства микоплазм.

⁷ Имеются у всех грамотрицательных эубактерий и у многих грамположительных.

⁸ Имеются в клеточной стенке всех эубактерий, кроме хламидий; отсутствуют у архебактерий.

⁹ У цианобактерий они не связаны с цитоплазматической и тилакоидными мембранами.

¹⁰ За редкими исключениями, например у некоторых фотобактерий.

¹¹ Кроме митохондрий, в которых встречается тип Mn.

¹² Кроме митохондрий и хлоропластов, которые имеют 70S рибосомы.

Вопрос о самозарождении и развитии жизни на Земле

Вопрос о самозарождении и развитии жизни на Земле был и остается одним из самых главных и самых трудных вопросов науки. Теперь уже ни у кого нет сомнения в том, что самозарождение жизни могло происходить лишь после того, как возникнут чисто химическим путем важнейшие органические соединения, необходимые для того, чтобы произошел синтез прежде всего первородных генов, т. е. генов, образующихся без участия белков, до их возникновения; первородных белков, т. е. белков, которые образуются без участия генов, и генетического кода, так как без него ген не может реализовать свою задачу. В самом деле, синтез генов у всех живых организмов происходит только при участии сложной системы биосинтеза ДНК, а синтез белков происходит только по программе, заключенной в структуре гена: порядок расположения кодонов в гене определяет порядок расположения аминокислот в белке. Вот почему и возник вопрос: что возникло раньше – ген или белок? Образно говоря, что возникло раньше – курица или яйцо?

Выдающийся русский ученый А. И. Опарин, который внес большой вклад в развитие так называемой коацерватной теории происхождения жизни, получившей в XX в. общее признание, назвал этот вопрос чисто схоластическим. Однако он ошибся. Изучение структуры гена и генетического кода не оставляет никаких сомнений в том, что генетической системе принадлежит важнейшая роль в самозарождении и эволюции жизни на Земле. Нет более никакого сомнения в том, что именно ген служит основным носителем и хранителем жизни на Земле, а белок – ее творцом, поэтому вопрос о том, как возникли первородные гены, первородные белки и генетический код, приобрел основное значение для выяснения механизма зарождения жизни. Следует при этом иметь в виду, что структуры, состоящие только из первородных генов и первородных белков, сами по себе еще не способны к самостоятельному размножению, как это хорошо демонстрируют простейшие живые организмы – плазмиды и вирусы. Для того чтобы процесс самозарождения жизни состоялся, необходимо было возникновение специализированных систем жизнеобеспечения. К ним относятся следующие системы:

1. Система биологического самовоспроизводства генов, т. е. система биосинтеза ДНК.

2. Сложная биологическая система синтеза белков, которая включает в себя целый комплекс различных компонентов (мРНК, тРНК, рибосомы и комплекс особых рабочих белков).

3. Система мобилизации энергии, необходимой для синтеза всех компонентов формирующейся первородной клетки.

4. Система мембран, с помощью которых формирующаяся клетка отграничивается от внешней среды, сохраняя способность осуществлять активную и пассивную связь с ней.

5. Система, обеспечивающая саморегуляцию выражения генетической информации.

6. Система саморегуляции клеточного деления, т. е. размножения клетки.

Только после формирования всех этих систем жизнеобеспечения и возникновения уникальной структурной единицы живой материи – клетки – завершается этот первый и важнейший этап самозарождения и самоутверждения жизни на Земле. Эти вопросы более подробно рассматриваются в главе 74. Последующие этапы эволюции включали в себя появление многоклеточных организмов и их дальнейшую эволюцию в направлении растительного и животного царств. Изучением генетических механизмов эволюции занимается специальная наука – эволюционная генетика, или геномика. Однако нельзя не обратить особое внимание на предлагаемую представителями геномики гипотезу, получившую название пульсации генома. Суть ее состоит в том, что изменение генома может идти не только в сторону нарастания количества генов, но и в сторону его уменьшения. Предполагается, что это определяется не чем иным, как полинуклеотидным выбором (Пн-выбором) ДНК-реципиента. Из этого следует, что предметом естественного отбора служит не фенотипический признак, кодируемый донорной ДНК, а новые последовательности ДНК, независимо от того, какие признаки они кодируют. С этих позиций геномики естественный отбор складывается из двух этапов: Пн-выбора и фенотипического дарвиновского отбора. Такой вывод полностью совпадает с утверждением о том, что ген служит главным носителем и хранителем жизни, ее главным архитектором, т. е. именно ген играет важнейшую роль в эволюции самой живой материи.

Формы бактерий

Всем бактериям присущи определенная форма и размеры, которые выражаются в микрометрах (мкм). Они варьируют в широких пределах – от 0,1 – 0,15 (Mycoplasma) до 10 – 15 мкм (Clostridium) в длине и от 0,1 мкм до 1,5 – 2,5 мкм в диаметре. Бо́льшая часть бактерий имеет размеры 0,5 – 0,8 мкм × 2 – 3 мкм.

Различают следующие основные формы бактерий: шаровидные (сферические), или кокковидные (греч. kokkos – зерно); палочковидные (цилиндрические); извитые (спиралевидные); нитевидные. Кроме того, существуют бактерии, имеющие треугольную, звездообразную, тарелкообразную форму (см. цв. вкл., рис. 1.1 – 1.8). Обнаружены так называемые квадратные бактерии, которые образуют скопления из 8 или 16 клеток в виде пласта (рис. 1.7).

Кокковидные патогенные бактерии обычно имеют форму правильного шара диаметром 1,0 – 1,5 мкм; некоторые – бобовидную, ланцетовидную, эллипсоидную форму. По характеру взаиморасположения образующихся после деления клеток кокки подразделяют на следующие группы:

1. Микрококки (греч. mikros – малый). Делятся в одной плоскости, располагаются одиночно и беспорядочно; сапрофиты; патогенных для человека нет (рис. 1.1).

2. Диплококки (греч. diplos – двойной). Деление происходит в одной плоскости с образованием пар клеток, имеющих либо бобовидную (Neisseria gonorrhoeae), либо ланцетовидную (Streptococcus pneumoniae) форму (рис. 1.2).

3. Стрептококки (греч. streptos – цепочка). Деление клеток происходит в одной плоскости, но размножающиеся клетки сохраняют между собой связь и образуют различной длины цепочки, напоминающие нити бус. Многие стрептококки являются патогенными для человека и вызывают различные заболевания: скарлатину, ангину, гнойные воспаления и др. (рис. 1.3).

4. Стафилококки (греч. staphyle – гроздь винограда). Деление происходит в нескольких плоскостях, а образующиеся клетки располагаются скоплениями, напоминающими гроздья винограда. Стафилококки вызывают более 100 различных заболеваний человека. Они наиболее частые возбудители гнойных воспалений (рис. 1.4).

5. Тетракокки (греч. tetra – четыре). Деление клеток происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях с образованием тетрад. Патогенные для человека виды встречаются очень редко (рис. 1.5).

6. Сарцины (лат. sarcina – связка, тюк). Деление клеток происходит в трех взаимно перпендикулярных плоскостях с образованием пакетов (тюков) из 8, 16, 32 и большего числа особей. Особенно часто встречаются в воздухе. Имеются условнопатогенные представители (рис. 1.6).

Палочковидные (цилиндрические) формы бактерий. Термин «бактерия» (греч. bakterion – палочка) применяется как для названия всего царства прокариот (Eubacteria, Archebacteria), так и для названия палочек, не образующих спор. Палочки, образующие споры, подразделяют на бациллы (лат. bacillus – палочка) – аэробные спорообразующие бактерии, например Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы, и клостридии (лат. clostridium – веретенообразный) – анаэробные спорообразующие бактерии, например Clostridium tetani – возбудитель столбняка. Палочки бывают длинными – более 3 мкм (Clostridium novyi – возбудитель газовой гангрены), короткими – 1,5 – 3,0 мкм (Escherichia coli и большинство возбудителей кишечных инфекций) и очень короткими – менее 1,0 мкм – в виде коккобактерий (Francisella tularensis – возбудитель туляремии, Brucella melitensis – бруцеллеза). Концы палочек могут быть закругленными (Escherichia coli и др.), заостренными (Fusobacterium), утолщенными (Corynebacterium), обрезанными (Bacillus anthracis);

палочка может иметь овоидную (яйцевидную) форму (Yersinia pestis – возбудитель чумы). По диаметру их делят на тонкие (Mycobacterium tuberculosis – возбудитель туберкулеза) и толстые (Clostridium perfringens – возбудитель газовой гангрены). По взаиморасположению бактерий их подразделяют на три группы (см. цв. вкл., рис. 2.1 – 2.6): 1) монобактерии – палочки располагаются одиночно и беспорядочно, сюда относится большинство палочковидных форм (рис. 2.1); 2) диплобактерии, располагающиеся попарно (Pseudomonas) (рис. 2.2); 3) стрептобактерии (Haemophilus ducreyi – возбудитель мягкого шанкра) или стрептобациллы (Bacillus anthracis) – бактерии, располагающиеся цепочкой (рис. 2.3 и 2.4).

Извитые (спиралевидные) бактерии по количеству и характеру завитков, а также по диаметру клеток подразделяют на две группы: 1) вибрионы (греч. vibrio – извиваюсь, изгибаюсь) имеют один изгиб, не превышающий четверти оборота спирали, однако могут иметь и форму прямой палочки, без изгиба (Vibrio cholerae – возбудитель холеры) (рис. 2.5); 2) спириллы (греч. speira – спираль) – клетки, имеющие большой диаметр и малое (2 – 3) число завитков (Spirillum minor – возбудитель содоку) (рис. 2.6). Особую группу спиралевидных бактерий представляют спирохеты, выделенные в порядок Spirochaetales. Их морфология подробно описана в гл. 69.

Нитевидные формы бактерий. Различают два типа нитевидных бактерий: образующие временные нити и постоянные.

Временные нити, иногда с ветвлениями, образуют палочковидные бактерии при нарушении условий их роста или регуляции клеточного деления (микобактерии, коринебактерии, а также риккетсии, микоплазмы, многие грамотрицательные и грамположительные бактерии). При восстановлении механизма регуляции деления и нормальных условий роста эти бактерии восстанавливают обычные для них размеры.

Рис. 2.7. Нитевидные бактерии.

Sphaerotilus natans, часть влагалища пустая

Постоянные нитевидные формы образуются из палочковидных клеток, соединяющихся в длинные цепочки либо с помощью слизи, либо чехлами (влагалищами, рис. 2.7), либо мостиками. Влагалищами, или футлярами, называют трубковидные чехлы гетерополисахаридной природы. Слизь может связывать отдельные клетки в длинные нити (Zoogloea) или пленки (Bacteriogloea). Нитевидные формы образуют серобактерии и железобактерии.

Следует особо отметить, что бактерии отличаются высоким полиморфизмом (индивидуальной изменчивостью формы, не передающейся по наследству), особенно при культивировании на искусственных питательных средах. Под действием различных факторов (антибиотиков, химических веществ) могут возникать необычные по форме и величине клетки, которые, однако, способны ревертировать в исходное состояние при снятии действия этих факторов.

Строение бактериальной клетки

Клетка – универсальная структурная единица живой материи. Подтверждением этому является сходство в химическом составе бактерии и клетки млекопитающего, которая в 2000 раз больше первой (табл. 2).

Таблица 2

Примерный химический состав типичной бактерии и типичной клетки

Организация бактериальной клетки позволяет ей координировать все процессы жизнедеятельности, за определенный срок удваивать свою биомассу и размножаться путем бинарного деления. В составе бактериальной клетки можно выделить различные структуры (рис. 3):

Рис. 3. Схема строения бактериальной клетки:

1 – клеточная стенка; 2 – цитоплазматическая мембрана; 3 – цитоплазма; 4 – нуклеоид; 5 – мезосома; 6 – периплазматическое пространство; 7 – включения; 8 – рибосома; 9 – капсула; 10 – микрокапсула; 11 – жгутик; 12 – плазмида; 13 – донорная ворсинка; 14 – фимбрии (реснички); 15 – перемычки в периплазматическом пространстве

Клеточная стенка

Клеточная стенка – структурный компонент, присущий только бактериям (кроме микоплазм). Клеточная стенка выполняет следующие функции:

1. Определяет и сохраняет постоянную форму клетки.

2. Защищает внутреннюю часть клетки от действия механических и осмотических сил внешней среды.

3. Участвует в регуляции роста и деления клеток.

4. Обеспечивает коммуникацию с внешней средой через каналы и поры.

5. Несет на себе специфические рецепторы для бактериофагов.

6. Определяет во многом антигенную характеристику бактерий (природу и специфичность О– и К-антигенов).

7. Содержащийся в ее составе пептидогликан наделяет клетку важными иммунобиологическими свойствами (см. ниже).

8. Нарушение синтеза клеточной стенки бактерий является главной причиной их L-трансформации.

Строение клеточной стенки. В ее составе имеется два слоя: наружный – пластичный и внутренний – ригидный. Основу клеточной стенки составляет пептидогликан, который ранее называли муреином (лат. mureus – стенка). Он имеется только у эубактерий (кроме микоплазм). Пептидогликан (см. цв. вкл., рис. 4) включает в себя остов и два набора пептидных цепочек – боковых и поперечных. Остов пептидогликана одинаков у всех бактерий и состоит из чередующихся молекул аминосахаров – N-ацетилглюкозамина (N-АцГлю) и N-ацетилмураминовой кислоты (N-АцМур), связанных между собой β-гликозидными связями (рис. 5). Боковые цепочки в каждой молекуле пептидогликана представлены набором идентичных тетрапептидов. Поперечные цепочки также представлены набором из идентичных для данной молекулы пептидогликана пентапептидов, содержащих глицин, – пентаглицинов, однако у разных видов бактерий боковые и поперечные пептиды различны. В тетрапептидной боковой цепочке у большинства грамотрицательных бактерий имеется диаминопимелиновая (диаминопимеловая) кислота (ДАП) – уникальный компонент клеточной стенки, обнаруженный только у прокариот. Кроме того, в составе боковых цепочек пептидогликана обнаружены D-аминокислоты (D-аланин, D-глутамин). Боковые тетрапептиды связаны с N-ацетилмураминовой кислотой остова. Связывание боковых тетрапептидов между собой происходит путем образования поперечных пентаглициновых мостиков между D-аланином одной цепи и диаминопимелиновой кислотой (или иной аминокислотой) другого бокового пептида. Наличие двух типов связей (гликозидные и пептидные), которые соединяют субъединицы пептидогликанов, придает этому гетерополимеру структуру молекулярной сети (см. цв. вкл., рис. 4). Благодаря этим связям пептидогликановый слой клеточной стенки образует огромного размера ригидную мешковидную макромолекулу, которая окружает протопласт, уравновешивает его тургорное давление (у E. coli – до 15 атм.) и придает ему определенную постоянную форму. Пептидогликан может разрушаться под действием различных ферментов, а его синтез блокируют бета-лактамные антибиотики.

Связь между N-ацетилмураминовой кислотой и N-ацетилглюкозамином разрушается лизоцимом, связь между N-ацетилмураминовой кислотой и боковым пептидом (его L-аланином) расщепляют амидазы, а связи межпептидные – эндопептидазы. Пентаглициновый мостик стафилококкового пептидогликана разрушается лизостафином. Образование поперечных сшивок между боковыми цепочками тетрапептидов блокируется пенициллинами (бета-лактамными антибиотиками). Это приводит к разрыхлению пептидогликановой сети, следствием чего является осмотический лизис растущих клеток. Пептидогликан, помимо того что он определяет постоянную форму бактерий, обладает следующими важнейшими иммунобиологическими свойствами.

Рис. 5. Химическая структура пептидогликана.

Стрелками указаны участки молекулы, атакуемые лизоцимом, а также муроэндопептидазой и пенициллином. Объяснение в тексте

1. В его составе обнаружены родоспецифические антигенные детерминанты. Они содержатся в гликановом остове и в тетрапептидах. В межпептидных мостиках имеются видоспецифические антигенные детерминанты.

2. Пептидогликан запускает классический и альтернативный пути активации системы комплемента.

3. Он тормозит фагоцитарную активность макрофагов, т. е. защищает бактерии, особенно грамположительные, от фагоцитоза.

4. Угнетает миграцию макрофагов.

5. Способен индуцировать развитие гиперчувствительности замедленного действия.

6. Обладает противоопухолевым действием.

7. Оказывает пирогенное действие на организм человека и животных.

Таким образом, клеточная стенка является чрезвычайно важной биологической структурой бактерий, определяющей многие их специфические свойства. Как отмечалось выше, все бактерии, в зависимости от их отношения к окраске по Граму, делятся на грамположительные и грамотрицательные. Суть окраски по Граму заключается в том, что вначале бактерии окрашивают кристаллическим или генциановым фиолетовым, а затем – раствором Люголя, после чего мазок обрабатывают спиртом и докрашивают водным фуксином. Грамотрицательные бактерии обесцвечиваются спиртом и поэтому окрашиваются в красный цвет, а грамположительные не обесцвечиваются и сохраняют фиолетовую окраску. Это свойство грамположительных бактерий зависит исключительно от особенностей химического состава и структуры их клеточных стенок, так как при разрушении клеточных стенок или утрате их (в случае L-трансформации) они становятся грамотрицательными.

Причину различного отношения бактерий к окраске по Граму объясняют тем, что после обработки раствором Люголя образуется не растворимый в спирте комплекс йода с генциановым фиолетовым, который у грамположительных бактерий в связи со слабой проницаемостью их стенки не может диффундировать из клетки, в то время как у грамотрицательных легко удаляется при промывании их этанолом, а затем водой.

Особенности клеточной стенки грамотрицательных бактерий

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий значительно тоньше, и у большинства из них ее толщина составляет 14 – 18 нм. Четко выделяются два слоя – пластичный и ригидный, они связаны лабильно и отделяются друг от друга при обработке додецилсульфатом натрия. Основная особенность клеточной стенки грамотрицательных бактерий: ригидный слой тонкий, представлен одним или, редко, двумя слоями пептидогликана, на долю которого приходится до 5 – 10 % сухого веса стенки. Для пептидогликана характерно низкое содержание поперечных сшивок между пептидными цепочками, однако в нем почти всегда имеется диаминопимелиновая кислота.

В составе клеточной стенки содержится много липопротеинов, фосфолипидов, липополисахарид, больше белка и, как правило, отсутствуют тейхоевые кислоты. Пластичный слой клеточной стенки у грамотрицательных бактерий представляет собой сложную мозаику, образованную из липопротеинов, липополисахаридов и наружной мембраны.

Липопротеины связывают наружную мембрану с пептидогликаном (белок связан с диаминопимелиновой кислотой бокового тетрапептида, а липид – нековалентно с наружной мембраной).

Липополисахарид (ЛПС) состоит из комплекса липида А и связанного с ним полисахарида, состоящего из ядра, которое одинаково у всех грамотрицательных бактерий, и терминальной цепочки из повторяющихся сахаров (рис. 6). Последние у разных видов бактерий различаются по химической природе. Они обычно представлены линейными трисахаридами или разветвляющимися тетра– или пентасахаридами. Терминальные повторяющиеся единицы полисахарида ЛПС располагаются на поверхности клетки в виде микроворсинок и определяют ее антигенную специфичность. ЛПС синтезируется на цитоплазматической мембране, а затем транспортируется в наружную часть клетки, он прикреплен к наружной мембране с помощью гидрофобных связей. ЛПС выполняет две важнейшие функции у грамотрицательных бактерий: во-первых, он определяет их антигенную специфичность, а во-вторых, является одним из главных факторов их патогенности. ЛПС – это эндотоксин. Его токсичность определяется липидом А. Кроме того, ЛПС в организме запускает синтез около 20 различных биологически активных соединений, которые опосредуют патогенез эндотоксикоза, и обладает пирогенным действием.

Наружная мембрана, подобно любой биологической мембране, состоит из двух слоев липидов, но в ней значительная часть фосфолипидов наружного слоя замещена молекулами липополисахаридов и набором белков, локализованных мозаично (рис. 7). В состав этих белков, заключенных в фосфолипидную матрицу, входят 3 или 4 основных (major), которые составляют около 70 % суммарных белков наружной мембраны; липопротеины и второстепенные белки, числом более 10. Два из основных белков проходят через оба слоя мембраны и прочно связаны с пептидогликаном. Эти белки-порины располагаются в виде триплетов и образуют диффузионные поры, через которые в клетку проникают мелкие гидрофильные молекулы. Второстепенные белки выполняют разнообразные специфические функции: одни из них участвуют в облегченной диффузии, другие – в активном транспорте молекул через наружную мембрану и выступают в качестве специфических рецепторов для фагов и колицинов. Некоторые из этих белков участвуют в конъюгации (являются рецепторами для донорных ворсинок), в контроле репликации ДНК и регуляции клеточного деления. Наружная мембрана осуществляет также функцию барьера, через который в клетку не способны проникать крупные молекулы (один из механизмов неспецифической устойчивости грамотрицательных бактерий к антибиотикам). Если бактерии поместить в гипертонический раствор, наступает резкое обезвоживание клеток, цитоплазма съеживается, и протопласт отходит от клеточной стенки. Это явление называется плазмолизом. В результате плазмолиза клетки гибнут. Этим свойством широко пользуются для консервирования пищевых продуктов с помощью концентрированных растворов поваренной соли или сахара. Однако плазмолиз проявляется не в одинаковой степени у разных видов бактерий. К нему особенно устойчивы Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, которые являются частыми виновниками пищевых отравлений. В случае помещения бактерий в дистиллированную воду или гипотонические растворы солей происходит противоположное явление – плазмоптиз: вода устремляется в клетки, происходит их набухание и разрушение.

Рис. 6. Структура липополисахарида грамотрицательных бактерий:

1 – повторяющиеся единицы; 2 – ядро; 3 – полимер дисахарид-фосфата; 4 – жирные кислоты; 5 – липид

Рис. 7. Схематическое изображение структур наружной мембраны (1), пептидогликана (2) и плазматической мембраны (3) E. coli

При обработке грамположительных бактерий ферментами, разрушающими пептидогликан, возникают протопласты, т. е. структуры, полностью лишенные клеточной стенки. Обработка грамотрицательных бактерий лизоцимом разрушает только слой пептидогликана клеточной стенки, но наружная мембрана (или, по крайней мере, часть ее) сохраняется. Такие структуры получили название сферопластов. Протопласты и сферопласты имеют сферическую форму и в соответствующих осмотических условиях сохраняют жизнеспособность. Особенно чувствительны к изменению осмотического давления протопласты. При определенных условиях они способны к размножению подобно L-формам бактерий. Нарушение синтеза клеточной стенки лежит в основе L-трансформации бактерий.

L-трансформация бактерий

Впервые эта форма изменчивости бактерий была описана в 1935 г. Е. Клинебергер. Она обнаружила и выделила из культуры Streptobacillus moniliformis необычные варианты, которые росли в виде маленьких характерных колоний с врастающей в агар центральной и фестончатой полупрозрачной периферической зонами. В этих колониях обнаруживались самые разнообразные по морфологии структуры: нитевидные, волокнистые, колбасовидные, шаровидные образования и мелкие гранулы размером 0,1 – 0,15 мкм (фильтрующиеся формы бактерий). Поскольку этот феномен был обнаружен в институте имени Листера, то таким необычным вариантам бактерий дали название L-форм, а такую изменчивость бактерий назвали L-трансформацией. Она может быть обратимой и необратимой. В случае если генетический контроль синтеза клеточной стенки сохраняется, L-формы при благоприятных условиях могут возвращаться в исходную бактериальную форму с восстановлением всех основных биологических свойств, включая патогенность. Если же генетический контроль синтеза клеточной стенки нарушен необратимо, L-трансформация приобретает необратимый характер, а такие L-трансформанты по своим морфологическим, культуральным и иным свойствам становятся неотличимыми от микоплазм. L-трансформации могут подвергаться, по-видимому, все бактерии, имеющие клеточную стенку, а все образующиеся L-формы, независимо от вида бактерий, из которого они возникли, обладают следующими общими для них особенностями:

1. Сходство морфологических изменений: образование нитевидных, волокнистых, колбасовидных, шаровидных и гранулярных форм.

2. Сходные культуральные свойства: анаэробные или микроаэрофильные условия роста, потребность в холестерине и сывороточном белке, рост на плотных средах в виде характерных колоний двух типов – А и В (рис. 8). Колонии типа А растут на поверхности агара, имеют очень мелкие размеры. Они состоят главным образом из гранулярных структур, лишенных клеточной стенки, и очень похожи на микоплазмы. Колонии типа В состоят из центральной зоны, врастающей в агар, и прозрачной фестончатой периферической зоны. Они похожи по внешнему виду на колонии типа «глазуньи», образуемые микоплазмами, но более крупные и грубые. В этих колониях обнаруживаются крупные тела, содержащие компоненты клеточной стенки, сходные со стенкой родительских бактерий, но лишенные ригидности. Многие бактерии образуют колонии А и В типов, однако грамположительные бактерии (Streptococcus, Staphylococcus) чаще образуют колонии только типа А. L-формы бактерий из колоний типа В легко ревертируют в исходные формы. Колонии типа А более стабильны и ревертируют в исходные формы значительно реже.

3. Постепенное (по мере нарушения синтеза клеточной стенки) превращение из грамположительных в грамотрицательные структуры.

4. Образование стабильных и нестабильных L-форм (в зависимости от степени полноты утраты способности синтезировать клеточную стенку).

5. Изменение антигенных свойств (утрата К– и О-антигенов как следствие нарушения синтеза клеточной стенки).

Рис. 8. L-формы бактерий:

1 – колонии L-форм типа 3А и 3В; 2 – пузыревидные, грушевидные и субмикроскопические элементы L-форм дифтерийной палочки

6. Снижение вирулентности по сравнению с исходными родительскими формами в связи с утратой различных факторов патогенности (адгезии, инвазии, эндотоксина и т. п.).

7. Способность длительно персистировать (переживать) в организме. Утрата клеточной стенки делает L-формы нечувствительными к различным химиопрепаратам и антителам.

8. Способность при неполной утрате синтеза клеточной стенки возвращаться в исходную бактериальную форму.

L-трансформация происходит как in vitro, так и in vivo (в организме человека и животных). Факторами, индуцирующими ее, являются различные антибиотики, угнетающие биосинтез клеточной стенки (пенициллин, цефалоспорины, циклосерин, ванкомицин и т. п.); ферменты (лизоцим, амидаза, эндопептидаза); антимикробные антитела; высокие концентрации некоторых аминокислот, особенно глицина и фенилаланина.

Исключительное значение L-трансформации патогенных бактерий заключается в том, что она является частой причиной перехода острых форм заболеваний в хронические и их обострений. L-трансформацию надо рассматривать не просто как одно из проявлений изменчивости бактерий, а как своеобразную, присущую всем бактериям форму приспособления к неблагоприятным условиям существования (подобно спорообразованию), которая способствует сохранению вида бактерий в природе. Клеточная стенка и ее синтез чувствительны к действию антител и различных химиопрепаратов. Освобождение от нее не лишает бактерии жизнеспособности, но позволяет переживать действие этих неблагоприятных для них факторов, а по их устранении – возвращаться в свое исходное состояние.

Принимая во внимание особую роль клеточной стенки в жизни бактерий, ей можно дать такое определение. Клеточная стенка – сложный структурный элемент, встречающийся только у эубактерий (кроме микоплазм) и характеризующийся наличием в его составе уникального химического соединения – пептидогликана, наделяющего клетку важными иммунобиологическими свойствами и определяющего ее постоянную форму; нарушение его синтеза приводит к превращению бактерий в L-формы, с помощью которых и обеспечивается, главным образом, длительное персистирование возбудителя в организме – одна из основных причин перехода заболевания из острой в хроническую форму. Соответственно L-трансформация, как и спорообразование, является важнейшей формой приспособления бактерий к неблагоприятным условиям существования.

Цитоплазматическая мембрана бактерий

Цитоплазматическая мембрана (ЦМ) является исключительно полифункциональной структурой.

1. ЦМ воспринимает всю химическую информацию, поступающую в клетку из внешней среды.

2. Она является основным осмотическим барьером, благодаря которому внутри клетки поддерживается определенное осмотическое давление.

3. ЦМ совместно с клеточной стенкой участвует в регуляции роста и клеточного деления бактерий.

4. ЦМ участвует в регуляции процессов репликации и сегрегации хромосом и плазмид (они связаны с ее рецепторами).

5. В ЦМ содержится значительное количество ферментов, в том числе системы переноса электронов (ЦМ – место генерации энергии у бактерий).

6. С ЦМ связаны жгутики и аппарат регуляции их движения.

7. ЦМ участвует в процессах транспорта (в том числе активного) питательных веществ в клетку и продуктов жизнедеятельности, включая ферменты и экзотоксины, из клетки в окружающую среду. В ней содержатся белки, участвующие в облегченной диффузии и активном транспорте.

8. ЦМ участвует в синтезе компонентов клеточной стенки и образовании мезосом (мезосомы возникают в результате инвагинации участка ЦМ в цитоплазму, они открыты в периплазматическое пространство).

9. ЦМ играет важную роль в компартментализации (англ. compartment – отсек, отделение), т. е. в разделении на «отсеки» рибосом и их стабилизации.

Каким образом мембрана осуществляет на молекулярном уровне свои многочисленные функции – один из актуальнейших вопросов современной биологии. На долю ЦМ приходится около 10 % сухого веса бактерий. Она содержит 25 – 40 % фосфолипидов, образующих два слоя, 20 – 75 % белков и до 6 % углеводов. Молекулы фосфолипидов асимметричны: головки, несущие электрический заряд, гидрофильны; хвостики – нейтральны и гидрофобны. Фосфолипиды упакованы в мембране следующим образом: их полярные гидрофильные головки обращены наружу и образуют два слоя ЦМ – внутренний и внешний, а неполярные гидрофобные хвостики скрыты в толще мембраны. На электронограммах ЦМ имеет вид трехслойной структуры, состоящей из двух параллельных темных слоев и разделяющего их светлого слоя. Этот слой более проницаем для электронов, чем слои, состоящие из полярных концов фосфолипидов, ассоциированных с белками. Специфичность функций ЦМ во многом зависит от набора содержащихся в них белков. Расположение их в ЦМ своеобразно (рис. 9): некоторые белки пронизывают весь двойной липидный слой, определенная часть белков связана или только с внутренней, или только с наружной поверхностью мембраны. Это вытекает из того, что взаимодействие между мембраной и цитоплазмой, с одной стороны, мембраной и внешней средой – с другой, определяет различные, хотя и взаимосвязанные, процессы ее жизнеобеспечения: облегченная диффузия, активный транспорт, перенос электронов, мобилизация энергии и т. п. Молекулы белков и других соединений, входящих в состав ЦМ, обладают значительной свободой перемещения.

Рис. 9. Схематическая модель элементарной биологической мембраны

Структура, состоящая из клеточной стенки и ЦМ, получила название оболочки клетки.

Цитоплазма

Цитоплазма бактерий представляет собой сложную коллоидную систему, в ней нет эндоплазматического ретикулума и других цитоплазматических органелл, свойственных эукариотам; она неподвижна. Правда, в цитоплазме Mycobacterium, Streptococcus, Clostridium, Proteus обнаружены микротрубочки – рапидосомы, сходные с микротрубочками простейших. У некоторых прокариот имеются три типа органелл, окруженных белковыми мембранами: газовые пузырьки (у водных прокариот, например, пурпурных и серных бактерий, галобактерий и др.), хлоробиум-везикулы (в них у фотосинтезирующих бактерий размещается аппарат фотосинтеза) и карбоксисомы (в них содержится большая часть основного фермента процесса фиксации CO₂ – карбоксидисмутазы). В цитоплазме располагается ядерный аппарат – генофор (нуклеоплазма), который не отделен от нее никакими мембранами. Кроме хромосомы (хромосом), в цитоплазме многих бактерий, в том числе патогенных, имеются плазмиды, иногда целый их комплекс. Как хромосома, так и плазмиды связаны со специфическими рецепторами на ЦМ. В цитоплазме располагаются бактериальные рибосомы 70S и все остальные компоненты белоксинтезирующей системы. Помимо этих основных структурных элементов, являющихся главными атрибутами живой клетки, в цитоплазме содержатся различные макромолекулы (тРНК, аминокислоты, нуклеотиды и т. п.); могут быть мезосомы, которые участвуют в энергетическом обмене, формировании межклеточной перегородки при делении, спорообразовании и, возможно, обладают другими функциями. Нередко в цитоплазме бактерий обнаруживаются различные включения, которые образуются в процессе жизнедеятельности: капельки нейтральных липидов; воска, серы, гранулезы (специфическое запасное углеводное вещество, накапливающееся у бактерий рода Clostridium); гранулы гликогена; волютина (метаполифосфата), особенно у Spirillum volutans и Corynebacterium diphtheriae – возбудителя дифтерии; поли-β-гидроксимасляной кислоты – ПОМ (особенно у рода Bacillus). Гранулеза, гликоген, ПОМ, зерна волютина служат для бактерий запасным источником энергии. У некоторых бактерий (Bacillus thuringiensis) в цитоплазме находятся кристаллы белковой природы, обладающие ядовитым действием для насекомых. У разных биологических групп бактерий могут быть и другие внутрицитоплазматические включения метаболического происхождения.

Периплазматическое пространство

Между ЦМ и внутренним слоем пептидогликана находится периплазматическое пространство, ширина его у грамположительных бактерий составляет около 10 нм. При электронной микроскопии обнаружено, что у грамположительных и, вероятно, у грамотрицательных бактерий между внутренней поверхностью пептидогликана и наружной поверхностью ЦМ имеются регулярно повторяющиеся перемычки. Поры, содержащиеся в клеточной стенке, открываются в периплазматическое пространство. В него всегда открыты и мезосомы. Периплазматическое пространство играет существенную роль во взаимодействии ЦМ и клеточной стенки, в нем содержатся различные ферменты, по преимуществу фосфатазы, связывающие белки, олигосахариды и другие вещества.

Капсулы

У бактерий различают микрокапсулу, капсулу и слизистый слой. Микрокапсула выявляется при электронной микроскопии в виде коротких мукополисахаридных фибрилл. Ее роль и значение не совсем ясны. Капсула представляет собой слизистый слой, который обычно сохраняет связь с клеточной стенкой. Капсула служит внешним покровом бактерий, толщина ее более 0,2 мкм, она четко обнаруживается под микроскопом после негативного окрашивания, например по способу Бурри – Гинса (см. цв. вкл., рис. 10). Капсулы, в связи с их гелеобразной консистенцией, плохо удерживают красители, поэтому для их обнаружения наиболее приемлем метод негативного контрастирования. Макромолекулы капсулы сильно гидратированы, расположены рыхло и не препятствуют поступлению веществ в клетку и выходу продуктов ее метаболизма наружу. В образовании капсулы принимает участие ЦМ. По химическому составу различают капсулы, состоящие из полисахаридов, не содержащих азота; полисахаридов, содержащих азот (аминосахара); капсулы полипептидной природы (табл. 3). Капсулу полипептидной природы образуют несколько видов Bacillus, она у них состоит из D-глутаминовой кислоты, и Y. pestis.

Таблица 3

Химический состав капсул некоторых бактерий

Некоторые виды патогенных бактерий (S. pneumoniae, B. anthracis, C. perfringens и др.) образуют капсулы лишь в организме человека или животного, другие – как в организме, так и на искусственных питательных (иногда специальных) средах (S. aureus, S. pyogenes, Klebsiella pneumoniae, K. rhinoscleromatis и др.). У патогенных бактерий капсула может окружать одну (Y. pestis), две (S. pneumoniae) или целую цепочку (B. anthracis, K. pneumoniae) клеток. Некоторые сапрофитные бактерии (Leuconostoc mesenteroides, Zoogloea) образуют зооглеи – скопления клеток, заключенные в одну общую капсулу. Хотя капсулы не являются для бактерий жизненно необходимыми, они наделяют их многими важными свойствами. Совместно с клеточной стенкой и ЦМ они образуют более мощную оболочку бактерий, предохраняют их от высыхания, несут для них запасные питательные вещества. Капсульные антигены патогенных бактерий определяют их антигенную специфичность и иммуногенные свойства. Например, наиболее эффективные вакцины против менингококковых и пневмококковых заболеваний готовят из капсульных полисахаридов возбудителей. У многих бактерий капсулы являются важными факторами патогенности: они либо маскируют их от фагоцитов, либо подавляют фагоцитоз. Утрата способности синтезировать капсулу у пневмококков, например, сопровождается полной утратой патогенности.

Слизистые слои. Нередко слизистые экзополимеры выделяются бактериальной клеткой в значительно большем количестве, частично отделяются от нее и образуют рыхлый слизистый слой.

Жгутики

По механизму движения бактерии подразделяют на плавающие и скользящие, или ползающие. Последние активно передвигаются по плотной поверхности благодаря волнообразным сокращениям тела (некоторые виды Mycoplasma, Myxococcus и др.). У плавающих бактерий органом движения являются жгутики, которые представляют собой тонкие длинные нитевидные белковые образования диаметром 12 – 30 нм и длиной от 6 – 9 до 80 мкм. Белок, из которого построены жгутики, получил название флагеллина. Он отличается от других белков, содержащихся в бактериальной клетке. Флагеллин обладает сократительной способностью, хотя механизм ее не совсем понятен.

Жгутик состоит из однотипных спиралевидно или продольно уложенных вокруг полой сердцевины белковых субъединиц, образующих цилиндрическую структуру, которая особым образом прикреплена к бактериальной клетке. По характеру расположения жгутиков и их количеству подвижные бактерии условно делят на четыре группы (рис. 11):

1) монотрихи – один полярно расположенный жгутик (Vibrio cholerae);

2) лофотрихи – пучок жгутиков на одном конце (Pseudomonas methanica);

3) амфитрихи – пучки жгутиков на обоих концах клетки (Spirillum volutans);

4) перитрихи – множество жгутиков, расположенных вокруг клетки (E. coli, Salmonella typhi).

Жгутик состоит из трех компонентов – спиральной жгутиковой нити постоянной толщины, крючка и базального тельца (рис. 12). Крючок, к которому присоединена жгутиковая нить, имеет длину 30 – 45 нм и состоит из отличающегося от флагеллина белка. Он соединен с базальным тельцем, которое располагается целиком в оболочке (в клеточной стенке и ЦМ).

Рис. 11. Расположение жгутиков у бактерий:

1 – монотрихи; 2 – лофотрихи; 3, 4 – амфитрихи; 5 – перитрихи

Рис. 12. Схематическая модель бактериального жгутика

Базальное тельце состоит из центрального стержня, заключенного в систему особых колец. У грамотрицательных бактерий их две пары: внешняя (кольца L и P) и внутренняя (кольца S и М). Кольца L и P расположены внутри клеточной стенки (кольцо L – в ЛПС, а кольцо P – в слое пептидогликана). Они выполняют, очевидно, роль втулки для стержня. Внутренняя пара (кольца S и M) фиксирована на ЦМ, причем кольцо S располагается в периплазматическом пространстве, а кольцо М – на ЦМ или в ней.

Жгутики у грамположительных бактерий, имеющих более толстую и гомогенную клеточную стенку, содержат только одну пару колец – S и M. Вращение жгутиков в клеточной стенке происходит из-за вращательного движения колец S и M относительно друг друга и обеспечивается за счет энергии трансмембранного градиента ионов водорода или натрия. Благодаря такому вращению происходит движение бактерий в наиболее благоприятном для них направлении. Жгутиковый аппарат обладает особым бинарным переключателем, который позволяет менять направление вращения жгутиков против часовой стрелки на противоположное. Таким способом бактерии, получив химический сигнал из окружающей среды, изменяют направление движения и выбирают оптимальные условия обитания. По всей вероятности, базальное тельце (его внутреннее кольцо М) непосредственно связано с какими-то дополнительными жгутиковыми белками, которые необходимы для сборки жгутиков и управления переключением направления их вращения и которые расположены либо в ЦМ, либо сразу под ней. Со жгутиковым аппаратом связана также и хемотаксическая активность таких бактерий. Генетический контроль синтеза жгутиковых белков, их сборки и активности осуществляется особым опероном. Установлено, что мутации в области mot-генов (англ. motility – подвижность) приводят к потере только подвижности, однако все структуры жгутиков сохраняются; мутации в cheгенах (англ. chemotaxis – хемо + подвижность) – к потере хемотаксической активности при сохранении структуры жгутиков и их подвижности. Подвижность бактерий определяют либо микроскопически (с помощью фазово-контрастной или обычной световой микроскопии «раздавленной» или «висячей» капли соответственно), либо бактериологически (при посеве уколом в столбик полужидкого агара: подвижные бактерии дают диффузный рост, а неподвижные – растут только по ходу укола). Жгутики хорошо выявляются при электронной микроскопии (рис. 13). Жгутиковые бактерии могут двигаться с большой скоростью, например Bacillus megaterium движется со скоростью 27 мкм/с, а Vibrio cholerae – 200 мкм/с.

Донорные ворсинки. У бактерий, являющихся носителями конъюгативных плазмид (F-плазмид, R-плазмид и др.), имеются длинные (0,5 – 10 мкм) нитевидные структуры белковой природы, получившие название донорных ворсинок, или донорных пилей (англ. pile – волосок). Как и жгутики, они имеют внутреннюю полость и построены из особого белка. Их синтез находится под контролем плазмидных генов. Они служат аппаратом конъюгации – с их помощью устанавливается непосредственный контакт между донорной и реципиентной клетками. Донорные пили обнаруживают с помощью донорспецифических фагов, которые на них адсорбируются и далее вызывают лизис клетки-хозяина. Донорные пили встречаются в количестве 1 – 2 на клетку.

Фимбрии, или реснички. Фимбрии (англ. fimbria – бахрома) – короткие нити, в большом количестве (до многих тысяч) окружающие бактериальную клетку (рис. 14). Подобно жгутикам и донорным ворсинкам, они прикреплены к клеточной стенке, но значительно короче и тоньше – их длина 0,1 – 12,0 мкм, диаметр 25 нм. Белок фимбрий отличается от белков жгутиков и донорных ворсинок. Биологическое значение фимбрий, по-видимому, состоит в том, что с их помощью бактерии прикрепляются к определенным поверхностям. Для многих патогенных бактерий фимбрии являются важными факторами патогенности, так как с их помощью бактерии прикрепляются к чувствительным клеткам и заселяют их, т. е. фимбрии служат для бактерий факторами адгезии и колонизации.

Рис. 13. Жгутики бактерий (электронограмма Proteus vulgaris)

Рис. 14. Реснички (фимбрии) бактерий (электронограмма Bordetella parapertussis)

Эндоспоры и спорообразование

Некоторые роды бактерий (Bacillus, Clostridium, Sporosarcina) при неблагоприятных для их существования условиях образуют защитные формы – эндоспоры. Споры представляют собой своеобразные покоящиеся клетки; у них чрезвычайно низкая метаболическая активность, но они обладают высокой устойчивостью к высушиванию, действию повышенной температуры и различных химических веществ. Высокую резистентность спор к действию указанных факторов связывают с присутствием в оболочке большого количества кальциевой соли дипиколиновой кислоты. Споры сильно преломляют свет, поэтому они хорошо заметны в неокрашенных препаратах. Для обнаружения спор предложены различные интенсивные способы окрашивания, поскольку они слабо воспринимают красители. Диаметр споры может не превышать диаметра вегетативной клетки (Bacillus) или превышает его. В последнем случае бактериальная клетка со спорой принимает форму веретена (Clostridium). Споры в клетке (рис. 15) могут располагаться центрально (B. megaterium), субтерминально (С. botulinum), терминально (C. tetani).

В процессе спорообразования (споруляции) бактериальная клетка подвергается сложной перестройке (рис. 16). Вначале на одном из ее полюсов происходит конденсация нуклеоида и отделение его за счет образования септы. Затем ЦМ начинает обрастать образовавшийся протопласт споры и возникает складка, состоящая из двух слоев ЦМ, позднее они сливаются, в результате образовавшаяся предспора оказывается окруженной двойной оболочкой. На следующей стадии между двумя мембранами, покрывающими предспору, формируется толстый слой кортекса (коры). Самый внутренний слой его представляет собой зародышевую стенку (из него образуется клеточная стенка прорастающей вегетативной клетки). По мере созревания споры обе ее мембраны участвуют в образовании специальных слоев споры. Таким образом между обращенными друг к другу мембранами образуются зародышевая стенка, кортекс, а также расположенные снаружи от мембран наружная и внутренняя оболочки и экзоспорий. Сформировавшаяся эндоспора состоит из протопласта с нуклеоидом, стенки споры, кортекса, оболочки и экзоспория.

Рис. 15. Расположение спор у бактерий:

1 – центральное (Bacillus megaterium); 2 – субтерминальное (Clostridium botulinum); 3 – терминальное (Clostridium tetani)

Протопласт споры (ядро) содержит ЦМ, цитоплазму, хромосому, все компоненты белоксинтезирующей системы и анаэробной энергообразующей системы.

Стенка споры непосредственно окружает внутреннюю мембрану ее и представлена пептидогликаном, из которого формируется клеточная стенка прорастающей клетки.

Кортекс – самый толстый слой оболочки споры. Он состоит из пептидогликана, содержащего мало поперечных сшивок и поэтому очень чувствительного к лизоциму. Разрушение кортекса лизоцимом играет пусковую роль в процессе прорастания споры.

Оболочка споры построена из кератиноподобного белка. Плохая проницаемость ее определяет высокую устойчивость спор к действию различных химических веществ.

Рис. 16. Схема образования споры (по Г. Шлегелю):

А, Б – образование септы; В, Г – окружение протопласта споры мембраной материнской клетки; Д – формирование кортекса и оболочек споры; Е – схема строения зрелой споры: 1 – экзоспориум; 2 – наружная оболочка споры; 3 – внутренняя оболочка споры; 4 – кортекс; 5 – клеточная стенка споры; 6 – ЦМ споры; 7 – цитоплазма с нуклеоидом

Экзоспорий – липопротеиновая оболочка, содержащая немного углеводов.

После завершения спорообразования вегетативная часть клетки отмирает, спора высвобождается и длительное время сохраняется в окружающей среде, до тех пор, пока не возникнут условия, благоприятные для ее прорастания.

Некультивируемые формы бактерий

У многих видов грамотрицательных бактерий, в том числе у патогенных (шигеллы, сальмонеллы, холерный вибрион и др.) существует особое приспособительное, генетически регулируемое состояние, физиологически эквивалентное цистам, в которое они могут переходить под влиянием неблагоприятных условий и сохранять жизнеспособность до нескольких лет. Главная особенность этого состояния заключается в том, что такие бактерии не размножаются и поэтому не образуют колоний на плотной питательной среде. Такие не размножающиеся, но жизнеспособные клетки получили название некультивируемых форм бактерий (НФБ). Клетки НФБ, находящиеся в некультивируемом состоянии (НС), обладают активными метаболическими системами, в том числе системами переноса электронов, биосинтеза белка и нуклеиновых кислот, и сохраняют вирулентность. Их клеточная мембрана более вязкая, клетки обычно приобретают форму кокков, имеют значительно уменьшенные размеры. НФБ обладают более высокой устойчивостью во внешней среде и поэтому могут переживать в ней длительное время (например, холерный вибрион в грязном водоеме), поддерживая эндемическое состояние данного региона (водоема). Для обнаружения НФБ используют молекулярно-генетические методы (ДНК – ДНК-гибридизация, ЦПР), а также более простой метод прямого подсчета жизнеспособных клеток. С этой целью к исследуемому материалу добавляют в небольшом количестве питательные вещества (дрожжевой экстракт) и налидиксовую кислоту (для подавления синтеза ДНК) на несколько часов. Клетки усваивают питательные вещества и увеличиваются в размерах, но не делятся, поэтому такие увеличенные клетки четко видны в микроскоп и их легко подсчитать. Для этих целей можно использовать также методы цитохимические (образование формазана) или микроауторадиографии. Генетические механизмы, обусловливающие переход бактерий в НС и их реверсию из него, не ясны.

Жизнь любого организма сводится к тому, чтобы в соответствии с имеющимся у него объемом генома полностью воспроизвести самого себя и реализовать свои функции, т. е. обусловить индивидуальное развитие (жизнь) и произвести потомство. Это оказывается возможным потому, что в основе жизни каждого организма лежит непрерывное взаимодействие трех потоков информации: одного – из внешней среды и еще двух потоков генетической информации: по горизонтали, он обеспечивает индивидуальное развитие организма и реализацию его жизненных функций, и другого – по вертикали, который обеспечивает передачу потомству всех признаков родителей, т. е. наследственную непрерывность вида и самой жизни. Из этого вытекает следующее положение, которое, по-видимому, имеет общебиологическую закономерность – поведение всех живых существ, как в интересах их индивидуального развития, так и ради сохранения вида, должно быть всегда адекватным имеющейся у них генетической информации и информации, воспринимаемой из внешней среды. Отступление от этого закона может привести к гибели организма и вида. Единство организма с внешней средой заключается не только в том, что он получает из среды необходимые для себя источники энергии, питания, а также другую информацию, но и в том, что, в свою очередь, он также воздействует на среду, изменяет ее и этим постоянно меняет условия своего существования. Поэтому взаимосвязь организма с внешней средой должна быть постоянной и взаимовыгодной.

Чем больше объем генома, тем сложнее устроен организм, тем разнообразнее его собственная генетическая информация и та информация, которую он может воспринимать из окружающей среды и перерабатывать. Тем разнообразнее, сложнее и богаче проявляется его индивидуальная жизнь.

Бактерии воспринимают информацию из внешней среды в виде механических, физических и, главным образом, химических сигналов, поступающих через клеточную мембрану. Химическими сигналами для бактерий служат различные источники энергии, аминокислоты, основания, другие сложные химические вещества, ионы, вода, от которых зависит общая интенсивность всех биосинтетических процессов в клетке.

Механизмы питания бактерий

Большинство бактерий живет в среде, мало подходящей для того, чтобы поддерживать строгое соотношение воды, солей и органических веществ, без которого невозможна жизнь. Это обусловливает необходимость постоянного и тщательного регулирования обмена различными веществами, который происходит между клеткой и внешней средой и контролируется клеточной мембраной. Она проницаема для многих веществ, поток их идет в обоих направлениях (из клетки и в клетку), но структура мембраны такова, что она обладает избирательной и неравномерной проницаемостью, определяющей механизмы питания бактерий.

Питательные вещества из внешней среды поступают в бактериальную клетку с помощью трех основных механизмов: пассивной диффузии, облегченной диффузии и активного транспорта (рис. 17).

Пассивная диффузия осуществляется за счет различного содержания питательных веществ в среде и в клетке и происходит в направлении от большей концентрации к меньшей, т. е. по градиенту концентрации. Когда концентрация вещества по ту и другую сторону мембраны уравнивается, пассивная диффузия прекращается. Ее скорость зависит от величины градиента, но она имеет определенный предел. Таким путем в клетку проникает (и покидает ее) вода вместе с растворенными в ней различными мелкими молекулами, способными проходить через мелкие поры мембраны. Для пассивной диффузии характерно отсутствие субстратной специфичности, и она не требует затраты энергии.

Облегченная диффузия характеризуется выраженной субстратной специфичностью и протекает при обязательном участии специфических белков, локализованных в мембране; синтез некоторых из них индуцируется соответствующими субстратами. Эти белки, получившие название пермеаз (англ. permeate – проникать, проходить сквозь), обладают субстратной специфичностью. Они распознают и связывают молекулу субстрата на внешней стороне мембраны и обеспечивают каким-то образом ее перенос через мембрану. На внутренней поверхности мембраны комплекс пермеаза – субстрат диссоциирует, освободившаяся молекула субстрата включается в общий метаболизм клетки, а пермеаза повторяет очередной цикл переноса своего субстрата, который не способен проникать через мембрану путем простой диффузии. Главное свойство пермеаз – способность проходить через мембрану как с присоединенной молекулой субстрата, так и без нее. Однако облегченная диффузия происходит только по градиенту концентрации, но не против него, поэтому она не требует затраты энергии. Пермеазы, присоединившись к субстрату, повышают его способность проникать через мембрану. Облегченная диффузия протекает со значительно более высокой скоростью, чем пассивная. Ее скорость подчиняется закону Михаэлиса – Ментен, и при достижении равновесия концентрация субстрата, доставляемого посредством облегченной диффузии, на внутренней и внешней поверхностях мембраны становится одинаковой.

Рис. 17. Бактериальные транспортные системы (Р. Стейнер [и др.]. Мир микробов. 1979, т. 2):

Разная длина стрелок указывает на сдвиг равновесия реакции в сторону более длинной стрелки. S и s означают соответственно высокую и низкую концентрации растворенных веществ; © – белок-переносчик (пермеаза); R – белок HРr; R-ф – фосфо-HРr; ф – фосфатная группа

Активный транспорт. С помощью механизмов активного транспорта растворенные вещества могут поступать в клетку против градиента концентрации, поэтому активный транспорт требует от клетки затраты энергии. У бактерий этот механизм питания является преобладающим. С его помощью они обеспечивают такие концентрации растворенных питательных веществ внутри клетки, которые могут во много раз превышать их концентрации во внешней среде и обеспечивают им высокие скорости метаболизма даже при низкой концентрации химических веществ в окружающей среде. У многих бактерий, в особенности грамотрицательных, в активном транспорте принимают участие особые связывающие белки, не идентичные пермеазам и не входящие в структуру мембраны, а локализованные в периплазматическом пространстве. У связывающих белков отсутствует каталитическая активность, но они обладают очень высоким сродством к определенным питательным веществам – к различным аминокислотам, сахарам, неорганическим ионам. Выделено и изучено более 100 различных связывающих белков, которые образуют прочные комплексы со своими субстратами и необходимы для их активного переноса через мембрану. Связывающие белки функционируют только в комплексе со специфическими пермеазами, осуществляющими активный перенос субстрата через мембрану. Метаболическая энергия, необходимая для этого, используется для снижения сродства пермеазы к своему субстрату на внутренней поверхности мембраны по сравнению с ее сродством к нему на внешней стороне мембраны. В результате этих превращений происходит изменение скорости выхода субстрата наружу, она становится во много раз меньше скорости его поступления в клетку. При этом механизме активного транспорта через мембрану в клетку поступают против градиента концентрации химически не измененные питательные вещества. У бактерий, вместе с тем, существуют и такие транспортные системы, которые переводят питательные вещества в химически измененную форму, не способную проникать через мембрану. К их числу относится фосфотрансферазная система, широко распространенная среди бактерий. С помощью этой системы транспортируются многие сахара и их производные, в процессе переноса они фосфорилируются и поступают в клетку в виде сахарофосфатов. Поскольку мембрана для последних непроницаема, сахарофосфаты остаются внутри клетки.

Фосфотрансферазная система состоит из двух неспецифических компонентов: ферментов I и HPr и набора субстрат-специфических белков, связанных с мембраной и обозначенных как ферменты II. Фермент I обеспечивает перенос богатой энергией фосфатной группы от фосфоенолпирувата на гистидиновый остаток фермента HPr, который превращается в фосфо-HPr. Последний является общим донором фосфорильной группы для всех субстратов, переносимых фосфотрансферазной системой. Фосфорилирование же их осуществляется субстрат-специфическими белками из группы ферментов II, которые выполняют также и функции пермеаз. У мутантных бактерий, лишенных фермента I или белка HPr, ферменты II осуществляют облегченную диффузию своих субстратов.

Транспортные системы в жизни клетки выполняют две основные функции:

1) поддерживают на высоком уровне внутриклеточные концентрации всех субстратов, необходимых для осуществления важнейших биохимических реакций с максимальными скоростями даже при низких концентрациях этих химических веществ во внешней среде;

2) регулируют внутриклеточное осмотическое давление, поддерживают оптимальную для метаболической активности концентрацию растворенных веществ (небольших молекул и ионов).

Секреция продуктов жизнедеятельности бактериальной клеткой

Бактерии синтезируют и секретируют во внешнюю среду различные продукты своей жизнедеятельности, в том числе белки, главным образом ферменты и токсины, с помощью которых они оптимизируют свое существование. Например, благодаря секреции ферментов они расщепляют сложные органические соединения и делают их более доступными для питания. Для патогенных бактерий секреция ферментов и токсинов служит мощным средством, благодаря которому они только и могут обеспечивать свое существование и размножение в организме животного и подавлять его защитные механизмы. Секреция белков бактериями осуществляется с помощью различных систем и механизмов. При этом следует различать секрецию белков в периплазматическое пространство через ЦМ и секрецию белков непосредственно в культуральную среду (экскрецию, или экспорт белков). У грамотрицательных бактерий большинство белков секретируется в периплазматическое пространство в виде белков-предшественников, содержащих в своей структуре особый сигнальный (лидерный) пептид из 15 – 40 аминокислотных остатков. Именно он обеспечивает перенос белка-предшественника через ЦМ, после чего и отрезается от него с помощью сигнальной (лидерной) пептидазы.

Существует несколько моделей, объясняющих механизм, посредством которого лидерный пептид обеспечивает секрецию белка-предшественника через ЦМ в периплазматическое пространство.

Модель прямого транспорта предполагает прямое вхождение лидерного пептида в липидный бислой мембраны с использованием свободной энергии мембраноассоциированных рибосом.

Сигнальная гипотеза предполагает, что в результате взаимодействия лидерного пептида непосредственно с особым рецептором мембраны образуется внутримембранный канал, через который и осуществляется секреция.

Существуют и другие, более сложные, модели механизма переноса секретируемого белка через ЦМ. Возможно, что применительно к разным белкам и у разных групп бактерий действуют различные механизмы. Детальнее всего механизмы секреции изучены у E. coli. У нее обнаружены два пути секреции: sec-зависимый и относительно sec-независимый. Для обеспечения секреции белков в случае sec-зависимого механизма требуется участие продуктов ряда sec-генов: secA, secY, secB, secD, secE и secF. Источниками энергии для переноса белков служат гидролиз АТФ и градиент концентрации протонов. Для осуществления посттранслокационного процессинга (англ. processing – обработка) белка после его перемещения (транслокации) достаточно, вероятно, активности только сигнальных пептидаз. У E. coli их обнаружено две: сигнальная пептидаза I (м. м. 36 кД, кодируется геном lepB) и сигнальная пептидаза II (м. м. 18 кД, кодируется геном lepA).

Большой интерес представляет так называемая система секреции 3-го типа (ССТ3). Она осуществляет секрецию эффекторных белков из цитоплазмы клетки через ЦМ и наружную мембрану непосредственно в клетки растения и животного, с которыми бактерия контактирует. ССТ3 обнаружена у бактерий родов Shigella, Salmonella, Yersinia и других и играет у них роль одного из факторов патогенности. Непосредственно в культуральную среду грамотрицательные бактерии экскретируют только некоторые белки, при этом в каждом случае используются различные механизмы, которые также еще недостаточно изучены. Например, бактериоцины, кодируемые различными плазмидами, не содержат в своей структуре сигнальных пептидов. Для их секреции через ЦМ и наружную мембрану требуется специальный вспомогательный белок – рилизинг-белок. Система транспорта гемолизина HlyA, кодируемого генами Hly-плазмиды, состоит как минимум из двух вспомогательных белков HlyB и HlyD, которые образуют канал для непосредственного выхода гемолизина (важного фактора патогенности E. coli) из цитоплазмы во внешнюю среду.

Способы питания

Углеродное питание

К числу важнейших химических элементов-органогенов, необходимых для синтеза органических соединений, относят: углерод, азот, водород и кислород. Свою потребность в водороде и кислороде бактерии удовлетворяют за счет воды. Сложнее обстоит дело с углеродным и азотным питанием. По способу углеродного питания бактерии делят на аутотрофы и гетеротрофы.

Аутотрофы (греч. autos – сам, trophe – питание) – организмы, которые полностью удовлетворяют свои потребности в углероде за счет CO₂.

Гетеротрофы (греч. heteros – другой, trophe – питание, т. е. «питаемые другими») – организмы, которые не могут удовлетворить свои потребности в углероде только за счет CO₂, а требуют для питания готовых органических соединений. В свою очередь, гетеротрофов подразделяют на сапрофитов (греч. sapros – гнилой, phyton – растение), т. е. гетеротрофов, источником питания которых служат мертвые органические субстраты; и паразитов (греч. para – при, sitos – пища), т. е. гетеротрофов, живущих за счет живых тканей животных и растений. Для превращения CO₂ в органические соединения требуется энергия: чтобы восстановить CO₂ в один моль гексозы требуется около 112 ккал. Существует два источника этой энергии – фотосинтез и хемосинтез.

ФОТОСИНТЕЗ

Фотосинтез – это синтез за счет энергии солнечного света: свободная энергия фотона красного света (680 нм) ΔG = 41 ккал/моль, голубого (400 нм) – ΔG = = 65 ккал/моль. В результате фотосинтеза растительность земного шара ежегодно синтезирует более 100 млрд тонн органических веществ. На это используется около 200 млрд тонн CO₂, и в атмосферу выделяется около 145 млрд тонн свободного O₂. Общее количество солнечной энергии, используемой ежегодно для фотосинтеза, составляет не менее 3 ⋅ 10²¹ Дж.

У растений мобилизация солнечной энергии и превращение ее в энергию химических связей, главным образом в виде АТФ, осуществляется с помощью хлоропластов, содержащих хлорофилл (греч. chloros – зеленый, phyllon – лист) – зеленый пигмент, связанный с белками и липидами их мембран. Основу молекулы хлорофилла составляет магниевый комплекс порфиринового цикла, близкий к другим комплексам порфирина (с железом) – цитохромам, гему и т. п. Поглощая энергию фотона солнечного света, электрон в молекуле хлорофилла возбуждается и переходит с основного энергетического уровня на более высокий, а затем он стремится вновь возвратиться на свой основной, стабильный энергетический уровень, отдавая при этом поглощенную энергию. Если такое возвращение происходит в чистом препарате хлорофилла, поглощенная энергия испускается в виде света. Однако в клетке хлорофилл связан со специфическими молекулами, и поэтому возбужденный электрон отрывается от молекулы хлорофилла и транспортируется этими молекулами – переносчиками электронов. Они передают его по замкнутой цепи реакции вне молекулы хлорофилла. Возбужденный электрон постепенно отдает свою энергию, которая и используется для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфора, а далее электрон возвращается на свое прежнее место в молекуле хлорофилла, способной после этого поглощать другой фотон. В ходе переноса возбужденного электрона по крайней мере два из его переносчиков способны мобилизовать часть переносимой им энергии для синтеза АТФ (рис. 18). В процессе фотосинтеза происходит не только связывание солнечной энергии, но и синтез углеводов, в частности глюкозы, путем восстановления CO₂, т. е. добавления к ней электронов и водорода. Источником электронов служит хлорофилл, а источником протонов – вода.

Рис. 18. Процесс циклического фосфорилирования, посредством которого в молекуле хлорофилла электрон, перенесенный на более высокий энергетический уровень благодаря поглощению фотона света, обеспечивает энергию, необходимую для образования АТФ (по А. Ленингеру)

Реакция фотосинтеза осуществляется в две фазы. В первой (световые реакции) – под действием фотонов электрон хлорофилла переходит в возбужденное состояние;

затем, возвращаясь в свое обычное энергетическое состояние, он освобождает энергию, которая используется для синтеза таких молекул, как АТФ и НАДФН₂. Во второй фазе (темновые реакции) АТФ и НАДФН₂ используются для восстановления CO₂ в глюкозу.

Суммарная реакция фотосинтеза такова:

Таким образом, молекула глюкозы, которая представляет собой конечный продукт фотосинтеза (наряду с кислородом), содержит большое количество солнечной энергии (около 690 ккал на 1 моль), заключенной в ее молекулярной структуре. Гетеротрофные организмы извлекают эту энергию путем последовательного расщепления молекулы глюкозы для того, чтобы «законсервировать» содержащуюся энергию в форме вновь образующихся молекул АТФ – универсальных хранителей и носителей энергии, необходимой для жизни всех клеток.

К фотосинтезирующим бактериям – фототрофам – относятся цианобактерии (сине-зеленые водоросли), пурпурные и зеленые бактерии, а также некоторые архебактерии.

Цианобактерии – различные многоклеточные нитчатые и одноклеточные организмы, среди них есть подвижные формы, которые передвигаются с помощью скольжения. У цианобактерий, как и у растений, фотосинтез осуществляется с помощью хлорофилла и сопровождается выделением свободного кислорода.

Архебактерии (экстремальные галофилы) осуществляют особую форму фотосинтеза. У них вместо хлорофилла в фотосинтезе участвует особый пигмент – бактериородопсин (комплекс каротиноида ретиналя с белком), который под влиянием света претерпевает фотохимические превращения, непосредственно сопряженные с синтезом АТФ.

Пурпурные и зеленые бактерии содержат различные по составу хлорофиллы (бактериохлорофиллы a, b, c, d и e) и каротиноиды. Большинство зеленых бактерий – мелкие, неподвижные грамотрицательные палочки. Пурпурные бактерии представлены грамотрицательными палочками, кокками или спириллами и часто имеют жгутики. У пурпурных бактерий хлорофилл замаскирован пурпурно-красным или коричневым пигментом, а фотосинтезирующий аппарат заключен в клеточную мембрану, у зеленых – в клеточную мембрану или в специальные органеллы – хлоробиум-везикулы, локализованные в цитоплазме или мембране. В отличие от растений, водорослей и цианобактерий при фотосинтезе пурпурные и зеленые бактерии не выделяют O₂, так как для восстановления CO₂ они используют в качестве доноров электронов не водород H₂O, а водород H₂S. При этом пурпурные бактерии окисляют H₂S до H₂SO₄:

а зеленые серобактерии – до S₂:

Некоторые пурпурные и зеленые бактерии в качестве донора электронов используют серу и другие ее неорганические соединения (тиосульфат, сульфит). Все они являются обитателями водоемов, где имеются наиболее благоприятные для них сочетания анаэробных условий, света и источников питания.

ХЕМОСИНТЕЗ

Русским ученым С. Н. Виноградским в 1880 – 1890 гг. было обнаружено, что некоторые грамотрицательные бактерии используют для своего роста энергию хемосинтеза, т. е. энергию, получаемую за счет окисления неорганических соединений. Такие организмы получили название хемоавтотрофов. Им было установлено, что хемоавтотрофы характеризуются двумя важнейшими особенностями:

1. Обладают высокой специфичностью в отношении неорганического источника энергии.

2. Очень часто они не только не способны использовать в качестве источников углерода и энергии органические вещества, но последние даже могут угнетать их рост.

К хемоавтотрофам относятся открытые С. Н. Виноградским нитрифицирующие бактерии, представленные двумя группами. Представители одной из них (роды Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus, Nitrosoglobus) окисляют NH₃ до азотистой кислоты:

Представители другой (роды Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus) окисляют азотистую кислоту до азотной:

Выделяемая при хемосинтезе энергия используется нитрифицирующими бактериями для ассимиляции CO₂ и восстановления ее до глюкозы или других углеводов. Наиболее многочисленную и разнообразную группу хемосинтезирующих бактерий составляют водородные бактерии, осуществляющие реакцию:

где (CH₂O)_n – условное обозначение синтезируемого углевода.

Но эти бактерии являются факультативными хемоавтотрофами, так как способны расти на средах, содержащих органические вещества. Некоторые строго анаэробные метанообразующие бактерии осуществляют хемосинтез по реакции:

К хемоавтотрофам, как показал С. Н. Виноградский, относятся нитчатые скользящие бактерии Beggiatoa, Thiothrix и другие аэробы, способные окислять сероводород и тиосульфат до серы и сульфата. Внутри таких клеток часто обнаруживается сера.

К числу хемоавтотрофов относятся и некоторые виды железобактерий, в частности рода Gallionella, которые в качестве минерального источника восстановленного железа используют осадок сульфида железа.

У всех хемоавтотрофов ассимиляция CO₂ происходит с помощью реакции, катализируемой рибулозодифосфаткарбоксилазой (реакция Кальвина):

Первичным продуктом фиксации CO₂ является 3-фосфоглицериновая кислота, из которой синтезируются все остальные органические молекулы клетки.

Для осуществления ассимиляции CO₂ хемоавтотрофы путем окислительной диссимиляции неорганического субстрата получают АТФ и восстановитель (восстановленный пиридиннуклеотид). Нитрифицирующие бактерии и многие тиобациллы имеют особые характерные для прокариот образования – карбоксисомы, содержащие рибулозодифосфаткарбоксилазу.

В зависимости от того, какими донорами электронов пользуются бактерии, их разделяют на литотрофы (используют неорганические доноры электронов H₂, NH₃, H₂S, Fe и др.) и органотрофы (в качестве доноров электронов используют органические соединения).

Таким образом, по способу углеродного питания все организмы можно подразделить на три основные группы:

1. Фотолитотрофы (источник энергии – солнечный свет, доноры электронов – неорганические соединения).

2. Хемолитотрофы (источник энергии – окислительно-восстановительные реакции, доноры электронов – неорганические соединения).

3. Хемоорганотрофы (источник энергии – окислительно-восстановительные реакции, доноры электронов – органические соединения). Большинство патогенных бактерий относится к хемоорганотрофам.

Азотное питание

По способу азотного питания бактерии подразделяют на аминоавтотрофов и аминогетеротрофов. Аминоавтотрофы способны полностью удовлетворять свои потребности в азоте, необходимом для синтеза главным образом белков и нуклеиновых кислот, с помощью атмосферного или минерального азота. Аминогетеротрофы нуждаются для своего питания в готовых органических азотистых соединениях: некоторых аминокислотах, основаниях, витаминах и др.

Рис. 19. Рисунок Мальпиги (XVII в.), изображающий корни бобового растения с корневыми клубеньками (1) и оболочкой семени (2), из которого развилось данное растение

К числу аминоавтотрофов относятся азотфиксирующие бактерии, свободно живущие в почве, и так называемые клубеньковые азотфиксирующие бактерии. Первый представитель азотфиксирующих бактерий – Clostridium pasteurianum (анаэроб) – был открыт в 1893 г. С. Н. Виноградским. В 1901 г. М. Бейеринк установил, что способностью усваивать атмосферный азот обладают также аэробные бактерии Azotobacter, занимающие по азотфиксирующей активности первое место (до 25 г азота на 1 кг использованного сахара), но менее распространенные в почве, чем C. pasteurianum. Азотфиксирующими свойствами обладают некоторые виды Pseudomonas, Bacillus, цианобактерий, а также пурпурные и зеленые серобактерии. Азотфиксирующие бактерии рода

Rhizobium получили название клубеньковых потому, что они, размножаясь на корнях ряда бобовых растений, образуют выросты-клубеньки (рис. 19). Размножаясь в них, они превращаются из мелких палочек в разветвленные формы – бактероиды, которые наиболее интенсивно связывают молекулярный азот. Симбиоз клубеньковых бактерий с растениями взаимовыгоден, так как Rhizobium продуцируют ряд физиологически активных соединений, которые благоприятно влияют на бобовые растения. После разрушения клубеньков клубеньковые бактерии живут в почве как сапрофиты.

Азотфиксирующие бактерии восстанавливают азот (N₂) до NH₃ с помощью сложной ферментной системы нитрогеназы, содержащей железо, молибден, магний. Эта система нуждается в источнике электронов, которые поступают через восстановитель с низким потенциалом, содержащий негеминовое железо – ферредоксин (переносчик электронов).

Цепь переноса электронов состоит из ферредоксина (Фд), азоферредоксина (АзоФд) и молибдоферредоксина (МоФд), и за один раз переносятся только два электрона. Для последнего переноса расходуется 1 молекула АТФ.

Поскольку для восстановления N₂ до NH₃ требуется шесть электронов, реакция, очевидно, протекает через три последовательные двухэлектронные стадии:

Подробное выяснение механизма генетического контроля азотфиксирующих систем бактерий может создать необходимые предпосылки для искусственного переноса оперонов этих систем в геном растений и конструирования трансгенных растительных организмов, обладающих азотфиксирующей активностью, что имело бы огромное значение для сельского хозяйства.

Вторая большая группа аминоавтотрофов представлена нитрифицирующими бактериями, которые используют для синтеза белков в качестве основных источников азота соли аммиака, азотистой и азотной кислот. Подсчитано, что на образование вновь вырастающих растений ежегодно требуется около 1,5 млрд тонн азота в форме, доступной растениям. Поэтому нельзя не отметить, что азотфиксирующим и нитрифицирующим бактериям принадлежит исключительно важная роль в обеспечении плодородия почвы (см. раздел «Роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе», гл. 15).

Аминогетеротрофы для роста и размножения нуждаются в различных органических азотистых соединениях. Необходимо оговориться, что аминогетеротрофы представляют собой также неоднородную группу, так как многие из них нуждаются для роста лишь в определенных аминокислотах, как, например, Francisella tularensis. Для ее роста требуется добавление к среде по крайней мере 10 аминокислот. В то же время многие бактерии, синтезируя аминокислоты и основания из минеральных источников азота, нуждаются в тех витаминах (ростовых факторах), которые сами не способны синтезировать: биотин (Н), тиамин (В₁), рибофлавин (В₂), пантотеновая кислота (В₃), холин (В₄), никотинамид (В₅), фолиевая кислота (В₉) и ее производные (В₁₁) и т. п. Наконец, есть патогенные бактерии, например группа гемоглобинофильных организмов (Haemophilus), которые для роста нуждаются в добавлении к питательной среде сложных веществ, содержащихся в крови: Х-факторов (гемин) и др. Кроме того, в результате различных мутаций аминогетеротрофные бактерии могут превращаться в мутанты, неспособные синтезировать тот или иной метаболит и поэтому нуждающиеся в нем. Такие мутанты получили название ауксотрофов (лат. auxilium – помощь и греч. trophe – питание). Они во многом способствовали изучению особенностей биохимии бактерий.

Для нормальной жизнедеятельности бактерии, как и другие организмы, обязательно нуждаются в ионах Na⁺, K⁺, Cl^-, Ca²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, Cu²⁺, а также в фосфоре и сере, которые поступают в клетку путем диффузии и активного транспорта.

Все процессы обмена веществ представляют собой цепь взаимосвязанных во времени и пространстве саморегулируемых реакций. Каждая из них и их совокупные пути катализируются соответствующими ферментами.

Ферменты

Ферменты (греч. fermentum – закваска), или энзимы, – специфические белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках. Их нет у плазмид, у некоторых вирусов. Ферменты снижают энергию активации, которая необходима для осуществления той или иной химической реакции. Они направляют ее обходным путем через промежуточные реакции, требующие значительно меньшей энергии активации. Под влиянием ферментов происходит перераспределение электронных плотностей и некоторая деформация молекул субстрата, наступающая при образовании промежуточного фермент-субстратного комплекса. Эта деформация приводит к ослаблению внутримолекулярных связей и, следовательно, к понижению необходимой энергии активации, в результате чего скорость реакции возрастает. Открытию различных ферментов и изучению путей биохимических реакций, катализируемых ими, во многом способствовали работы с использованием в качестве объектов исследования бактерий, особенно ауксотрофов. У бактерий обнаружены все шесть классов ферментов:

1) оксидоредуктазы (катализируют окислительно-восстановительные реакции);

2) трансферазы (катализируют реакции переноса групп атомов);

3) гидролазы (катализируют гидролитическое расщепление различных соединений);

4) лиазы (катализируют реакции отщепления от субстрата той или иной химической группы негидролитическими путями с образованием двойной связи или, наоборот, присоединение химической группы к двойным связям);

5) изомеразы (катализируют внутримолекулярные превращения);

6) лигазы, или синтетазы (катализируют соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата).

Изучение ферментов, обнаруживаемых у бактерий, представляет большой интерес для микробиологической промышленности. Изучение особенностей обмена веществ патогенных бактерий необходимо прежде всего для понимания механизмов, с помощью которых они реализуют свою патогенность, т. е. для выяснения сущности патогенеза инфекционных заболеваний. Изучение биохимических свойств бактерий широко используется как для их систематики и классификации, так и для идентификации, т. е. для диагностики.

У бактерий обнаружены уникальные генетические механизмы контроля биосинтеза ферментов, они проявляются в виде феноменов индукции и репрессии. Индукция заключается в том, что синтез ферментов наступает только в присутствии специфических химических веществ, которые являются субстратом для данного фермента или аналогом этого субстрата. Например, синтез ферментов, участвующих в потреблении лактозы у E. coli, начинается (индуцируется) и происходит только при наличии в среде лактозы. Как только она исчезает, синтез этих ферментов прекращается.

Под эффектом репрессии понимают явление, при котором синтез фермента подавляется (репрессируется) под влиянием специфических химических соединений, почти всегда являющихся непосредственными продуктами (или аналогами продуктов) реакции, катализируемой этим ферментом. Например, синтез ферментов, участвующих в образовании метионина у E. coli, прекращается, как только в среде накапливается избыток этой аминокислоты. Нетрудно видеть, насколько совершенен такой механизм саморегуляции биохимических процессов.

В соответствии с этими особенностями генетического контроля, у бактерий различают три основные группы ферментов: конститутивные, синтез которых происходит в течение всего клеточного цикла; индуцибельные, синтез которых индуцируется соответствующим субстратом; и репрессибельные, синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом (ферментами).

Метаболизм

Биохимические процессы, протекающие в клетке, объединены одним словом – метаболизм (греч. metabole – превращение). Этот термин равнозначен понятию «обмен веществ и энергии». Различают две стороны метаболизма: анаболизм и катаболизм.

Анаболизм – совокупность биохимических реакций, осуществляющих синтез компонентов клетки, т. е. та сторона обмена веществ, которую называют конструктивным обменом.

Катаболизм – совокупность реакций, обеспечивающих клетку энергией, необходимой, в частности, и для реакций конструктивного обмена. Поэтому катаболизм определяют еще как энергетический обмен клетки.

В конструктивном обмене можно выделить две группы биосинтетических процессов: биосинтез мономеров (аминокислот, нуклеотидов, моносахаров, жирных кислот) и биосинтез полимеров (белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов). Для их синтеза необходимо около 70 различных мономеров-предшественников. Помимо них, клетка должна синтезировать ряд соединений, играющих каталитическую роль. Синтез любого мономера происходит (при наличии источников углерода и энергии) через цепь последовательных биохимических реакций, катализируемых специфическими белками-ферментами. В свою очередь синтез всех биополимеров также требует участия специфических белков. Поэтому основу основ конструктивного обмена составляет биосинтез белков, который находится под контролем генетической системы организма.

Состав белоксинтезирующей системы

Синтез белка осуществляется с помощью сложной белоксинтезирующей системы. В ее состав входят следующие компоненты.

1. Рибосомные субъединицы 30S и 50S, которые у прокариот и в митохондриях и хлоропластах эукариот образуют рибосому 70S; или субъединицы 40S и 60S, образующие у эукариот рибосому 80S.

2. Матричная РНК (мРНК).

3. Полный комплект двадцати аминоацил-тРНК, для образования которых необходимы соответствующие аминокислоты, аминоацил-тРНК-синтетазы, тРНК и АТФ. Аминоацил-тРНК (аа-тРНК) – это заряженная энергией и связанная с тРНК аминокислота, готовая для подвоза к рибосоме и включения в синтезирующийся на ней полипептид.

4. Белковые факторы инициации (у прокариот – IF-1, IF-2, IF-3).

5. Белковые факторы элонгации (у прокариот – EF-Tu, EF-Ts, EF-G).

6. Белковые факторы терминации (у прокариот – RF-1, RF-2, RF-3).

7. Некоторые другие белковые факторы (ассоциации, диссоциации субъединиц, высвобождения и пр.).

8. Гуанозинтрифосфат (ГТФ).

9. Неорганические катионы: двухвалентные – Mg²⁺ или Ca²⁺ – и одновалентные – K⁺ или HN₄⁺ – в определенной концентрации.

Основным компонентом белоксинтезирующей системы является рибосома. Она объединяет все компоненты в единый комплекс. Рибосомы – «святая святых» клетки, так как именно на них совершается самое удивительное таинство живой материи – биологический синтез белка. Информация, содержащаяся в геноме, расшифровывается и материализуется в виде белков на рибосомах. Без них проявление жизнедеятельности невозможно.

Вирусы и плазмиды потому и являются облигатными внутриклеточными паразитами, что у них отсутствуют собственные рибосомы, и для реализации генетической информации (т. е. для проявления своей жизнедеятельности) они используют рибосомный аппарат клетки-хозяина.

Универсальности генетического кода соответствует универсальность механизма его расшифровки и реализации.

В природе существует только два класса рибосом – 70S и 80S. Они имеют сходную молекулярную структуру и механизм функционирования, хотя и различаются по размерам, составу и специфичности белков и белковых факторов. Схематический состав рибосом 70S и 80S показан на рис. 20.

Далее весь процесс биосинтеза белка будет рассматриваться на примере работы рибосом 70S.

Белковые факторы инициации (англ. initiation factors – IF) получили свое название потому, что они участвуют в организации активного комплекса (70S-комплекса) из субъединиц 30S и 50S, мРНК и инициаторной аминоацил-тРНК (у прокариот – формилметионил-тРНК), который «запускает» (инициирует) работу рибосом – трансляцию мРНК.

Белковые факторы элонгации (англ. elongation factors – EF) участвуют в удлинении (элонгации) синтезируемой полипептидной цепи (пептидила).

Белковые факторы терминации, или освобождения (англ. – release factors – RF) обеспечивают кодон-специфическое отделение полипептида от рибосомы и окончание синтеза белка.

Рис. 20. Схематическое изображение структур прокариотических и эукариотических рибосом

Для осуществления трансляции необходимо участие ГТФ. Потребность белоксинтезирующей системы в ГТФ очень специфична: он не может быть заменен ни одним из других трифосфатов.

На биосинтез белка клетка затрачивает энергии больше, чем на синтез любого другого биополимера. Образование каждой новой пептидной связи требует расщепления четырех высокоэнергетических связей (АТФ и ГТФ): двух для того, чтобы нагрузить аминокислотой молекулу тРНК, и еще двух в ходе элонгации – одну при связывании аа-тРНК и другую при транслокации.

Рибосома выполняет следующие функции, необходимые для биосинтеза белка.

1. Функция динамического связывания и удержания всех компонентов белоксинтезирующей системы, благодаря чему создаются условия для встречи и взаимопрочитывания двух основных потоков информации, один из которых запрограммирован в мРНК, а другой – в антикодонах аа-тРНК; одновременно формируется биологическая машина, синтезирующая белок в строгом соответствии с последовательностью поступления в рибосому этой информации.

2. Каталитические функции, в частности образование пептидных связей между аминокислотами в синтезируемом полипептиде и гидролиз ГТФ.

3. Функция механического перемещения (транслокации): транслокация растущего пептида, связанного с тРНК, с одного участка рибосомы на другой и продвижение рибосомы вдоль мРНК. Выполнение этих функций обеспечивается наличием на рибосоме особых активных участков. Таких участков три (см. рис. 25). С одним из них связывается мРНК. Два других разных участка предназначены для связывания молекулы тРНК. В одном из них, получившем название пептидил-тРНК-связывающего участка, или Р-участка, прикрепляется тРНК, присоединенная к растущему концу полипептидной цепи – донорная тРНК. В другом – аминоацил-тРНК-связывающем участке, или А-участке, – связывается только что поступившая молекула тРНК, нагруженная аминокислотой – акцепторная тРНК. В обоих участках молекулы тРНК прочно прикрепляются лишь в том случае, если их антикодоны комплементарны кодонам мРНК и с ними спариваются. А– и Р-участки располагаются очень близко друг от друга, и поэтому связанные с ними молекулы тРНК связываются с двумя соседними кодонами в молекуле мРНК. Благодаря такому близкому расположению донорной тРНК, несущей пептидил, и акцепторной тРНК, несущей активированную аминокислоту, облегчается образование пептидных связей в синтезируемой полипептидной цепи. В процессе элонгации карбоксильный конец растущего пептидила отделяется в Р-участке от молекулы донорной тРНК и образует пептидную связь с аминокислотой, присоединенной к молекуле акцепторной аа-тРНК. Эта реакция катализируется не белковым ферментом, а особым фрагментом РНК большой субъединицы рибосомы (50S), который назвали рибозимом (по аналогии с «энзимом»).

где (X)n – аминоацильные звенья пептидил-тРНК, R – радикалы.

Основные этапы биосинтеза белка

Процесс синтеза белка складывается из двух основных этапов: транскрипции и трансляции.

Первичная структура каждого белка (т. е. последовательность расположения в нем аминокислот), от которой зависит его специфичность, запрограммирована в соответствующем гене в виде последовательности расположения в нем кодонов. Перенос этой информации о структуре белка к рибосомам происходит с помощью мРНК. Процесс синтеза мРНК на генах и получил название транскрипции, или переписывания информации с ДНК-гена на мРНК-ген. Транскрипция осуществляется с помощью ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Этот фермент представляет собой сложный белковый комплекс с м. м. около 480 кД. У бактерий он состоит по крайней мере из пяти белковых субъединиц: две α, β, β' и σ. Комплекс субъединиц α₂, β, β' (core-энзим), хотя и обладает каталитической активностью, однако не может правильно выбирать точку начала транскрипции. Присоединение к этому комплексу σ-субъединицы превращает его в полноценный фермент РНК-полимеразу (холоэнзим). Сигма-субъединица РНК-полимеразы выполняет две основные функции: вопервых, она завершает формирование полноценной РНК-полимеразы, во-вторых, она наделяет ее способностью распознавать промотор на ДНК, с которого начинается транскрипция. Сигма-фактор освобождается от комплекса холоэнзим-ДНК немедленно после начала синтеза мРНК и может повторно использоваться для образования холоэнзима. Транскрипция является сложным многоступенчатым процессом, который включает в себя следующие основные стадии.

1. Инициация транскрипции, во время которой:

а) core-энзим взаимодействует с σ-фактором, образуя холоэнзим РНК-полимеразы;

б) РНК-полимераза связывается с промотором на ДНК и образует транскрипционный комплекс (ДНК-холоэнзим);

в) начинается синтез мРНК и высвобождается σ-фактор.

2. Собственно транскрипция (элонгация, или удлинение цепи мРНК).

3. Терминация транскрипции, сопровождающаяся диссоциацией транскрипционного комплекса и высвобождением core-энзима.

Процесс транскрипции у эукариот протекает сложнее. У них нет сигма-фактора. Работе РНК-полимеразы у эукариот помогают пять белковых комплексов.

Американский ученый Роджер Корнберг (Roger D. Kornberg) с помощью тонкого рентгеноструктурного анализа установил трехмерную организацию (конформацию) РНК-полимеразы II – сложнейшего комплекса, который состоит из многих белков, включающих в себя 30 000 атомов. Из кристаллографических снимков процесса транскрипции у эукариотной дрожжевой клетки он создал молекулярный портрет РНК-полимеразы в виде цветного рисунка, на котором копируемая нить ДНК, РНКполимераза и синтезируемая мРНК окрашены в разные цвета. Этот и серию поясняющих рисунков Р. Корнберг с соавторами опубликовал в журнале «Science» в 2001 г. (Vol. 292, 8 June 2001, pp. 1876–1882; published online 19 April 2001; 10.1126/science.1059495), а в 2006 г. он был удостоен за свои исследования Нобелевской премии (см. цв. вкл., рис. 119). Рисунки показывают, как РНК-полимераза распознает свой промотор (участок ДНК, с которого начинается транскрипция), вступает с ним в химическую связь, затем расплетает в этом участке нити ДНК и одновременно обеспечивает правильное присоединение рибонуклеотидов к комплементарным нуклеотидам копируемой нити ДНК. По мере того, как рабочий блок РНК-полимеразы сдвигает нить ДНК, открывая для копирования ее новые участки, растущая нить мРНК отходит в сторону от ДНК-матрицы, а ДНК восстанавливает двухцепочечную структуру. Конец синтеза мРНК наступает, когда РНК-полимераза достигает кодона копируемой цепи, определяющего завершение синтеза мРНК. В этом месте происходит отторжение РНК-полимеразы от ДНК. Вновь синтезированная мРНК также отделяется от ДНК и соединяется с особым белком, который и транспортирует ее из ядра клетки в цитоплазму для трансляции рибосомами в белок по той информации, которая заключена в данной мРНК. (У прокариот вновь синтезируемая мРНК подвергается трансляции уже с самого начала транскрипции.)

С помощью своих регуляторных систем бактериальная клетка «решает», какие белки ей необходимы в данных условиях, и запускает транскрипцию соответствующих оперонов. Поскольку многие из них состоят из нескольких структурных генов (цистронов), оперон прочитывается как одна транскрипционная единица. У бактерий существуют моноцистронные и полицистронные мРНК. В результате трансляции полицистронной мРНК синтезируется столько полипептидных цепей, сколько имеется цистронов в данном опероне. Область ДНК, с которой связывается РНК-полимераза, называется промотором. Он представляет собой начальную часть оперона длиной около 80 пар нуклеотидов. Промоторы содержат две характерные нуклеотидные последовательности, локализованные на расстоянии примерно 10 и 35 нуклеотидов перед первым транскрибируемым основанием. Они необходимы для распознавания РНК-полимеразой промотора и связывания с ним.

Расположение этих последовательностей в одной из цепей ДНК указывает РНКполимеразе, какую из нитей необходимо считывать. Матричная РНК представляет собой однонитевую полирибонуклеотидную цепь, комплементарную той нити ДНК, которая послужила матрицей для ее синтеза.

В составе бактериальной мРНК различают следующие участки (рис. 21):

1. 5'-нетранслируемая последовательность (5'-НТП). 5'-концевой нуклеотид содержит, как правило, одно из пуриновых оснований (А или Г), и, если после транскрипции мРНК не подвергалась никаким изменениям, этот нуклеотид несет трифосфатную группировку (5'фффГ…3').

На 5'-конце эукариотических мРНК располагается другая структура, образующаяся посттранскрипционно, – кэп (англ. cap – шапочка), которая необходима для узнавания мРНК эукариотическими рибосомами.

В составе 5'-НТП обнаружена особая последовательность из 3 – 5 нуклеотидов, комплементарная 3'-концу 16S рРНК. Эта последовательность облегчает инициацию трансляции мРНК рибосомами, так как она стабилизирует положение на рибосоме инициаторного кодона мРНК. Вместе с тем 5'-НТП придает этому участку мРНК определенную вторичную структуру, благодаря чему инициаторный кодон (АУГ) занимает положение, которое облегчает его узнавание и взаимодействие с рибосомой.

2. Инициаторный кодон, т. е. кодон, с которого начинается трансляция мРНК. Чаще всего у бактерий им является триплет АУГ, хотя в некоторых мРНК его функции выполняет кодон ГУГ. Однако триплеты АУГ и ГУГ узнаются рибосомами как инициаторные, только если они входят в состав особой вторичной структуры в мРНК. Во всех иных случаях (внутри структурных генов) они прочитываются как метионин (АУГ) и валин (ГУГ).

Рис. 21. Схематическое изображение гипотетической бактериальной мРНК Жирная линия – область, кодирующая полипептид. Объяснение в тексте

3. Область, кодирующая полипептидную цепь (в нее входит и инициаторный кодон). На ее 3'-конце располагаются один или сразу два терминирующих кодона. Узнавая эти кодоны, рибосома прекращает трансляцию, а в случае полицистронной мРНК рибосома приступает к трансляции следующего цистрона.

4. 3'-нетранслируемая последовательность (3'-НТП), длина ее невелика, а функция не известна.

Для обеспечения биосинтеза белка необходимы следующие условия:

1) наличие всех компонентов белоксинтезирующей системы, из которых формируется машина для синтеза белка;

2) наличие соответствующих физико-химических условий (рН, температура, ионы Mg²⁺, K⁺ и др.);

3) наличие энергии, уникальным поставщиком которой для синтеза белка является ГТФ;

4) наличие матрицы (мРНК);

5) наличие строительных блоков – аминокислот для синтеза белка в форме активированных и связанных с тРНК аминоацил-тРНК.

Аминокислоты в клетке, как правило, не существуют в свободном виде. Они взаимодействуют с тРНК и сохраняются в виде аминоацилированных тРНК (аа-тРНК). Биологический смысл такой «мобилизации» тРНК заключается в том, что аминокислоты при этом предохраняются от действия окислительных ферментов и не «сгорают» в клетке в качестве источника энергии, а используются для синтеза белка. Лишь при избытке какой-нибудь аминокислоты часть ее вовлекается в энергетический обмен.

Важная регулирующая роль в биосинтезе белка помимо мРНК принадлежит транспортной РНК (тРНК). Она выполняет следующие три функции.

1. С помощью специального фермента (аминоацил-тРНК-синтетазы) тРНК присоединяет на одном из своих концов соответствующую аминокислоту, в результате чего возникает лабильное соединение – аминоацил-тРНК (аа-тРНК) – акцепторная функция тРНК.

2. Транспортная РНК при участии специальных белковых факторов и ГТФ доставляет аминокислоту в форме аа-тРНК в рибосому для включения ее в синтезируемую полипептидную цепь – транспортная функция тРНК.

3. Транспортная РНК с помощью своего антикодона специфически взаимодействует с комплементарным ему кодоном мРНК и таким образом обеспечивает необходимую последовательность включения аминокислот в растущую полипептидную цепь в соответствии с программой, заданной в мРНК – адапторная функция тРНК.

С помощью своих антикодонов тРНК осуществляет дешифровку генетического кода в мРНК и перевод его в аминокислотный код белковой молекулы. Реализация этих функций осуществляется благодаря уникальной структуре молекулы тРНК.

В клетке содержится набор примерно из 60 различных типов тРНК, что соответствует количеству значащих кодонов.

Первичная структура (нуклеотидная последовательность) изучена почти у всех типов тРНК. Все они имеют константу седиментации около 48S, а длина их варьирует в зависимости от вида клеток и аминокислотной специфичности от 73 до 93 нуклеотидов.

Характерной особенностью всех типов тРНК является высокое содержание в них необычных оснований, например, инозина (И), дигидроуридина (дигидро-У), псевдоуридина (Ψ); всего в разных типах тРНК обнаружено более 50 вариантов модифицированных оснований. В зависимости от их специфичности к аминокислотам, которые они транспортируют к рибосомам, различают аланиновые тРНК (тРНК^ала), тирозиновые (тРНК^тир), валиновые (тРНК^вал) и т. д.

Изучение первичной структуры тРНК показало, что они представляют собой семейство сходных молекул (рис. 22). Все они без исключения имеют универсальный 3'-концевой тринуклеотид – ЦЦА-3'; фенилаланиновые и метиониновые тРНК у всех млекопитающих обладают идентичной структурой. Еще более консервативными являются инициаторные тРНК.

Все тРНК имеют сходную вторичную структуру, напоминающую лист клевера. При этом образуются характерные для молекул тРНК двунитевые (ветви) и однонитевые (петли) участки (см. рис. 22). У всех тРНК последовательности нуклеотидов, соответствующие антикодону, находятся в середине петли, расположенной напротив ЦЦА-ветви. Например, в тРНК^ала роль антикодона выполняет триплет ИГЦ, тРНК^сер – ИГА, тРНК^лей – ЦАГ и т. д. В процессе взаимодействия тРНК с мРНК первые два основных кодона по принципу комплементарности образуют водородные связи с двумя последними основаниями антикодона. Третий элемент антикодона может образовывать пары с тремя различными основаниями: У, Ц и А. Поэтому антикодон может распознавать несколько кодонов для одной и той же аминокислоты, например, антикодон тРНК^ала ИГЦ может распознавать все три триплета, которые кодируют аланин (ГЦУ, ГЦЦ и ГЦА). Обладая большим сходством структуры, различные тРНК вместе с тем характеризуются строгой индивидуальностью, которая определяется специфичностью набора минорных оснований, последовательностью нуклеотидов в варьирующих участках молекулы, содержанием оснований в антикодоне и другими особенностями.

Рис. 22. Обобщенное изображение молекулы тРНК в виде клеверного листа, характерное для неинициаторных тРНК

Заглавными буквами обозначены нуклеотиды, постоянно или почти постоянно встречающиеся в данном месте цепи. Пу – пурин; Пи – пиримидин; Н – гипермодифицированный пурин.

Кружками обозначены основания, различающиеся у разных тРНК; линии между ними – водородные связи. I, II, III – нуклеотиды антикодона

Обладая сходной первичной структурой, все тРНК имеют и сходную пространственную структуру (рис. 23). Молекула тРНК содержит два сегмента двойных спиралей, закрученных по длине. Они ориентированы друг к другу почти под прямым углом, образуя структуру, напоминающую букву Г. Псевдоуридиновая ветвь (ТΨЦ) располагается в углу молекулы, близко к ней примыкает дигидроуридиновая ветвь (Н₂У). На коротком конце молекулы располагается акцепторный участок – ЦЦА (место присоединения аминокислоты). Длинный конец молекулы заканчивается триплетом оснований, образующих антикодон.

Добавочная ветвь молекулы у разных тРНК содержит различное количество нуклеотидов (4 – 21).

Ветвь, содержащая акцепторный конец, свободна от контактов с остальной частью молекулы. Благодаря этому она может изменять свою ориентацию, что, возможно, существенно для выполнения функций тРНК, связанных с присоединением аминокислот или с их передачей на рибосомы.

Аминокислоты всегда присоединяются к акцепторному триплету ЦЦА. Присоединение происходит путем образования ковалентной связи между карбоксильной группой аминокислоты и гидроксильной группой третьего углеродного атома рибозы – 3'-OH. Связь между аминокислотой и тРНК получила название аминоацильной (рис. 24). Из факта образования аминоацильной связи вытекают два важных следствия. Во-первых, поскольку тРНК связывается с карбоксильной группой ( – COOH) аминокислоты, то прежде, чем карбоксил сможет образовать пептидную связь со следующей аминокислотой во время синтеза полипептидной цепи, тРНК должна отделиться от аминокислоты. Следовательно, эти два процесса – отделение тРНК от аминокислоты и образование пептидной связи (см. формулу на с. 69) – должны происходить согласованно (рис. 25).

Рис. 23. Структура дрожжевой фенилаланиновой тРНК

Рис. 24. Присоединение аминокислоты эфирной связью к 3'-гидроксилу аденозина тРНК

Во-вторых, аминоацильная связь относится к типу связей, богатых энергией. Следовательно, образование аминоацил-тРНК можно рассматривать как активирование аминокислоты. Источником энергии, необходимой для образования этой связи, является АТФ.

Процесс образования аминоацил-тРНК складывается из двух реакций. Вначале происходит взаимодействие свободной аминокислоты с АТФ. В результате этой реакции образуется аминоациладенилат (аминокислота, соединенная богатой энергией связью с АМФ). Затем сразу же происходит вторая реакция – присоединение активированного аминокислотного остатка к акцепторному триплету тРНК, в результате чего образуется аминоацил-тРНК, а АМФ высвобождается.

Обе эти реакции катализируются аминоацилтРНК-синтетазой. Этот фермент обладает строгой специфичностью. Для каждой аминокислоты существует своя специфическая аминоацил-тРНК-синтетаза, которая узнает только данную аминокислоту, активирует ее и затем перебрасывает на акцепторный конец тРНК. В клетке содержится 20 специфических аминоацил-тРНК-синтетаз. Ферменты обладают специфичностью не только в отношении аминокислоты, но и тРНК. Правда, у бактерий этот фермент не различает изоакцепторных тРНК, т. е. один фермент обслуживает все действующие для данной аминокислоты тРНК.

Благодаря высокой специфичности аминоацил-тРНК-синтетаз обеспечивается индивидуальный выбор соответствующей аминокислоты совершенно определенной тРНК.

Из факта специфичности аминоацил-тРНК-синтетаз по отношению к аминокислотам и тРНК следует, что фермент имеет два различных центра связывания: один – для взаимодействия с аминокислотой, а другой – со специфической тРНК. В свою очередь, каждая тРНК имеет также два специфических участка: один – для узнавания фермента, а другой – кодона мРНК. Таким образом, на уровне аминоацил-тРНКсинтетаз происходит переключение трехбуквенного генетического кода в двадцатибуквенный аминокислотный код белков и, наоборот, аминокислотного кода белков в триплетный генетический код.

Рис. 25. Схематическое изображение трех главных участков связывания, в которых молекулы тРНК присоединяются к рибосоме

Слева – ненагруженная рибосома; справа – нагруженная (по Б. Альбертсу [и др.])

Элонгация

Элонгация представляет собой процесс удлинения растущей на рибосоме полипептидной цепи за счет включения в нее аминокислотных остатков в последовательности, соответствующей порядку расположения кодонов в мРНК.

После присоединения к формилметионину очередной аминоацил-тРНК растущая полипептидная цепь превращается в пептидил-тРНК.

Для осуществления элонгации, помимо уже сформировавшегося активного комплекса 70S-рибосома – мРНК – формилметионил-тРНК (пептидил-тРНК), необходимо участие белковых факторов элонгации (у прокариот – EF-Тu, EF-Ts, EF-G) иГТФ.

Элонгация протекает как многократно повторяющийся (по числу кодонов в мРНК) циклический процесс, складывающийся из трех отдельных этапов (рис. 26).

Первый этап – связывание молекулы аа-тРНК со свободным А-участком рибосомы. При этом Р-участок занят тРНК, несущей пептидил. Связывание происходит путем спаривания нуклеотидов антикодона аа-тРНК с кодоном мРНК, расположенным в А-участке.

Второй этап – образование очередной пептидной связи. Карбоксильный конец растущего пептидила отделяется в Р-участке от молекулы донорной тРНК (т. е. тРНК, несущей пептидил) и образует пептидную связь с аминокислотой, присоединенной к молекуле акцепторной тРНК (т. е. служащей акцептором для растущего пептидила) в А-участке (см. формулу на с. 69).

Третий этап – транслокация. Образовавшаяся новая пептидил-тРНК переносится из А-участка в Р-участок рибосомы, а сама рибосома продвигается вдоль мРНК ровно на один кодон (три нуклеотида). Это событие требует затраты энергии. Движущей силой транслокации служит ряд конформационных изменений, вызываемых в одном из белков рибосомы в результате гидролиза связанной с ним ГТФ. В момент транслокации происходит отделение освободившейся во время второго этапа от пептидила в Р-участке тРНК и возвращение ее в цитоплазму. По завершении третьего этапа рибосома возвращается в состояние, аналогичное исходному. Ее А-участок свободен и может принять новую молекулу аа-тРНК, отбираемую очередным кодоном мРНК, т. е. рибосома может снова повторить цикл элонгации.

Рис. 26. Схематическое изображение основных фаз элонгации, протекающей на рибосомах

Объяснение в тексте (по Б. Альбертсу [и др.])

Таким образом, каждый цикл работы рибосомы означает присоединение одной аминокислоты (трансляцию одного кодона). В ходе элонгации рибосома совершает последовательно столько циклов, сколько кодонов она транслирует, т. е. сколько аминокислот она включает в полипептидную цепь.

Сущность энергетического обмена заключается в обеспечении организма энергией, необходимой для проявления жизни. Как уже было отмечено выше, основным источником энергии служит солнечный свет, его энергию улавливают с помощью фотосинтеза растения и фотосинтезирующие бактерии, преобразуя ее в энергию химических структур – глюкозы и других органических соединений. В последующем энергия этих соединений мобилизуется с помощью реакций окисления-восстановления и консервируется в форме АТФ. Молекулы АТФ синтезируются в результате переноса электрона от его первичного донора до конечного акцептора. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, различают аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов служит молекулярный кислород (О₂), а при анаэробном – различные неорганические соединения: NO₃^–, SО₄^2–, SO₃^2–. Таким образом, энергия мобилизуется в реакциях окисления и восстановления. Окисление – отдача электронов, восстановление – присоединение электронов. Когда отнятие пары электронов или атомов водорода от органического субстрата сопряжено с восстановлением кислорода до воды, это сопровождается значительным изменением свободной энергии (ΔG⁰). Оно примерно равно изменению энергии при сжигании одной молекулы водорода (ΔG⁰ = – 57,04 ккал). Перенос электронов по цепи позволяет этой энергии выделяться порциями и превращать часть ее в богатые энергией связи АТФ. Чтобы такая цепь переноса действовала, в ней должен существовать градиент способности к окислению. Способность вещества отдавать электрон или присоединять его (т. е. окисляться или восстанавливаться) количественно выражается в виде его окислительно-восстановительного потенциала.

Переносчики электронов в цепи их переноса участвуют в последовательных реакциях с постепенно увеличивающимися значениями ΔE'₀ (ΔE'₀ – разность между потенциалами двух полуреакций) и увеличением окислительно-восстановительного потенциала.

Принципиальная схема цепи переноса электронов от первичного донора электронов (атома водорода) до конечного его акцептора О₂ выглядит так:

Окислительно-восстановительный потенциал указан в вольтах при стандартных условиях (25 °C, рН = 7,0, все реагенты в концентрации 1,0 М). Однако у бактерий встречаются самые разнообразные варианты этой общей схемы. В связи с этим они по типу дыхания подразделяются на следующие четыре группы:

1) строгие аэробы (размножаются только в присутствии кислорода);

2) микроаэрофилы (нуждаются в уменьшенной концентрации свободного кислорода);

3) факультативные анаэробы (могут потреблять глюкозу и размножаться как в аэробных, так и в анаэробных условиях);

4) строгие анаэробы (размножаются только в бескислородных условиях, т. е. не используют О₂ в качестве конечного акцептора электронов).

Максимальная мобилизация энергии из глюкозы происходит при ее окислении через цикл лимонной кислоты (цикл Кребса). Один моль глюкозы С₆Н₁₂О₆ содержит около 690 ккал (такое количество энергии выделяется при сжигании 180 г глюкозы). На первом этапе потребления глюкозы в отсутствие кислорода (при гликолизе) из одной ее молекулы образуются две молекулы молочной кислоты и синтезируются всего две молекулы АТФ. Каждая молекула АТФ имеет одну богатую энергией (10 ккал) пирофосфатную химическую связь. После расщепления глюкозы до молочной кислоты последняя в присутствии кислорода окисляется и превращается в пировиноградную кислоту, которая далее полностью окисляется через цикл Кребса до СО₂ и Н₂О. Каждая молекула лактата (пирувата) отдает 6 пар электронов. При переносе каждой пары электронов по цепи переноса часть их энергии используется для образования 3 молекул АТФ (рис. 27).

Таким образом, полное окисление одного моля глюкозы сопровождается синтезом 38 молекул АТФ с общим запасом энергии в 380 ккал, или около 55 % всей энергии моля глюкозы (690 ккал); остальная энергия подвергается диссипации, т. е. бесполезному рассеиванию в виде тепла. Однако и такой выход полезной энергии является достаточно высоким. Выход для многих бактерий известен, как и урожай клеток, который составляет около 10 г сухого вещества на 1 моль образовавшегося АТФ. Для объяснения механизма мобилизации энергии, т. е. синтеза АТФ при переносе электронов, предложен ряд гипотез, в том числе химио-осмотическая гипотеза Митчелла. Она исходит из того, что цепь переноса электронов, локализованная в мембране (у бактерий в ЦМ), ориентирована поперек нее, а электроны переносятся последовательно от одного носителя к другому в направлении возрастающего окислительно-восстановительного потенциала. Окисление переносчиков электронов сопровождается одновременным переносом протонов (Н⁺) с внутренней поверхности мембраны на ее внешнюю поверхность (рис. 28). Поскольку мембрана во всех других случаях непроницаема для протонов, возникает градиент концентрации протонов (рН⁺) между внутренним и внешним слоями мембраны, и она становится «энергизованной». Энергия градиента протонов используется клеткой для различных процессов, в том числе для активного транспорта питательных веществ, вращения жгутиков и синтеза АТФ. Протоны могут проникать обратно через мембрану лишь в определенных участках ее через особые каналы, с которыми связаны специфические ферменты АТФазы, катализирующие реакцию синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфора (Ф_н):

Перемещение протонов по их электрохимическому градиенту с помощью мембранной АТФ-азы служит источником энергии для образования АТФ. Реакция поддерживается градиентом протонов. Однако АТФаза может вызывать и гидролиз АТФ. Это также приведет к перемещению протонов из клетки и созданию их градиента, энергия которого может быть использована для процессов, требующих ее затраты. Некоторые энергообразующие реакции являются общими для аэробных и анаэробных механизмов дыхания. К ним относятся три пути превращения сахаров в основной энергетический метаболит – пировиноградную кислоту: путь Эмбдена – Мейергофа (гликолиз), пентозофосфатный путь (или гексозофосфатный шунт) и путь Энтнера – Дудорова, обнаруженный лишь у некоторых прокариот.

В первом случае (путь Эмбдена – Мейергофа, гликолиз, рис. 29) вначале затрачиваются две молекулы АТФ на образование фруктозо-1,6-дифосфата, который затем расщепляется на фосфоглицериновый альдегид и диоксиацетонофосфат. В результате окисления последних, сопряженного с восстановлением НАД, из каждой образуется по молекуле 1,3-дифосфоглицериновой кислоты. На последующих этапах превращения ее в пировиноградную кислоту происходит так называемое субстратное фосфорилирование, т. е. обе фосфатные группы переносятся на АТФ и, таким образом, на каждую молекулу глюкозы образуются 4 молекулы АТФ. Поскольку две из них затрачиваются на начальных этапах превращения глюкозы, общий выход энергии составляет 2 молекулы АТФ на моль глюкозы.

Рис. 27. Цикл Кребса, или цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) (по А. Ленингеру)

Рис. 28. Энергизация мембраны. Объяснение в тексте

Рис. 29. Путь Эмбдена–Мейергофа: превращение глюкозы в пировиноградную кислоту

Рис. 30. Пентозофосфатный путь окисления глюкозы

Пентозофосфатный путь (рис. 30) обеспечивает окисление одного из углеродных атомов глюкозы и не приводит непосредственно к образованию пировиноградной кислоты. Он представляет сложный цикл, при прохождении через который шести молекул происходит полное окисление одной молекулы глюкозо-6-фосфата до СО₂ и восстановление шести молекул НАДФ⁺ в НАДФ • Н. Значение этого пути потребления глюкозы заключается в том, что он обеспечивает образование рибозо5-фосфата, необходимого для синтеза нуклеиновых кислот, и большей части НАДФ • Н, нужного для многих биосинтетических реакций.

В случае превращения глюкозы по пути Энтнера – Дудорова (рис. 31) образуется промежуточный продукт, характерный только для этого пути, – 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовая кислота, которая далее расщепляется на молекулу пировиноградной кислоты и молекулу 3-фосфоглицеринового альдегида. Последний подвергается дальнейшему превращению по пути Эмбдена – Мейергофа в пировиноградную кислоту. В результате из одной молекулы глюкозы образуются две молекулы пировиноградной кислоты, одна молекула АТФ и две молекулы НАДФ • Н.

Рис. 31. Путь Энтнера–Дудорова: превращение глюкозы в пировиноградную кислоту и 3-фосфоглицериновый альдегид

Путь Эмбдена – Мейергофа наиболее широко используется различными бактериями при потреблении глюкозы. От образующегося при этом конечного продукта – пировиноградной кислоты, а также от таких промежуточных продуктов, как эритрозо-4-фосфат и рибозо-5-фосфат, идут различные метаболические пути синтеза двадцати аминокислот (рис. 32). Общая схема обмена веществ у микроорганизмов, обладающих аэробным дыханием и потребляющих гексозы, показана на рис. 33. Поскольку в аэробных условиях высвобождается гораздо больше энергии, чем при брожении, некоторые бактерии осуществляют такой тип дыхания, при котором акцептором водорода (электронов) является связанный кислород. Его носители – нитраты (нитратное дыхание) или сульфаты (сульфатное дыхание). При этом за счет водорода окисляемого субстрата нитраты восстанавливаются до молекулярного азота, а сульфаты – до H₂S (рис. 34). Способность таких бактерий переносить электроны на нитраты и сульфаты связана с наличием у них цитохромов и системы переноса электронов. Это позволяет им осуществлять достаточно полное окисление субстрата и получать таким путем гораздо больше энергии, чем при брожении.

Рис. 32. Пути образования двадцати аминокислот, необходимых для синтеза белков, из промежуточных продуктов обмена (по Г. Шлегелю)

Рис. 33. Схема обмена веществ у микроорганизмов, потребляющих О₂ и гексозы (по Г. Шлегелю):

1 – ФДФ-путь; 2 – ПФ-путь; 3 – КДФГ-путь; 4 – ЦТК; 5 – дыхательная цепь; 6 – фосфорилирование на уровне субстрата; 7 – окислительное фосфорилирование в дыхательной цепи; 8 – синтез мономеров; 9 – синтез полимеров

Рис. 34. Аэробные и анаэробные процессы дыхания (по Г. Шлегелю)

Строгие анаэробы

Главная особенность строгих анаэробов заключается в том, что их энергетический обмен происходит без участия свободного кислорода. Синтез АТФ при потреблении глюкозы в анаэробных условиях (гликолиз) происходит за счет фосфорилирования субстрата. Из одной молекулы глюкозы в этих условиях образуются две молекулы молочной кислоты, а выход энергии составляет всего 20 ккал (синтезируются две молекулы АТФ) на моль глюкозы, т. е. во много раз меньше, чем при полном окислении этого основного носителя энергии. Хотя анаэробы также мобилизуют энергию в результате окислительно-восстановительных процессов, т. е. в результате переноса водорода (электронов), но кислород для них не служит конечным акцептором электронов. Более того, молекулярный кислород оказывает на них токсическое действие, причины которого следующие:

1) у анаэробных бактерий кислород угнетает анаэробные энергообразующие реакции (эффект Пастера);

2) у строгих анаэробов отсутствует фермент каталаза, поэтому накапливающаяся в присутствии кислорода Н₂О₂ оказывает на них бактерицидное действие;

3) у строгих анаэробов отсутствует система регуляции окислительно-восстановительного потенциала (редокс-потенциала) – rH₂. Окислительно-восстановительный потенциал представляет собой показатель окислительно-восстановительного равновесия всех компонентов системы, находящейся в равновесии с электродами; rH₂ – отрицательный логарифм гипотетического давления водорода, когда данная окислительно-восстановительная система находится в состоянии равновесия:

где Ehk – найденный потенциал среды; 250 mv – разница потенциалов между каломельным и нормальным водородным электродом (считается, что каломельный электрод при температуре 20 °C на 250 mv положительнее водородного).

Показатель rH₂ может варьировать от минимума – 0 (среда насыщена водородом) до максимума 41 (среда насыщена кислородом); при rH₂ = 28 оба процесса находятся в динамическом равновесии.

Направление и напряженность окислительно-восстановительных реакций, протекающих в бактериальной клетке, зависят от состава среды. Eh нормальной питательной среды, находящейся в контакте с воздухом, равен 0,2 – 0,4 В при рН = 7,0. Eh культуры бактерий определяется в результате конкуренции скоростей двух процессов – скорости образования восстановленных веществ и скорости образования компонентов, окисленных кислородом. Присутствие в среде окисляющих веществ повышает rH₂, а наличие веществ, обладающих восстановительными свойствами (аскорбиновая кислота, цистеин и др.), снижает его. Существуют определенные границы rH₂ и рН среды, внутри которых клетки способны осуществлять метаболические реакции с определенной скоростью.

Строгие аэробы, факультативные анаэробы и микроаэрофилы обладают системами, которые позволяют им при высоком содержании О₂ снижать уровень rH₂ до показателей, при которых они могут эффективно размножаться. Установлено, что у таких бактерий размножение совпадает с быстрым падением окислительно-восстановительного потенциала. Существуют предельные значения rH₂ для роста бактерий и, в частности, анаэробов. Обычно рост их угнетается, если начальная Eh среды выше –0,2 В. Строгие анаэробы, у которых отсутствуют системы регуляции rH₂, в присутствии О₂ расти не могут. Зависимость их роста от уровня rH₂ подтверждается тем, что если с помощью восстанавливающих веществ снизить уровень rH₂, строгие анаэробы начинают расти и в присутствии кислорода. Строгий анаэроб Clostridium perfringens хорошо растет на аэрируемой среде, если Eh ее снижен аскорбиновой кислотой до –0,125 В.

По-видимому, у разных видов строгих анаэробов чувствительность к молекулярному кислороду опосредуется разными факторами. В связи с высокой чувствительностью строгих анаэробов к молекулярному кислороду для их культивирования с помощью различных способов создаются бескислородные условия. С этой целью используются механические, физические, химические и биологические способы удаления кислорода: посевы в глубокие столбики агара; кипячение (регенерация) жидкой питательной среды (Китта – Тароцци), содержащей глюкозу и кусочки печени (для связывания растворенного кислорода), и заливка ее стерильным вазелиновым маслом; добавление в атмосферу роста химических веществ, поглощающих кислород (например, щелочного пирогаллола); совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов на кровяном агаре с глюкозой в запарафинированной чашке Петри (вначале растут строгие аэробы, а после снижения содержания кислорода – анаэробы) – способ Фортнера – и т. п. Наилучшим методом является применение специальных анаэростатов, из которых воздух откачивается и (или) замещается каким-либо инертным газом или смесью азота и углекислого газа.

Для своего роста (увеличения биомассы) и размножения бактериальная клетка должна получать из окружающей среды, как минимум, источники углерода, энергии и различные химические элементы. Источником углерода и энергии могут быть одна и та же молекула (чаще всего глюкоза) или же различные молекулы, например СО₂ как источник углерода, а NH₃ – источник энергии. Клетки, у которых отсутствуют какие-либо биосинтетические процессы, должны получать их конечные продукты, т. е. «факторы роста», из внешней среды. Если же клетка может получать некоторые конечные продукты извне, она будет их использовать преимущественно, «выключив» их эндогенный синтез. Для осуществления реакций окисления среда должна обеспечить клетку конечным акцептором водорода (электронов): для аэробов им является О₂, а для анаэробов им могут быть или органические вещества, или органические субпродукты расщепления углеводов, или неорганические соединения (NO₃^–, SО₄^2– и т. п.). Например, многие бактерии растут за счет расщепления глюкозы как источника углерода, энергии и акцептора водорода. Благодаря обмену источников углерода бактерии синтезируют промежуточные продукты, необходимые для образования основных биополимеров. Окисление источников энергии приводит к накоплению АТФ, что позволяет бактериям обеспечивать себя энергией, необходимой для биосинтеза субъединиц биополимеров и их активации. Активированные субъединицы полимеризуются и образуют макромолекулы, которые саморегулируются, формируя субклеточные и клеточные структуры. В результате биомасса клетки удваивается за определенный срок (клеточный цикл), и она размножается путем бинарного деления. В одно и то же время в бактериальной клетке совершается огромное количество биохимических процессов, завершающихся, в конечном счете, увеличением ее биомассы. Это предполагает наличие у нее совершенных механизмов саморегуляции, чутко реагирующих на все изменения условий ее жизни. В настоящее время представляется возможным условно разделить эти механизмы на две основные группы: а) группа неспецифических механизмов регуляции роста и размножения; б) группа специфических механизмов саморегуляции.

К неспецифическим механизмам относится совокупность действия различных физико-химических факторов, регулирующих общую скорость всех основных процессов жизнедеятельности. К ним относятся: температура, рН, rH₂, концентрация ионов, степень обеспечения среды кислородом, давление и др. Неспецифический характер этой формы регуляции заключается в том, что она влияет прежде всего на общую кинетику биосинтетических процессов. Обеспечивая оптимальное соотношение всех указанных факторов, можно получить максимальную скорость размножения бактерий и максимальный выход биомассы в соответствующих производствах. Однако действие физико-химических факторов опосредуется через специфические механизмы клеточной саморегуляции. Она носит многоступенчатый характер и отличается выраженной универсальностью, вытекающей из того, что специфическая саморегуляция связана прежде всего с ферментами, катализирующими биохимические реакции, а все ферменты имеют одинаковую химическую природу. Взаимодействие на уровне фермент – субстрат является важнейшим пусковым моментом всей клеточной системы саморегуляции. Именно на этом уровне происходит интеграция неспецифических и специфических механизмов саморегуляции клетки. Специфичность взаимодействия фермента с субстратом детерминирована генетически – она обусловлена последовательностью расположения аминокислот в белковой молекуле и определяемой ею вторичной, третичной и четвертичной структурой молекулы фермента. В связи с этим никаких дополнительных механизмов регуляции на уровне фермент – субстрат не требуется. Синтезированный фермент готов в любой момент, если не изменена его аллостерическая структура, вступить в реакцию с соответствующим субстратом. Как известно, скорость ферментативной реакции можно выразить уравнением:

где E₀ – начальная концентрация фермента; S – концентрация субстрата.

При увеличении концентрации [S], когда [S] > K_m, скорость ферментативной реакции (V) будет стремиться к некоторой постоянной величине V_макс– максимальной скорости реакции:

Поэтому зависимость между скоростью ферментативной реакции и концентрацией субстрата можно выразить следующим уравнением Михаэлиса – Ментен:

Из уравнения следует, что при малых величинах концентрации субстрата скорость реакции будет находиться в линейной зависимости от [S], а при очень высокой концентрации субстрата скорость реакции (V) будет стремиться к максимальной (V_макс) и мало зависит от дальнейшего увеличения концентрации [S]. В свою очередь, при условии, когда [S] > (E), скорость реакции будет пропорциональна концентрации фермента. Основными кинетическими константами уравнения Михаэлиса являются максимальная скорость реакции (V_макс) и константа Михаэлиса (K_m). Величина последней определяется соотношением трех констант скорости. В случае, когда K₊₂ < K_– 1, K_m ≈ K_– 1/K₊₁ = K_s.

Константа K_s получила название константы субстрата и служит мерой сродства фермента к субстрату. Поскольку скорость реакции, катализируемой ферментом, зависит от относительного сродства фермента к субстрату, константа (K_s) является важной характеристикой фермента. Поэтому уравнение Михаэлиса – Ментен может быть выражено следующим образом:

где V_макс – предел, к которому стремится скорость реакции с повышением концентрации субстрата; K_s – константа, численно равная концентрации субстрата при V=Ммакс/2.

Колебание температурного режима оказывает на ферментативные реакции влияние таким же образом, как и на другие химические реакции. Отношение констант реакций при более высокой (Т₂) и более низкой (Т₁) температурах получило название температурного коэффициента: Q = K₂/K₁. Значение его обычно дается для интервала в 10 °C (Q₁₀). Величину Q₁₀ легко вычислить для любого температурного интервала ΔT по формуле:

Скорость ферментативных реакций зависит также от концентрации водородных ионов. Величина оптимальной рН и ее границы варьируют в зависимости от типа и свойств ферментов. Даже изоферменты, имеющие одинаковую субстратную специфичность, могут различаться по оптимуму рН.

Отличаясь высокой специфичностью действия, ферменты, вместе с тем, обладают многими общими свойствами, вытекающими из их белковой природы. Благодаря последним создаются условия, которые позволяют использовать опять-таки универсальные механизмы для контроля активности ферментов.

В частности, существует специфический механизм саморегуляции скоростей отдельных биохимических реакций, вытекающий из аллостерической природы белков-ферментов: конечный продукт реакции (в случае накопления некоторого избытка его), взаимодействуя с молекулой фермента, так изменяет ее конформацию, что она временно утрачивает свою активность. Этот принцип саморегуляции, получивший название регуляции по типу отрицательной обратной связи, или торможения конечным продуктом, носит универсальный характер. С его помощью создаются идеальные условия для саморегуляции, так как он не требует никакой дополнительной затраты энергии и вещества. Запуск реакций, ведущих к превращению субстрата, осуществляется самим субстратом, а их остановка – конечным продуктом. Как только содержание конечного продукта достигает определенного уровня, дальнейший синтез его прекращается. Конечный продукт выступает в роли регулятора собственного синтеза. Так осуществляется саморегуляция многих биохимических процессов и, как следствие, координация их, так как многие из них взаимозависимы по участвующим в реакциях различным продуктам. Помимо этого уровня саморегуляции, определяющего кинетику единичных ферментативных реакций, а также общую скорость и координацию большинства биохимических процессов, существует высшая форма клеточной саморегуляции, осуществляемая на генетическом уровне. В соответствии с химическими сигналами, поступающими как из внешней среды, так и эндогенным путем, клетка автоматически запускает (индуцирует) или подавляет (репрессирует) синтез соответствующих ферментов. Нетрудно видеть, что, хотя эффекты индукции и репрессии противоположны по своим проявлениям, они представляют собой две стороны одного и того же процесса, а именно – регуляции образования ферментов. Благодаря механизмам индукции и репрессии, осуществляемым с помощью соответствующих генов (регуляторов, операторов, промоторов, аттенуаторов и т. п.) и белков (репрессоров, активаторов, апорепрессоров и т. п.), клетка, в соответствии с химическими сигналами, осуществляет автоматический контроль биосинтеза необходимых ей в данное время ферментов.

Одним из проявлений регуляции синтеза ферментов на уровне генома служит так называемая постоянная или временная катаболитная репрессия. Суть ее состоит в том, что некоторые источники углерода, принимающие участие в энергетическом обмене, например глюкоза, способны подавлять биосинтез определенных ферментов. Существует предположение, что синтез биосинтетических ферментов контролируется по механизму отрицательной обратной связи – репрессией конечным продуктом, а биосинтез ферментов, участвующих в катаболизме, контролируется механизмом индукции и катаболитной репрессии.

Бактерии, как и все живые организмы, не могут существовать в природе, не получая информации из внешней среды и от себе подобных. Обмен информацией (коммуникацию) они осуществляют разными способами, например путем непосредственого контакта при конъюгации (с помощью донорных ворсинок), при формировании колоний и при других процессах. Особое значение имеет способность бактерий вступать в контакт с клетками организма человека и животных. Распознавание клеток и присоединение к ним – важнейший начальный этап реализации бактериями патогенных свойств. Другой важной формой межклеточной коммуникации служат УФ (митогенетическое излучение), электромагнитные волны светового и инфракрасного диапазонов. Дистантное взаимодействие существенно важно в регуляции переходных процессов или в стрессовых ситуациях, когда клетке надо «решить», как вести себя в необычных условиях. Важную информацию бактерии получают через посредство физико-химических факторов внешней среды (температура, pH среды и т. п.), а также специальных химических сигналов. Установлено, что бактерии синтезируют и выделяют во внешнюю среду много биологически активных соединений, которые координируют их коллективное поведение, физиологическое состояние и т. п.

У бактерий обнаружены различные системы, способные воспринимать из внешней среды физические и химические сигналы. У многих патогенных бактерий (E. coli, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и др.) обнаружены термоиндуцибельные системы, контролирующие синтез факторов патогенности. Например, у E. coli при температуре 18 – 20 °C практически не происходит синтеза факторов адгезии (пилей). Повышение температуры до 37 °C индуцирует их образование. Такой же температурозависимый контроль синтеза факторов патогенности обнаружен у возбудителей чумы (Y. pestis), дизентерии (Shigella flexneri) и других заболеваний. Целесообразность действия этих систем очевидна: факторы патогенности необходимы бактериям для обеспечения их существования в организме человека или животных, т. е. при температуре 37 °C. В иных условиях эти системы бактериям не нужны. Другим примером того, как бактерии реагируют на физические сигналы, является феномен «теплового шока», описанный еще в 1952 г. Ф. Ритоссой. Он лучше всего изучен у E. coli. Суть его заключается в том, что нагревание среды до 42 °C активизирует работу ряда генов, вследствие чего в 5 – 20 раз увеличивается синтез почти 20 белков, играющих ключевую роль в жизни клеток. Главную роль в системе теплового шока играет ген (позитивный регулятор) htpR (англ. – heat temperature protein regulator), картированный на 76-й минуте хромосомной карты E. coli. Он является представителем особой группы генов, продукты которых необходимы для роста только при температуре выше 35 °C. Продукт гена htpR – σ-белок, который играет роль σ-субъединицы РНК-полимеразы. Последняя и определяет выбор промоторов тех генов, которые входят в систему теплового шока.

Интересно, что генетический контроль споруляции также реализуется через изменение σ-субъединицы РНК-полимеразы. Фактором, запускающим споруляцию у B. subtilis, служит аденозин-бис-трифосфат р₃Ар₃. Его синтез осуществляет фермент аденозин-бис-трифосфат-синтетаза. В нормальных условиях синтез этого фермента репрессирован. Когда же клетка получает соответствующий химический сигнал из внешней среды (например, об истощении источника энергии), репрессия синтеза фермента снимается, накапливается р₃Ар₃, и это каким-то образом приводит к замене σ-субъединицы РНК-полимеразы. В результате этого последняя начинает распознавать промоторы генов, продукты которых и обусловливают спорообразование.

Помимо системы теплового шока у бактерий обнаружена система и «холодового шока»: снижение температуры роста с 37 до 10 °C у E. coli вызывает увеличение в 3 – 300 раз синтеза 13 белков, изменяющих ход ее биосинтетических процессов в новых условиях роста. Обе эти системы связаны друг с другом и с другими системами, в том числе с системой, регулирующей клеточное деление, и через RecA белок с жизненно важной системой генов – SOS-системой (см. часть 2 «Генетика бактерий»).

Восприятие химических сигналов бактериями осуществляется с помощью так называемых сенсорно-регуляторных систем. Простейшая схема их такова (рис. 35). Вначале сигнал воспринимается рецептором клеточной мембраны и передается мембранным ферментам. Затем образуется вторичный посредник (мессенджер – англ. messenger – посыльный), который через системы киназ и фосфатаз взаимодействует с эффекторным аппаратом клетки, в том числе с ее генами. Этот процесс передачи сигнала обычно включает в себя обратимую посттрансляционную модификацию белков посредством их фосфорилирования. В простейшем случае сенсорно-регуляторная система состоит из белка-рецептора (сенсора), который располагается, как правило, но не всегда, в мембране, и белка-регулятора, локализованного в цитоплазме. Примером такой системы является система осмотической регуляции у E. coli: ее сенсором является белок EnvZ, а регулятором – белок OmpR (система EnvZ/OmpR). Белок EnvZ получает информацию из периплазмы, в которой располагается его N-концевой домен. С-концевой домен располагается в цитоплазме и обладает ауто– и протеинкиназной активностью. В присутствии АТФ С-домен аутофосфорилируется, а затем передает фосфорильную группу белку-регулятору – OmpR. В свою очередь белок OmpR контролирует работу двух генов – оmpC и оmpF, кодирующих синтез белков-поринов наружной мембраны – OmpC и OmpF. Белок OmpF имеет больший диаметр пор, чем белок OmpC. Регулятор ответа – белок OmpR – также состоит из двух доменов: N-концевой домен фосфорилируется белком-сенсором, а С-концевой домен взаимодействует с промоторами генов ompC и ompF с различной активностью в зависимости от того, фосфорилирован ли этот белок (OmpR). Таким образом, от активности транскрипции генов ompC и ompF будет зависеть соотношение белков-поринов OmpC и OmpF в наружной мембране, а следовательно, и степень проницаемости мембраны для воды и низкомолекулярных гидрофильных соединений. По такому же принципу устроены и работают и другие сенсорно-регуляторные системы. С-концевые домены разных сенсорных белков имеют сходное строение, а N-концевые домены регуляторных белков также оказались гомологичными. Поэтому механизмы взаимодействия между белками-сенсорами и соответствующими им белками-регуляторами, вероятно, одинаковы. У бактерий уже обнаружено около 30 таких сенсорно-регуляторных систем, воспринимающих различные химические сигналы и обеспечивающих на них адекватный ответ. Специфичность их зависит от передачи сигнала на соответствующий эффекторный аппарат (на гены). Функции, выполняемые регуляторами ответа, – получение сигнала от сенсора, взаимодействие с промоторами соответствующих генов и активация их транскрипции – разделены между доменами белка-регулятора. Сходство в механизме функционирования этих систем указывает на то, что их функции также должны быть скоординированы.

Рис. 35. Этапы внутриклеточной передачи сигналов (по Д. Эриксону. В мире науки. 1993, вып. 1):

1 – связывание внеклеточного сигнального агента; 2 – клеточный рецептор; 3 – белок-передатчик; 4 – мембранный фермент; 5 – вторичный мессенджер; 6 – киназы и фосфатазы

Важнейшим механизмом восприятия информации из внешней среды служит изменение топологического состояния ДНК, степени ее суперспирализации, от которой зависит работа генов бактерий, в том числе систем теплового и холодового шока. В отличие от сенсорных систем этот механизм реагирует не на специальные химические сигналы, а на разнообразные изменения физико-химического состояния внешней среды и поэтому выполняет роль общего регулятора экспрессии генов.

Таким образом, при большом количестве взаимодействующих систем для их согласованности, т. е. для саморегуляции жизненных процессов клетки, решающее значение имеет соблюдение трех основных условий: во-первых, согласованность скоростей реакций; во-вторых, строгое регулирование последовательностей их включения; в-третьих, регулирование количественного и качественного состава самих ферментов в строгом соответствии с сигналами, поступающими из окружающей среды. Приспособляемость, если под ней понимать корреляцию между степенью физиологической активности клетки и условиями среды, возникает как неизбежное следствие установления взаимосвязи между динамическими системами клетки. Внешние условия – наличие необходимых субстратов, температуры, рН, rН₂ и других факторов – индуцируют одни системы и лимитируют активность других систем. Целесообразность поведения живой системы складывается из совокупности согласованно протекающих в ней саморегулируемых и взаимосвязанных реакций, т. е. она обусловлена самой организацией живой системы. Конечным результатом регуляции протекающих в клетке биосинтетических и катаболических процессов является произведение потомства, а показателем сбалансированности функционирующих систем служит скорость роста бактерий.

Рост и размножение бактерий

Различают рост индивидуальных клеток и рост популяции. Каждый из них характеризуется своими особенностями и закономерностями. Под ростом индивидуальной клетки понимают увеличение ее биомассы, наступающее в результате синтеза клеточного материала. Объем клетки можно вычислить, если известны ее продольные и поперечные размеры. Для шаровидных клеток он определяется по формуле:

а для цилиндрических

где r – радиус клетки; a – длина клетки.

Рост палочек происходит в длину, поэтому удельная поверхность (отношение поверхности к объему) остается примерно постоянной, и скорость роста в определенных условиях может быть постоянной.

У сферических клеток рост происходит во всех направлениях, поэтому удельная поверхность непрерывно уменьшается с ростом клетки, вследствие чего скорость роста у кокков постепенно замедляется. Удлинение клеток происходит благодаря удлинению клеточной стенки за счет включения в различные ее слои новообразованных структурных единиц. У стрептококков включение их происходит в области «экватора» клеточной стенки. У некоторых грамотрицательных бактерий этот процесс происходит без четкой локализации, т. е. в различных участках клеточной стенки. У E. coli рост наружной мембраны происходит исключительно в области ее полюсов, а рост пептидогликанового слоя – за счет включения новыхединиц в различных его участках. В условиях скоординированного роста деление клетки происходит, когда она удваивает свою биомассу, строго посередине. Процесс деления клетки сопряжен с процессом сегрегации (распределения) дочерних хромосом и дочерних плазмид в дочерние клетки. У бактерий обнаружены белкигомологи белков ParA и ParB (они осуществляют равномерное распределение плазмид между дочерними клетками) и белок MucB. Вместе с белками мембраны они образуют комплекс, растаскивающий хромосомы в дочерние клетки перед образованием межклеточной перегородки. Связь между вегетативной репликацией хромосомы и клеточным делением включает три следующих последовательных события:

1) подготовку к инициации репликации;

2) цикл репликации хромосомы (и плазмиды);

3) интервал времени между завершением репликации хромосомы и клеточным делением. Клеточный цикл бактерий можно выразить следующей формулой:

где T – время удвоения; С – время цикла репликации; D – время между завершением цикла репликации и клеточным делением.

При благоприятных условиях роста Т для E. coli и многих других бактерий составляет около 30 мин. Деление бактериальной клетки находится также под строгим генетическим контролем, нарушение которого приводит и к нарушению механизма клеточного деления.

Деление бактерий наступает в результате формирования межклеточной перегородки, которое происходит следующим образом. В том участке ЦМ, с которым связана с помощью особого рецептора молекула ДНК (хромосома, плазмида), происходят события, инициирующие процесс репликации, в результате которого вновь образующаяся дочерняя молекула ДНК прикрепляется также к рецептору на ЦМ. Область последней между двумя рецепторами, к одному из которых прикреплена родительская, а к другому – дочерняя ДНК, начинает удлиняться, в результате этого расстояние между ними все время увеличивается в течение времени С (рис. 36). По завершении процесса репликации строго по экватору между отделившимися друг от друга хромосомами начинает формироваться межклеточная перегородка путем встречной инвагинации (врастания навстречу друг к другу) ЦМ и связанной с ней области клеточной стенки (рис. 37).

Рис. 36. Модель К. Ларка, объясняющая механизм регулирования равномерности распределения хромосом (и плазмид) между дочерними клетками

Одна из нитей хромосомы прикреплена к особому рецептору мембраны (1). После инициации репликации вторая нить также разрывается (2) и прикрепляется к соседнему рецептору мембраны (3). Рост (удлинение) мембраны постепенно отделяет хромосомы друг от друга. Когда клетка удвоит свою длину, точно по ее экватору между дочерними хромосомами формируется межклеточная перегородка, и клетка делится

В результате слияния инвагинирующих участков ЦМ и КС образуется межклеточная перегородка, и родительская клетка разделяется на две дочерние клетки равной длины. Функцию аппарата митоза у бактерий выполняет ЦМ путем своего удлинения, которое раздвигает хромосомы (и плазмиды) таким образом, что они оказываются по ту и другую стороны формирующейся межклеточной перегородки в равных соотношениях.

Рис. 37. Модель участия ЦМ в регуляции репликации и равномерности распределения хромосом и плазмид между дочерними клетками

Результатов нарушения генетического контроля клеточного деления может быть по крайней мере два. Если формирования межклеточной перегородки не происходит, возникают длинные нитевидные формы. Однако при восстановлении нарушенного механизма такого контроля нити делятся на фрагменты, равные по длине нормальным клеткам. В некоторых случаях нарушение контрольных механизмов приводит к тому, что вместо одной межклеточной перегородки, формирующейся по экватору, происходит образование одной или двух перегородок, каждая из которых локализована ближе к своему полюсу. Поскольку в этом случае формирование перегородки не связано с сегрегацией хромосом, образуются так называемые мини-клетки, лишенные хромосом, которые остаются в родительской клетке. Мини-клетки могут осуществлять различные биохимические процессы, поскольку они содержат ферменты, но они не способны к размножению, так как лишены хромосом.

Помимо мини-клеток вследствие различных неблагоприятных воздействий из бактерий могут образовываться так называемые нанно-клетки, т. е. мельчайшие клетки размером 0,2 – 0,3 мкм. Их описывали под различными названиями: фильтрующиеся формы бактерий, элементарные тельца, ультрамикробактерии. Чаще всего они образуются при L-трансформации бактерий. Поскольку размеры таких клеток удобнее выражать в нанометрах, а не в долях микрометра, их стали называть нанно-клетками. Образование нанно-клеток – универсальная ответная реакция бактерий на неблагоприятные условия существования.

Питательные среды

Для выращивания бактерий применяют различные питательные среды. Они могут быть жидкими, твердыми (лучше называть их плотными) или полужидкими. Жидкие среды готовят на основе водных растворов каких-либо веществ, чаще всего мясной воды, различных гидролизатов, иногда жидких естественных продуктов (молока, крови и др.). Для получения плотных сред к ним добавляют или агар, или желатин, или силикагель в соответствующих концентрациях. Агар представляет собой полисахарид сложного состава, получаемый из морских водорослей. Он имеет плотную волокнистую структуру. Агар плавится при температуре 100 °C, но при охлаждении сохраняет жидкую консистенцию до 45 °C. Для получения плотных сред его добавляют в концентрации 1,5 – 3,0 %. Полужидкие среды имеют вязкую консистенцию благодаря добавлению к ним небольшого количества агара (0,3 – 0,7 %). По происхождению среды делят на естественные (кровяные, молочные, картофельные, яичные) и искусственные, получившие особенно широкое распространение. Они представляют собой искусственные сбалансированные смеси питательных веществ в концентрациях и сочетаниях, необходимых для роста и размножения микроорганизмов. В них в качестве универсального источника азота и углерода для патогенных бактерий применяют пептоны – продукты неполного расщепления белков с помощью ферментов (пепсина), различные гидролизаты (рыбный, казеиновый, дрожжевой и т. п.). Питательные среды обязательно отвечают трем основным требованиям:

1) они должны содержать в достаточном количестве все необходимые питательные вещества (источники энергии, углерода, азота), соли и ростовые факторы;

2) должны иметь оптимальную для роста данного вида бактерий рН;

3) должны иметь достаточную влажность (при их усыхании повышается концентрация питательных веществ, особенно солей, до уровней, тормозящих рост бактерий). Кроме того, питательные среды для лучшего определения культуральных свойств бактерий должны быть по возможности прозрачными. Наконец, они должны быть стерильными, не содержать посторонней микрофлоры. По назначению питательные среды подразделяют на следующие основные категории.

Универсальные – среды, на которых хорошо растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий. К ним относятся: мясо-пептонный бульон (МПБ = = мясная вода + 1 % пептона + 0,5 % NaCl), мясо-пептонный агар (МПА = МПБ + + 2 – 3 % агара).

Дифференциально-диагностические – среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям. К ним относятся среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса и многие др.

Селективные (син.: избирательные, элективные, обогатительные) – среды, содержащие вещества, используемые микроорганизмами определенных видов и не благоприятствующие или даже препятствующие росту других микроорганизмов. Селективные среды позволяют направленно отбирать из исследуемого материала определенные виды бактерий. Сюда относятся среды Мюллера, селенитовая, Рапопорт, 1 %-ная пептонная вода и др.

Дифференциально-селективные – среды, сочетающие в себе свойства дифференциально-диагностических и селективных сред. Они используются, в частности, для ускорения обнаружения и идентификации бактерий, относящихся к большому числу широко распространенных видов энтеробактерий и псевдомонад (среды Сиволодского).

Специальные – среды, специально приготовленные для получения роста тех бактерий, которые не растут или очень плохо растут на универсальных средах. К ним относятся среды Мак-Коя – Чепина (для получения роста возбудителя туляремии), кровяной МПА (для получения роста патогенных стрептококков), среда Левенштейна – Иенсена (для выделения возбудителя туберкулеза) и др.

Синтетические – среды строго определенного химического состава, представляющие собой растворы неорганических солей с добавлением химических соединений, которые служат источником углерода или азота. Примером такой синтетической среды является минимальная среда М-9, в которой источником энергии и углерода является глюкоза, а азота – NH₄Cl. Синтетические среды могут быть и более сложного состава с включением различных аминокислот, оснований и витаминов.

Полусинтетические – синтетические среды, к которым добавляют какой-либо продукт природного происхождения, например сыворотку крови. Существует много различных вариантов питательных сред, сконструированных с учетом потребностей соответствующих видов бактерий и диагностических целей.

Способы культивирования

Для выращивания бактерий используют следующие способы их культивирования: стационарный, глубинный с аэрацией и с использованием проточных питательных сред.

Стационарный способ: питательные среды сохраняются постоянными, с ними никаких дополнительных манипуляций не производят. Однако при таком способе культивирования в жидких питательных средах, где преобладают анаэробные энергетические процессы, выход биомассы незначителен. Поэтому в связи с развитием микробиологической промышленности были разработаны принципиально новые способы культивирования, позволяющие получать гораздо больший выход биомассы или биологически активных соединений. К их числу относятся метод глубинного культивирования с аэрацией и метод использования проточных сред.

Метод глубинного культивирования с аэрацией. Для выращивания с помощью этого способа применяют специальные устройства – реакторы. Они представляют собой герметические котлы (приспособленные автоклавы), в которые заливается жидкая питательная среда. Реакторы снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальные рН иrН, дозированное поступление необходимых дополнительных питательных вещест²в. Однако главная особенность таких реакторов в том, что они постоянно продуваются стерильным воздухом и в них установлены мешалки, с помощью которых среда постоянно перемешивается. Поэтому во всей питательной среде создается такая концентрация свободного кислорода, при которой энергетические процессы происходят в аэробных условиях, т. е. достигается максимальное использование энергии, заключенной в глюкозе, а следовательно, и максимальный выход биомассы. Для примера: выход биомассы при стационарном методе культивирования E. coli в МПБ через 18 – 20 ч составляет 1 – 2 млрд клеток на 1 мл среды, а при глубинном методе через 12 – 14 ч – 50 – 60 млрд клеток/мл среды.

Использование проточных питательных сред позволяет создать условия, при которых клетки имеют возможность длительное время находиться в определенной фазе роста (экспоненциальной) при постоянной концентрации питательных веществ и в одних и тех же условиях, обеспечивающих непрерывный рост культуры. Методы получения непрерывных культур основаны на том, что в аппарат, где растут клетки, непрерывно добавляют свежую питательную среду и одновременно из него удаляют соответствующее количество бактерий.

Различают два типа таких аппаратов: хемостаты и турбидостаты. Хемостат – аппарат, в который постоянно из особого резервуара добавляется свежая питательная среда. Благодаря механическому перемешиванию и аэрации среды в ней создаются оптимальные условия для снабжения бактерий кислородом и вновь добавляемыми питательными веществами, по мере поступления которых часть популяции бактерий из аппарата удаляется.

Принцип работы турбидостата основан на поддержании постоянной плотности (мутности) бактериальной популяции в аппарате. Степень мутности контролируется с помощью фотоэлементов, которые через систему реле регулируют поступление питательных веществ в аппарат. Все питательные вещества в ней содержатся в избытке, и скорость роста приближается к максимальной. В таких аппаратах непрерывного культивирования микроорганизмов (АНКМ) все необходимые параметры для роста соответствующего вида микроорганизма задаются и поддерживаются с помощью специальных автоматических приборов. Благодаря сохранению неизменных условий среды непрерывная культура постоянно находится в наиболее желательной фазе роста, при которой обеспечивается максимальный выход биологически важных соединений (антибиотики, витамины, аминокислоты и т. п.) либо биомассы. Таким образом, в соответствии со способами культивирования различают периодические (при стационарном и глубинном методах культивирования) и непрерывные (при проточном способе) культуры микроорганизмов. Кроме того, при определенных условиях получают синхронные культуры, т. е. культуры, в которых все клетки одновременно (синхронно) делятся. Однако такая синхронность сохраняется, как правило, в течение 2 – 3 циклов деления, а затем она нарушается. Синхронные культуры используют в основном для изучения тех или иных стадий клеточного цикла бактерий и роли отдельных генов (и их продуктов) в их осуществлении.

Особенности роста популяции бактерий

Кинетика роста бактериальной популяции не устанавливается кинетикой роста индивидуальной клетки, хотя между ними, несомненно, существует взаимосвязь. Скорость увеличения объема индивидуальной клетки можно рассматривать как функцию времени, которое позволяет объему клетки удвоиться к концу периода между делениями. Между скоростью роста и размером клеток существуют определенные математические отношения.

Для количественной характеристики ростовых процессов в микробной популяции пользуются двумя показателями: абсолютной (валовой) скоростью и относительной (удельной) скоростью роста. Среднюю валовую скорость роста (V_ср) за отрезок времени (t₁ – t₀) можно определить по абсолютному приросту биомассы по формуле:

где m₀ – величина биомассы в начале исследуемого отрезка времени; m₁ – величина биомассы в конце исследуемого отрезка времени.

Под удельной скоростью роста (μ) понимают часовой прирост, пересчитанный на единицу растущей массы:

Скорость размножения бактерий ν (число удвоений за единицу времени) описывают уравнением:

где n – число поколений.

Продолжительность жизни одного поколения (время генерации) g в среднем составляет:

В результате логарифмирования приведенных формул и их сопоставления установлена связь удельной скорости роста с продолжительностью времени генерации и скоростью размножения клеток:

Как видно из последних формул, между временем генерации (продолжительностью жизни одного поколения) g и удельной скоростью роста μ существует обратно пропорциональная зависимость. Скорость роста микробной популяции не является величиной неизменной. В развитии микробной популяции различают следующие последовательные стадии (рис. 38): лаг-фаза; фаза положительного ускорения; фаза логарифмического роста; фаза отрицательного ускорения; стационарная фаза; фаза ускоренной гибели; фаза логарифмической гибели и фаза уменьшения скорости отмирания. Они отражают сложные процессы адаптации бактерий, привнесенных из одной среды обитания в другую, как правило, оптимальную для их размножения. Природа лаг-фазы во многом связана с тем, что в этот период происходит активный синтез всех компонентов белоксинтезирующей системы и прежде всего такого количества рибосом, которое позволило бы обеспечить максимальную активность всех биосинтетических процессов. Последующие стадии развития периодических культур отражают высокую скорость размножения бактерий. Затем, в силу постепенного истощения источника энергии и других жизненно важных метаболитов, скорость размножения бактерий уменьшается, и в стационарной фазе наступает период некоторого равновесия – количество вновь образующихся клеток становится сопоставимым с числом погибающих клеток. Вслед за этим наступает стадия, характеризующаяся постепенным уменьшением количества жизнеспособных бактерий. Это является следствием ряда причин – истощения источников энергии и других жизненно важных метаболитов, невозможности эффективно регулировать рН и rH₂ среды, накопления продуктов метаболизма, тормозящих рост, и, возможно, каких-то других факторов. Очевидно, что популяция бактерий – это тоже саморегулирующаяся система, очень зависящая от среды, истощение которой оказывает на нее отрицательное действие. Жизнеспособные клетки, перенесенные из такой среды в новую питательную среду, вновь повторяют полностью весь цикл развития популяции.

Рис. 38. Стадии роста периодической культуры:

I – лаг-фаза; II – фаза положительного ускорения; III – фаза логарифмического роста; IV – фаза отрицательного ускорения; V – стационарная фаза; VI – фаза ускоренной гибели; VII – фаза логарифмической гибели; VIII – фаза уменьшения скорости гибели.

На оси ординат показаны скорость размножения бактерий в условных единицах (слева) и величина популяции бактерий, выраженная логарифмом от числа живых клеток на 1 мл среды

Некоторые культуральные свойства бактерий

При росте на жидких питательных средах бактерии чаще всего вызывают равномерное помутнение, иногда – выпадение осадка: крошковатого (стрептококки), хлопьевидного (стрептобациллы), бульон при этом остается прозрачным. Некоторые бактерии образуют пленку на поверхности жидкой среды: сухую чешуйчато-бородавчатую (туберкулезная палочка), тонкую, нежную (холерный вибрион), рыхлую, с отходящими вниз отростками – «сталактитами» (возбудитель чумы). Еще более разнообразен рост бактерий на плотных питательных средах. Образуемые при этом колонии различаются по многим признакам: размерам, форме, консистенции, структуре, прозрачности, цвету и др.

Колонии бывают очень мелкими (0,1 – 0,5 мм), мелкими (0,5 – 3,0 мм), средних размеров (3 – 5 мм) и крупными (более 5 мм в диаметре). Они могут быть круглыми (дисковидными); плоскими; иметь форму, напоминающую львиную гриву («голову Медузы»); ризоидными и т. п. (рис. 39). Края колонии могут быть гладкими, зазубренными, фестончатыми, изрезанными. Поверхность колонии бывает гладкая или шероховатая, влажная или сухая, ровная или складчатая, плоская или выпуклая, а ее консистенция – плотная, рыхлая, слизистая. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными, непрозрачными и различаться по другим признакам, например у некоторых бактерий центр мутный, а периферическая зона полупрозрачна.

Рис. 39. Типы колоний различных видов бактерий:

1 – Bacillus pseudoanthracis; 2 – Clostridium novyi; 3 – Clostridium sporogenes; 4 – Escherichia coli; 5 – Corynebacterium diphtheriae; 6 – Fusobacterium; 7 – Brucella melitensis

Рис. 40. Колония Salmonella paratyphi B

Все эти признаки, как правило, видоспецифичны, поэтому они имеют важное диагностическое значение, т. е. их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры. Например, при определенных условиях роста колонии Salmonella paratyphi B имеют характерный слизистый валик по периферии, напоминая пуговицу с валиком (рис. 40).

Колонию бактерий можно рассматривать как своеобразный сложный организм. Изучение организации колонии выявило морфологическую и физиологическую гетерогенность входящих в нее клеток. В колониях сосуществуют популяции активно размножающихся, покоящихся клеток и клеток лизирующихся. Видовое своеобразие свойств колоний указывает на регулируемый характер процесса их формирования. Он управляется с помощью контактных, дистантных и, вероятно, иных сигналов и служит проявлением у бактерий апоптоза.

Апоптоз (греч. apoptosis – опадание лепестков цветов или листьев дерева) – форма запрограммированной клеточной гибели у эукариот, благодаря которой удаляются определенные клоны дифференцирующихся клеток или «излишки» биологического материала. Апоптоз у бактерий – аналог апоптоза эукариот – пример запрограммированного контроля над клетками на уровне популяции (колония, стационарная культура, популяции в других природных условиях). Суть его сводится к тому, что при исчерпании питательного субстрата голодающая популяция разделяется на две субпопуляции, одна из которых гибнет и подвергается автолизу, а клетки другой субпопуляции, используя продукты автолиза как субстрат, продолжают размножаться. Механизм генетического контроля апоптоза у E. coli установлен. Он осуществляется особым опероном из 2 генов: mazE и mazF. Продукт гена mazF – стабильный цитотоксический белок-киллер, а продукт гена mazE – нестабильный белок MazE, разрушающий белок-киллер. Истощение фонда аминокислот в питательной среде приводит к блокированию оперона maz, в результате этого синтез белка MazE прекращается, а белок-киллер вызывает гибель и автолиз части популяции. Фонд аминокислот в среде за счет этого пополняется, синтез белка MazE у оставшихся живых клеток активируется, и они продолжают размножаться. Таким образом, апоптоз регулирует формирование колоний и поведение клеток в стационарных культурах. Возможно, этот механизм причастен и к образованию НФБ.

Культуры некоторых видов бактерий обладают характерным запахом, иногда он связан с разложением органических веществ, которое сопровождается образованием скатола, индола, сероводорода, меркаптана, масляной кислоты, аммиака и т. п. Культуры дизентерийных бактерий при росте на МПА издают запах, напоминающий запах мужского семени. Продукты жизнедеятельности ряда других видов бактерий обладают приятным ароматным запахом, который связан с образованием различных эфиров: уксусно-этилового, уксусно-амилового или диацетила. Возбудитель мочки льна, например, издает запах ананаса. Особые расы молочнокислых бактерий придают аромат пищевым продуктам.

В природе существуют так называемые фосфоресцирующие бактерии, т. е. бактерии, культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым светом. Такие фосфоресцирующие бактерии встречаются, главным образом, в морской и речной воде. Фосфоресценция (люминесценция) продолжается иногда несколько часов и даже суток. Она представляет собой особую форму освобождения энергии возбужденных электронов. Такие бактерии нередко обнаруживаются на мясе, чешуе рыб и других объектах. К светящимся бактериям – фотобактериям – относятся физиологически сходные, но морфологически отличающиеся аэробные бактерии (вибрионы, палочки, кокки).

Пигментные микроорганизмы

Способность образовывать пигмент присуща многим видам микроорганизмов. Как уже выше упоминалось, цианобактерии, некоторые виды архебактерий, а также серные и пурпурные бактерии имеют пигменты типа хлорофилла или бактериородопсина, с помощью которых они улавливают энергию Солнца. Различные виды других бактерий образуют пигменты желтого, оранжевого, красного, синего или черного цвета. Окраска колонии может быть связана как с пигментацией самих клеток, так и с выделением окрашенных веществ в питательную среду. Интенсивность образования пигментов зависит от состава питательной среды и условий культивирования микроорганизмов. Если пигмент не растворим в воде, окрашивается только культуральный налет; если же он водорастворим, окрашивается и питательная среда. Химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды относятся к ненасыщенным углеводородам, антоцианы и меланины – к ароматическим соединениям. Биологическая роль этих пигментов заключается, во-первых, в том, что они защищают бактерии от губительного действия солнечных лучей, поэтому в воздухе так много пигментных бактерий; а во-вторых, пигменты участвуют в обмене веществ этих бактерий.

Существование генов как дискретных единиц наследственности было установлено в 1865 г. Г. Менделем, а в 1869 г. Ф. Мишер впервые выделил ДНК. Однако прошло около 80 лет, прежде чем было установлено, что носителем генов является не белок, а ДНК. Это было сделано в опытах с пневмококками. В 1928 г. Ф. Гриффитс впервые осуществил трансформацию (превращение) невирулентных пневмококков в вирулентные. Он заразил белых мышей смесью живых, но не образующих капсул невирулентных пневмококков с убитыми капсульными вирулентными пневмококками. В организме мышей бескапсульные пневмококки превратились в капсульные, вызвали их заболевание и смерть. Механизм такой трансформации оставался неясным в течение 16 лет. В 1944 г. О. Эйвери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти осуществили трансформацию бескапсульных пневмококков в капсульные in vitro. Они добавили к культуре бескапсульных пневмококков ДНК, выделенную из капсульных пневмококков, в результате чего бескапсульные превратились в капсульные и стали вирулентными для мышей. Так впервые убедительно было доказано, что носителем единиц наследственности (генов) является ДНК. Через 9 лет после этого, в 1953 г., Ф. Крик и Дж. Уотсон определили структуру гена, основанную на двойной спирали ДНК. Это открытие позволило понять, каким образом ген выполняет свои три фундаментальные функции: 1) непрерывность наследственности – благодаря полуконсервативному механизму репликации ДНК; 2) управление структурами и функциями организма – с помощью генетического кода, использующего запас всего из четырех букв (оснований): А (аденин), Т (тимин), Г (гуанин) и Ц (цитозин); 3) эволюцию организмов – благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям. Работами Ф. Крика, M. Ниренберга, С. Очоа и Х. Кораны к 1966 г. генетический код был полностью расшифрован. Он характеризуется следующими основными свойствами:

1. Код триплетный. Это означает, что кодон (функциональная единица, кодирующая аминокислоту) состоит из трех букв (оснований).

2. Код неперекрывающийся, т. е. соседние кодоны представлены отдельными самостоятельными триплетами.

3. Код вырожденный, т. е. каждая аминокислота кодируется более чем одним кодоном.

4. Число триплетов, которые не кодируют ни одной аминокислоты, т. е. «бессмысленных», мало – всего три из 64.

5. Последовательность расположения кодонов в гене определяет последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи, кодируемой данным геном.

6. Код универсален, т. е. все живые существа используют один и тот же код для записи генетической информации. Это служит прямым доказательством единства происхождения живой материи. Полный словарь РНК-аминокислотного кода представлен на рис. 41.

Рис. 41. Генетический код

Одновременно с расшифровкой генетического кода происходило и изучение механизмов, с помощью которых осуществляется реализация генетической информации, заключенной в генах. Было обнаружено, что биосинтез белка осуществляется на особых структурах – рибосомах, а информация к ним от генов поступает через особых посредников – матричные РНК (мРНК), расположение кодонов в которых и несет программу сборки аминокислот в полипептидную цепь. Было установлено также, что хромосома состоит из особых функциональных единиц – оперонов, и в общих чертах были выяснены механизмы, с помощью которых регулируется их работа. В результате всех этих исследований стало очевидным, что генетическая система обладает уникальными свойствами, во многом обусловленными двунитевой структурой молекулы ДНК. Эти свойства заключаются в способности генетической системы к: 1) самоудвоению с помощью механизма саморепликации; 2) самовыражению (экспрессии) с помощью регулируемого синтеза мРНК; 3) самообновлению с помощью мутаций, рекомбинаций и транспонируемых элементов; 4) самозащите (самоисправлению) с помощью механизмов ревизии, репарации, супрессии и др.

Примечательно, что все эти функции контролируются специальными собственными генами соответствующей генетической системы. Исключительное значение, которое принадлежит генам в происхождении и эволюции жизни, диктует необходимость дать этому понятию определение.

В узком и специальном понимании ген представляет собой структурную единицу ДНК, расположение кодонов в которой детерминирует первичную структуру соответствующей полипептидной цепи. Но это определение не очень точно, так как существуют гены не только ДНКовые, но и РНКовые. Кроме того, некоторые гены вирусов и эукариот состоят из экзонов (кодирующих участков) и интронов (нетранслируемых участков). Например, сборка полных генов иммуноглобулинов и рецепторов Т-лимфоцитов происходит в результате сложной внутригенной рекомбинации в эмбриональном периоде. Кроме того, в одном и том же фрагменте ДНК может быть по крайней мере два гена с разными рамками считывания. Следовательно, структура гена сложнее, чем ранее предполагалось. Он не всегда является строго ограниченным и пространственно фиксированным участком хромосомы. Так называемые транспонируемые генетические элементы способны в интактной форме перемещаться из одного генома в другой. Наконец, для функционирования структурных генов требуется участие особых регуляторных генетических элементов – регуляторов, операторов, промоторов и т. п. Однако гены – это структуры, свойственные только живой материи. Поэтому в определении понятия гена следует исходить из той фундаментальной роли, которую он играет в живой материи.

Ген представляет собой универсальную организующую структурную единицу живой материи, которая, благодаря содержащейся в ней закодированной информации, обеспечивает единство и многообразие всех форм существования жизни, ее непрерывность и эволюцию. Ген является единственным носителем и хранителем жизни, а его продукт – белок – определяет способ и форму существования жизни (А. И. Коротяев). Любой объект природы, имеющий набор собственных генов, следует рассматривать как живой организм. В связи с этим главным критерием, отличающим живое от неживого, является наличие у живого собственной генетической системы. Именно она обусловливает ту целесообразность поведения живых существ, которая отличает их от неживых систем. С этих позиций жизнь можно определить как форму существования всех объектов природы, обладающих собственными геномами, которые и определяют многообразие организмов, их наследственность и эволюцию (А. И. Коротяев). В основе единства и многообразия форм жизни лежит единство генетического кода и многообразие геномов живых существ. Под генетической системой понимают совокупность всех генов данного живого существа, характеризующуюся определенным уровнем структурной организации и особенностями экспрессии, т. е. реализации заложенной в генах информации. В соответствии с этим можно выделить следующие основные этапы эволюции генетической системы: кодон → ген → оперон → геном вирусов и плазмид → хромосома прокариот (нуклеоид) → хромосомы эукариот (ядро).

Очень часто, говоря о генетической системе, употребляют термин «геном». Под геномом понимают всю совокупность нуклеотидов, содержащихся в хромосоме или в наборе хромосом данного индивидуума. Объем генома у представителей различных царств жизни очень сильно варьирует. Именно от объема генома, который определяет возможное количество генов, и зависит степень сложности структурной организации данного индивидуума и, соответственно, уровень и характер проявления им своей жизни.

Под генотипом понимают всю совокупность имеющихся у данного существа индивидуальных генов. У плазмид, вирусов и бактерий бQольшая часть нуклеотидов ДНК входит в состав генов, поэтому размеры геномов у них выражают либо в молекулярной массе соответствующей геномной нуклеиновой кислоты, либо в количестве нуклеотидных пар, содержащихся в геномной нуклеиновой кислоте, либо в количестве имеющихся у них генов. Все эти значения сопоставимы, так как в среднем каждый ген состоит примерно из 1000 пар нуклеотидов, а вес одного нуклеотида ДНК составляет около 500 дальтон. Например, геном вируса гепатита В представлен двунитевой ДНК с м. м. 1,6 МД. Этот вирус имеет самое маленькое число генов среди возбудителей заболеваний человека. Его геном состоит всего из четырех генов (S, C, P и X). Геном вируса – возбудителя СПИДа представлен двумя идентичными молекулами РНК, которые состоят из 9213 нуклеотидов, образующих 9 генов. Геном бактериофага φХ174 состоит из 9 генов, у бактериофага Т4 – из 200 генов, у F-плазмиды – из 90 генов (94,5 тысяч пар нуклеотидов); у хламидий – из 400 – 600 генов, у риккетсий – из 1000 генов. Хромосома E. coli имеет молекулярную массу 2,8 ⋅ 10⁹ дальтон и содержит около 4,3 тысяч генов.

ДНК большинства растений и животных состоит из нескольких миллиардов пар нуклеотидов. Отличительная черта их геномов состоит в наличии в составе хромосомной ДНК помимо кодирующих последовательностей структурных генов некодирующих последовательностей и большого объема так называемых повторяющихся последовательностей нуклеотидов. На долю повторяющихся последовательностей, функция которых не известна, приходится от 10 до 70 % всего генома; у млекопитающих эта доля составляет в среднем 30 – 50 %.

Общий объем ДНК (генома) варьирует у разных ветвей эукариот. Геном человека составляет около 3 ⋅ 10⁹ нуклеотидных пар (н. п.). Этого количества достаточно для образования 3,0 ⋅ 10⁶ генов. В действительности же, согласно последним данным, генотип человека содержит около 30 000 – 35 000 генов, многие их которых уже картированы. Следовательно, понятия «геном» и «генотип» не равнозначны.

Под фенотипом данного индивидуума понимают всю совокупность реализованных у него генетически детерминированных признаков, т. е. индивидуальное проявление генотипа. При изменении условий существования фенотип (например, у бактерий) изменяется при сохранении генотипа.

Особенности генетики бактерий

Генетическая система бактерий имеет по крайней мере четыре особенности, присущие только этим организмам:

1. Хромосомы бактерий (и соответственно плазмид) располагаются свободно в цитоплазме, не отграничены от нее никакими мембранами, но связаны с определенными рецепторами на цитоплазматической мембране. Поскольку длина хромосомы (у E. coli около 1,6 мм) во много раз превышает длину бактериальной клетки (1,5 – 3,0 мкм в среднем), хромосома особым компактным образом в ней упакована: молекула хромосомной ДНК находится в суперспирализованной форме и свернута в виде петель, число которых составляет 12 – 80 на хромосому. Петли в центре нуклеоида объединяются за счет связывания ДНК с сердцевинной структурой, представленной молекулами особого класса РНК – 4,5S РНК. Такая упорядоченная упаковка обеспечивает постоянную транскрипцию отдельных оперонов хромосомы и не препятствует ее репликации. Возможно, что петли упакованной хромосомы способствуют компартментализации рибосом.

2. Хотя бактерии являются гаплоидными организмами, т. е. имеют один набор генов, содержание ДНК у них непостоянно, оно может при благоприятных условиях достигать значений, эквивалентных по массе 2, 4, 6 и даже 8 хромосомам. У всех прочих живых существ содержание ДНК постоянное, и оно удваивается (кроме вирусов и плазмид) перед делением.

3. У бактерий в естественных условиях передача генетической информации происходит не только по вертикали, т. е. от родительской клетки дочерним, но и по горизонтали с помощью различных механизмов: конъюгации, сексдукции, трансдукции, трансформации.

4. У бактерий очень часто помимо хромосомного генома имеется дополнительный плазмидный геном, наделяющий их важными биологическими свойствами, нередко – специфическим (приобретенным) иммунитетом к различным антибиотикам и другим химиопрепаратам.

Содержание ДНК у бактерий зависит от условий их роста: при благоприятных условиях оно возрастает до величин, соответствующих массе нескольких хромосом. Это уникальное свойство бактериального генома. Биологическое значение его состоит в том, что, регулируя содержание копий своих генов (а оно будет определяться количеством копий синтезируемых хромосом), бактерии одновременно приспосабливают скорость своего размножения к условиям роста. Наряду с увеличением содержания ДНК у бактерий в этом случае существенно возрастает и количество рибосом. Благодаря этому создаются необходимые условия для транскрипции и трансляции (а у бактерий они происходят одновременно) нескольких копий генов одновременно, возрастает суммарная скорость биосинтеза всех субклеточных и клеточных структур и соответственно скорость размножения бактерий. Время клеточного цикла бактерий сокращается от нескольких часов до 20 – 30 мин. Скорость размножения определяет возможность накопления в окружающей среде большого запаса клеток данного вида. Это и является причиной существования бактерий в природе многие миллионы лет. Возможность регулировать скорость собственного размножения – одно из главных условий, обеспечивающих выживание бактерий в окружающей среде, а следовательно, и сохранение вида в природе.

Особенности репликации бактериальной ДНК

У бактерий различают следующие типы репликации ДНК: вегетативную, конъюгативную, репаративную и стабильную. Вегетативная репликация хромосомной и плазмидной ДНК обусловливает передачу генетической информации по вертикали, т. е. по наследству – от родительской клетки дочерним. Она контролируется соответственно хромосомными и плазмидными генами. Конъюгативная репликация осуществляется при конъюгативном способе обмена генетическим материалом и контролируется только плазмидными генами. При конъюгативной репликации происходит достройка нити ДНК, комплементарной нити, передаваемой от донора реципиенту. Репаративная репликация является механизмом, посредством которого осуществляется устранение из ДНК структурных повреждений или заключительный этап генетической рекомбинации. Эти процессы контролируются хромосомными и плазмидными генами. Стабильная репликация так названа потому, что происходит независимо от наличия или отсутствия синтеза белка.

Вегететивная репликация. Репликация ДНК у бактерий начинается со строго фиксированного сайта хромосомы – оriC. Он включает в себя участки с так называемыми ДНК-боксами и расположенными между ними короткими последовательностями. Оба элемента примыкают к гену dnaA. У B. sublilis на oriC расположено 15 ДНК-боксов, с которыми связывается продукт гена dnaA. Это и служит сигналом для действия ДНК-хеликазы. Репликация имеет полуконсервативный характер, идет одновременно в двух направлениях и заканчивается также в строго фиксированной точке – terminus. Поскольку цепи ДНК антипараллельны (если одна нить начинается с 5'-конца, другая – с 3'-конца), а ДНК-полимераза III осуществляет синтез ДНК только в направлении 5' → 3', репликация происходит своеобразно (рис. 42): на одной из расплетенных нитей – «прямой», или лидерной, или ведущей, – она идет непрерывно, а на другой – отстающей – ДНК-полимераза III должна возвращаться, чтобы наращивать нить тоже в направлении 5' → 3', прерывисто, через образование сегментов Оказаки, длиной у бактерий около 1000 нуклеотидов (у эукариот – около 200 – 300 нуклеотидов).

Синтез каждого сегмента Оказаки происходит последовательно через следующие стадии (рис. 43):

1. Раскручивание нитей ДНК.

2. Расплетение (разделение нитей).

3. Стабилизация однонитевых участков.

Рис. 42. Схематическое изображение репликации ДНК прерывистой (отстающей) и непрерывной (ведущей) цепей

4. Формирование праймосомы. Праймосома – мультиферментный комплекс, в который входят фермент ДНК-праймаза и ряд других белков.

5. Синтез с участием ДНК-праймазы (англ. prime – подготавливать) затравочной РНК. Затравочная РНК необходима для синтеза каждого сегмента Оказаки потому, что сама ДНК-полимераза не способна инициировать синтез ДНК, для этого ей нужна специальная затравка, роль которой и выполняют короткие, длиной не более 10 нуклеотидов, фрагменты РНК, комплементарные ДНК-матрице.

6. Синтез сегмента Оказаки.

7. Вырезание затравочной РНК и замещение ее дезоксирибонуклеотидами, комплементарными основаниям ДНК-матрицы.

8. Сшивание сегмента Оказаки с предсуществующей нитью ДНК с помощью лигазы.

9. Суперспирализация вновь синтезированных участков нитей ДНК.

10. Ревизия ДНК-полимеразой вновь синтезированного фрагмента ДНК – нет ли ошибочного включения нуклеотидов.

Если произошла ошибка, то ошибочно включенный нуклеотид с частью этой нити вырезается и образовавшаяся брешь заполняется правильными нуклеотидами. Благодаря такой ревизии процент ошибок при репликации ДНК не превышает 1 ⋅ 10^– 9.

Скорость репликации ДНК у E. coli при температуре 37 °C соответствует включению 2 ⋅ 10³ пар нуклеотидов в 1 с. Участок хромосомы, в котором происходит разделение нитей и начинается репликация, имеет форму вилки, последовательно продвигающейся вдоль хромосомы. При благоприятных для роста бактерий условиях, когда еще не закончился один цикл репликации, могут возникать вторичные и третичные репликативные вилки, благодаря чему в клетке и происходит увеличение массы ДНК и числа копий хромосом.

Рис. 43. Схематическое изображение состава и функционирования компонентов репликативного комплекса

В осуществлении процессов репликации ДНК участвует целый комплекс ферментов, образующих единую структуру – реплисому. Наиболее важные из них указаны на рис. 43. Генетический контроль репликации ДНК осуществляется большим количеством генов (у E. coli не менее 25), локализованных в самой ДНК; это процесс саморегулируемый. Комплекс генов обеспечивает строгую временну́ю и пространственную координацию функционирования ферментов, участвующих в репликации.

Бактерии в силу относительной простоты их организации и короткого срока жизни подвергаются изменчивости быстрее, чем многие другие организмы. В основе их изменчивости лежат мутации и генетические рекомбинации, особенно протекающие с участием транспонируемых элементов.

Мутации – изменения в генотипе, которые стабильно наследуются. Мутации могут быть спонтанными или индуцированными. Спонтанные мутации возникают без каких-либо специальных воздействий, они происходят в результате ошибок при репликации и репарации. Средняя частота спонтанных мутаций составляет около 1 ⋅ 10^-6 (одна мутантная клетка на 1 млн клеток).

Индуцированные мутации происходят с гораздо большей частотой, они возникают в результате воздействия различных мутагенов. К ним относятся физические и химические факторы, повреждающие ДНК (ионизирующая радиация, УФ-облучение, различные аналоги оснований ДНК, алкилирующие соединения, акридины, антибиотики и т. п.). Молекулярные механизмы спонтанных и индуцированных мутаций одинаковы. Точечные мутации могут быть обусловлены заменой оснований, выпадением (делецией) основания или появлением дополнительного основания (вставки). Различают простую замену оснований, или транзицию, при которой пурин заменяется на пурин, а пиримидин – на пиримидин, и сложную, или трансверсию, при которой происходит замена пурина на пиримидин или наоборот. Точечные мутации могут иметь три последствия: замена одного кодона на другой, а стало быть, одной аминокислоты на другую;

сдвиг рамки считывания, что приведет к изменению целой серии последовательностей аминокислотных остатков; возникновение «бессмысленного» кодона (УАГ, УГА, УАА), что приведет к прекращению трансляции в данной точке. В результате таких точечных мутаций синтез белка может быть полностью заблокирован за счет «бессмысленного» кодона, либо будет синтезироваться измененный (неактивный) белок, что приведет либо к утрате какого-то фенотипического признака у мутанта, либо, реже, к появлению у него нового признака. Получение индуцированных мутаций (мутантов) – один из основных способов изучения генетики микроорганизмов.

Эффекты мутаций могут быть устранены либо путем репарации поврежденного участка гена, либо с помощью супрессорных мутаций, т. е. мутаций в других генах, устраняющих или нейтрализующих эффект первичной мутации. Помимо точечных мутаций, нарушение генома может быть следствием протяженных делеций, инверсии (поворот сегмента хромосомы на 180°) или транслокации (перемещение участка хромосомы из одной позиции в другую). Все это также будет приводить к изменению и нарушению различных функций клетки (организма).

Судьба мутантных организмов зависит от степени сохранения их жизнеспособности. Мутации у микроорганизмов, связанные с приобретением лекарственной устойчивости, придают им важные селективные преимущества в условиях повсеместного применения антибиотиков и различных других химиопрепаратов.

Известно, что многие белки близки по своим функциям и аминокислотной последовательности. Поэтому вполне вероятно, что они могли возникнуть от какого-то единственного предкового гена в результате процессов его дупликации и дивергенции. Возникновение новых генов путем дивергенции также играло важную роль в эволюции организмов.

Большая роль в изменчивости бактерий и других организмов принадлежит так называемым транспонируемым генетическим элементам, т. е. генетическим структурам, способным в интактной форме перемещаться внутри данного генома или переходить от одного генома к другому, например от плазмидного генома к бактериальному и наоборот. Различают три класса транспонируемых элементов: IS-элементы, транспозоны и эписомы.

IS-элементы, или вставочные последовательности (англ. insertion sequence), имеют обычно размеры, не превышающие 2 тыс. пар оснований, или 2 кб (килобаза – тысяча пар оснований). IS-элементы несут только один ген, кодирующий белок транспозазу, с помощью которой IS-элементы встраиваются в различные участки хромосомы. Их обозначают цифрами: IS1, IS2, IS3 и т. д.

Транспозоны (Tn) представляют собой более крупные сегменты ДНК, фланкированные инвертированными IS-элементами. Транспозоны также способны встраиваться в различные участки хромосомы или переходить от одного генома в другой, т. е. ведут себя как IS-элементы, но помимо генов, обеспечивающих их транспозиции, они содержат и другие гены, например гены лекарственной устойчивости.

Очень часто транспозоны содержатся в составе R-плазмид. Транспозоны обнаружены в геномах плазмид, вирусов, прокариот и эукариот, поэтому с их способностью переносить гены из одного генома в другой связывается исключительно важная роль, которую играют транспозоны и вообще транспонируемые элементы в эволюции живой материи. Транспозоны, как и IS-элементы, обозначают порядковым номером: Tn1, Tn2, Tn3 и т. д.

Эписомы. К эписомам относятся еще более крупные и сложные саморегулирующиеся системы, содержащие IS-элементы и транспозоны и способные реплицироваться в любом из двух своих альтернативных состояний – автономном или интегрированном – в хромосому клетки-хозяина.

К эписомам относят различные умеренные лизогенные фаги; они отличаются от всех других транспонируемых элементов наличием собственной белковой оболочки и более сложным циклом репродукции. Собственно эписомы – это вирусы, обладающие, подобно другим транспонируемым элементам, способностью в интактной форме переходить из одного генома в другой.

Таким образом, природа использовала все возможности, вытекающие из особенностей структуры ДНК, для эволюции живой материи: мутации генов, их дупликации, генетические рекомбинации и мобильность некоторых генетических элементов.

Хромосомная карта бактерий

Хромосомы бактерий, как правило, имеют кольцевидную структуру. Исключение составляют Borrelia burgdorferi и некоторые фитопатогенные бактерии – у них хромосомы линейные. Гены во всех хромосомах располагаются линейно, и их последовательность можно установить. Это позволит создать генетическую энциклопедию бактерий и других организмов, т. е. связать все жизненные процессы с конкретными генами. Хромосомную карту у E. coli начали составлять, изучая время переноса генов при конъюгации, которую прерывают через разные промежутки времени. Поэтому локализацию генов на хромосоме определяют в минутах их переноса от 0 до 100 мин (время полного переноса хромосомы у E. coli). За начало переноса условно принято положение гена thr (треонинового оперона). Определение локализации генов на хромосоме называется их картированием, а их расположение – хромосомной картой, масштаб которой выражается в минутах (рис. 49). К 1961 г. у E. coli было картировано 60 генов, а к 1988 г. – уже более 1000. Одновременно проводилось картирование генов и у других микроорганизмов.

Рис. 49. Сокращенная хромосомная карта E. coli K-12

Изучение организации геномов

В настоящее время изучение геномов не ограничивается только картированием генов, стало возможным изучать последовательность расположения нуклеотидов в составе любого гена. Решающими шагами на пути к решению этой проблемы явились применение особых ферментов – рестрикционных эндонуклеаз – и разработка метода клонирования генов.

Рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы) – ферменты, расщепляющие ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей, которые они распознают. Эти ферменты обнаружены у многих бактерий. Они распознают и разрушают чужеродные молекулы ДНК, попадающие в клетку, в том числе при инфицировании их фагами или при трансформации. Таких ферментов обнаружено более 100, и каждый из них распознает в ДНК специфическую последовательность из 4 – 6 нуклеотидов. Каждая рестриктаза способна разрезать двойную спираль ДНК любой длины. При этом образуется серия фрагментов, называемых рестрикционными фрагментами. Сравнение размеров этих фрагментов, полученных при обработке бактериальных или плазмидных геномов (а также ДНК хромосом эукариот), позволяет создавать рестрикционные карты, в которых отмечается локализация каждого разреза участка относительно соседних участков других таких разрезов (рестрикций). Существенно, что многие рестриктазы вносят разрывы в обе цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов. Вследствие этого на конце нити одного фрагмента образуется участок, нуклеотидные последовательности которого оказываются комплементарными нуклеотидным последовательностям другой нити с другого конца фрагмента. Такие концевые последовательности, комплементарные друг другу, получили название липких концов. С их помощью образовавшиеся рестрикционные фрагменты будут вновь образовывать кольца в результате спаривания липких концов.

Способность рестрикционных нуклеаз разрезать ДНК с образованием липких концов широко используется в технологии создания рекомбинантных ДНК, так как при помощи липких концов можно соединить два любых фрагмента ДНК, если они получены с помощью одной и той же рестриктазы и, следовательно, имеют комплементарные липкие концы. После замыкания последних путем образования комплементарных пар оснований образовавшееся кольцо из фрагментов разных ДНК можно сшить ковалентными фосфодиэфирными связями между противоположными концами каждой нити ДНК с помощью ДНК-лигазы. В этом заключается суть технологии получения рекомбинантных молекул ДНК.

Метод клонирования состоит в том, что выделенный фрагмент ДНК (ген) с помощью технологии создания рекомбинантных молекул вводится в состав самореплицирующейся генетической структуры. Чаще всего для этого используются плазмиды или вирусы. При использовании плазмид в качестве векторов для клонирования молекулы плазмидной ДНК разрезают рестриктазой, а затем сшивают с фрагментом ДНК – геном, который подлежит клонированию, т. е. накоплению. Затем такие гибридные плазмиды выделяют из клеток и, обрабатывая той же рестриктазой, вырезают из них копии исходного гена. Таким способом можно получить большое количество любого гена. Уже разработаны технологии производства трансгенных растений и животных и даже клонирования животных. Однако использовать эти достижения, конечно, нужно, только если они не причинят ущерба здоровью человека и благополучию человечества.

Последовательность расположения нуклеотидов в клонированном фрагменте ДНК изучают с помощью особой технологии секвенирования, суть которой состоит в одновременном разрезании специфическими агентами четырех образцов одной и той же ДНК по каждому из четырех оснований (А, Т, Ц и Г) с последующим разделением образующихся фрагментов в геле. С помощью этой методики можно определить полную нуклеотидную последовательность (НП) любого гена, а на основе генетического кода – аминокислотную последовательность соответствующего белка. Разработка и совершенствование методов клонирования и секвенирования позволяют изучить геном любого организма, в том числе и человека. Ранее всего был изучен геном бактериального вируса φХ174. Он состоит из 5400 нуклеотидов и содержит 9 генов. Высочайшая эффективность созданного природой генетического кода видна из следующего сопоставления. Вирус φХ174 можно увидеть только с помощью электронного микроскопа, а запись его генетической информации, содержащейся в 9 генах, в виде линейной последовательности через буквы (А, Т, Г, Ц) занимает целую страницу текста. Запись в таком же виде информации, имеющейся в хромосоме животной клетки, составит книгу объемом более 500 000 страниц!

Уже полностью изучена н. п. хромосомных ДНК у более чем сотни микроорганизмов, включая Escherichia coli, Yersinia pestis, Mycobacterium tuberculosis и др. Хромосома E. coli К-12 состоит из 4 639 000 п. н. (4288 генов), из них на кодирующую часть генома приходится 88,6 %. У других бактерий доля кодирующей части генома варьирует от 85 до 91 %. Средний размер гена – 1 к. б., у E. coli – 0,951 к. б. Хотя на некодирующие НП приходится малая часть генома, роль их, в особенности IS-элементов, транспозонов и т. п., в некоторых генетических процессах очень велика. Есть в геноме бактерий и «серые дыры», т. е. НП с неизвестной функцией. Большая чать оперонов у E. coli состоит не более чем из 3 генов, лишь 6 % оперонов состоят из 4 и большего числа генов. В хромосомах разных видов бактерий обнаружены гены-гомологи, т. е. гены с идентичной последовательностью нуклеотидов. Идентичные (=гомологичные) гены у разных видов называют ортологами. Например, около 1000 генов Bacillus subtilis имеют ортологов в геноме E. coli. Наличие ортологов – доказательство общности происхождения видов.

Для изучения генома человека, которое началось в 80-х гг. ХХ в., была создана международная организация по изучению генома человека – HUGO (англ. Human Genome Organization – Организация генома человека). Ее основная задача – определить последовательное расположение всех нуклеотидов (а их около 3 ⋅ 10⁹ пар) во всех 23 парах хромосом – была успешно решена к концу 2000 г. Предстоит теперь выяснить функции всех генов, молекулярные основы наследственных и иных болезней, связанных с нарушением работы генов, и определить пути лечения таких болезней, в том числе с использованием методов генной инженерии. Рано или поздно генотерапия станет вполне реальной. Полное осуществление программы «Геном человека» – новое блестящее достижение науки в области биологии и медицины.

Впервые обнаруженные у E. coli генетические элементы, которые передавались у нее по наследству во внехромосомном состоянии, получили название просто генетических факторов. Раньше всего были обнаружены Col-фактор (фактор, контролирующий у E. coli синтез бактерицидных белков, А. Грациа, 1925) и F-фактор (фактор, контролирующий примитивный половой процесс у бактерий – конъюгацию, У. Хэйс, 1953). Интерес к этим факторам сильно возрос после того, как в 1963 г. японский ученый Т. Ватанабе сообщил, что передача множественной лекарственной устойчивости у дизентерийных бактерий происходит также при участии независимых от хромосомы генетических элементов, названных R-факторами (англ. resistance – устойчивость). В 1976 г. всем подобного рода генетическим элементам было дано название плазмид и следующее определение: «Плазмида (экстрахромосомный генетический элемент) представляет собой репликон, который стабильно наследуется в экстрахромосомном состоянии». Однако это определение обходит вопрос о том, являются ли плазмиды организмами или нет, оно оставляет открытым вопрос о месте плазмид в живой природе.

Поскольку плазмиды имеют собственные гены, которые наделяют их специфическими наследственными признаками и способностью к размножению, они должны быть несомненно отнесены к живым организмам. Плазмиды обладают большим сходством с вирусами, поэтому их следует объединить с ними в одно царство в качестве самостоятельного класса. С вирусами их объединяют следующие общие фундаментальные признаки: 1) подобно вирусам, плазмиды не имеют собственной белоксинтезирующей системы; 2) как и у вирусов, у них нет собственной системы мобилизации энергии; 3) плазмиды, как и вирусы, не способны к росту и бинарному делению, они размножаются путем воспроизведения себя из собственного генома (путем саморепликации его); 4) плазмиды, подобно вирусам, являются абсолютными внутриклеточными паразитами.

Вместе с тем плазмиды существенным образом отличаются от вирусов, и поэтому они должны рассматриваться как самостоятельная, обособленная от вирусов группа организмов. Главные отличия плазмид от вирусов следующие:

1. Геном плазмид представлен только двунитевой ДНК, у вирусов же имеется более 10 вариантов РНК– и ДНК-геномов. Правда, у некоторых грамположительных бактерий плазмиды существуют не только в виде двунитевых молекул ДНК, но и в виде однонитевых. Однако каждая из них соответствует одной из двух нитей плазмидной ДНК (на долю таких однонитевых молекул приходится не более 1/3 общего количества копий плазмиды), и в результате репликации, происходящей по типу «крутящегося кольца» (см. главу 11), однонитевая молекула превращается в двунитевую молекулу плазмидной ДНК.

2. Плазмиды, в отличие от вирусов и других микроорганизмов, вообще не имеют никакой оболочки. Они представляют собой «голые» геномы. Это их главная биологическая особенность.

3. В связи с отсутствием белковой оболочки размножение плазмид происходит только путем саморепликации их ДНК и не требует синтеза структурных белков и процессов самосборки.

4. Средой обитания вирусов являются клетки бактерий, растений и животных. Средой обитания плазмид – только бактерии.

5. Плазмиды обладают системами генов, которые наделяют их способностью к самопереносу или к мобилизации на перенос из клетки в клетку.

6. Плазмиды и вирусы отличаются друг от друга и по тем последствиям, к которым приводит инфицирование ими клеток. Заражение вирусами в большинстве случаев приводит к подавлению функционирования клеточного генома. Вирулентный вирус размножается в клетке и вызывает ее гибель или нарушает нормальное функционирование (при персистировании). Только умеренные фаги при лизогенизации бактерий наделяют их дополнительными свойствами.

В отличие от вирусов, плазмиды, проникая в бактериальную клетку, не размножаются в ней бесконтрольно и не подавляют функции бактериальной хромосомы, а сосуществуют с ней и сами контролируют образование числа возможных своих копий на хромосому клетки. В отличие от вирусов, плазмиды не только не вызывают гибели клеток, которые являются для них естественной средой обитания, а, наоборот, очень часто наделяют их важными дополнительными (селективными) свойствами. Это основное принципиально важное биологическое различие между плазмидами и вирусами. Зараженная вирусом клетка ценой собственной жизни способствует размножению вирусов. Плазмиды, наоборот, своим присутствием обеспечивают размножение бактерий в неблагоприятных для них условиях (например, в присутствии химиопрепаратов) и, спасая от гибели бактерии, обеспечивают собственное существование.

По уровню молекулярно-генетической организации плазмиды занимают еще более низкое, по сравнению с вирусами, место в иерархии живой материи. С учетом всех этих обстоятельств им можно дать следующее общебиологическое определение: плазмиды – наипростейшие организмы, лишенные оболочки, собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии и представляющие собой особый класс абсолютных внутриклеточных паразитов, наделяющих своих бактерий-хозяев полезными для них свойствами (А. И. Коротяев).

В соответствии с теми свойствами, которыми плазмиды наделяют своих носителей, их подразделяют на различные группы (табл. 4).

У бактерий очень часто обнаруживают криптические плазмиды, т. е. плазмиды, функции которых еще не установлены. Поэтому классификация их, несомненно, будет уточняться. Уже сейчас известны плазмиды, контролирующие различные факторы патогенности бактерий (факторы адгезии, инвазии и т. п.).

Существуют два основных способа определения плазмид у бактерий:

1) биологический – по тем дополнительным признакам, которыми они наделяют своего хозяина;

2) биофизический – по выявлению плазмидных ДНК.

Для изучения биологии плазмид и их молекулярно-генетической организации широко используют различные генетические методы, методы клонирования, выделения чистых плазмидных ДНК, определения их молекулярных масс, составление рестриктограмм путем разрезания различными эндонуклеазами и определения размеров получаемых фрагментов, а также секвенирования. Сами по себе плазмиды, благодаря их относительно малым размерам и способности к саморепликации, часто используются в качестве векторов для клонирования различных генов и их последующего изучения.

Все известные плазмиды представляют собой кольцевидные суперспирализованные молекулы двунитевой ДНК, размеры которых варьируют от 1,5 до 200 МД и более (от 1500 до 400 000 пар нуклеотидов). Однако чаще всего встречаются плазмиды с м. м. 3 – 6 или 50 – 70 МД.

Таблица 4

Классификация плазмид по свойствам, которыми они наделяют своих носителей

В соответствии с размерами плазмидной ДНК ее молекулярно-генетическая организация характеризуется определенным уровнем сложности. Чем больше молекулярная масса, тем больше и сложнее набор генов, тем многообразнее функции плазмид. Они несут гены саморепликации; гены, контролирующие самоперенос или мобилизацию на перенос; другие гены, определяющие специфические функции самой плазмиды.

Кроме того, в ДНК плазмид могут быть гены, которые наделяют клетку-хозяина многими другими свойствами. Очень часто эти гены интегрируются в плазмидную ДНК в виде транспозонов, поэтому молекулярно-генетическая организация плазмид, особенно высокомолекулярных, очень сложна. Часть генетической карты одной из наиболее часто используемых для изучения генетики плазмид – плазмиды рКМ101, представлена на рис. 50. Для плазмид как живых существ характерны следующие свойства, частью присущие только им и контролируемые их специфическими генами:

1. Саморегулируемая репликация. Эта функция свойственна всем живым организмам. В составе плазмидных ДНК имеются фиксированная точка ori (точка начала репликации) и соответствующие гены, контролирующие репликацию. Репликация мелких плазмид требует, очевидно, дополнительного участия генов клетки-хозяина.

2. Явление поверхностного исключения. Этот механизм не позволяет проникнуть в клетку, уже содержащую плазмиду, другой родственной ей плазмиде. Поверхностное исключение обеспечивается синтезом под контролем генов плазмиды особых белков наружной мембраны, которые препятствуют установлению контакта этой клетки с клеткой, несущей такую же плазмиду, или подавляют конъюгативный метаболизм ДНК этой плазмиды.

Рис. 50. Молекулярная организация плазмиды pKM101. Конъюгативная плазмида pKM101 IncN-группы является производной плазмиды R46, у которой утрачена область генов, контролирующая устойчивость к антибиотикам. Широко используется для изучения механизмов генетической регуляции плазмидных функций

3. Явление несовместимости. Суть его заключается в том, что две близкородственные плазмиды не могут стабильно сосуществовать в одной клетке, одна из них подвергается элиминации (удалению).

4. Контроль числа копий плазмиды на хромосому клетки. Различают малокопийные (1 – 4 копии) и многокопийные плазмиды (12 – 38 копий, например у плазмиды R6K). Наличие собственных генов репликации позволяет плазмиде осуществлять последнюю независимо от каких-либо событий хромосомной репликации или клеточного цикла клетки-хозяина.

Информация, необходимая для осуществления репликации плазмиды, обычно заключена в небольшой участок ее ДНК, получивший название основного, или базового, репликона. У малокопийных плазмид он состоит из 2,0 – 2,5 т. п. н., а у многокопийных – из 1 т. п. н. Система, которая регулирует репликацию, контролирует также и число копий, и явление несовместимости. Этот контроль осуществляется путем саморегуляции процессов транскрипции и трансляции генов репликации, опосредуемой продуктами их собственных генов: «антисмысловыми» РНК и особыми белками.

5. Контроль стабильного сохранения плазмид в клетке-хозяине (контроль стабильного поддержания).

6. Контроль равномерного распределения дочерних плазмид в дочерние бактериальные клетки. Последние две функции тесно взаимосвязаны. Природные бактериальные плазмиды стабильно сохраняются в клетке-хозяине. Это указывает на то, что их распределение между дочерними клетками происходит не рандомически, т. е. не по принципу случайности, а существует генетический механизм контроля не только репликации, но и равномерного распределения (сегрегации) вновь синтезированных плазмид при клеточном делении. Гены, осуществляющие этот контроль, независимы от системы контроля репликации. Более того, эти гены даже взаимозаменяемы у разных плазмид без утраты своих функций. Функции стабильного поддержания и равномерного распределения опосредуются различными механизмами. Взаимосвязь этих функций с жизнью клеткихозяина настолько важна для плазмид и клеток, что клетки, утратившие плазмиду, погибают. Плазмида «вынуждает» клетку-хозяина даже ценой собственной жизни обеспечивать ее воспроизводство и распространение по вертикали и горизонтали. У F-плазмиды обнаружены гены типа hok (англ. host killing – убивающие хозяина), продукты которых вызывают быструю гибель клетки, утратившей плазмиду (в содержащих плазмиды клетках действие этих продуктов репрессировано другим геном плазмиды). Следовательно, носительство плазмид для клетки-хозяина становится генетически необходимым, благодаря этому обеспечивается существование плазмид как организмов.

7. Способность к самопереносу (у конъюгативных плазмид).

8. Способность к мобилизации на перенос (у неконъюгативных плазмид).

9. Способность наделять клетку-хозяина дополнительными важными для него биологическими свойствами, способствующими выживанию бактерий, а следовательно, и плазмид в природе.

Жизненный цикл плазмид складывается из двух главных процессов: вегетативной (или конъюгативной) репликации и равномерного распределения между дочерними клетками. Оба эти процесса относительно независимы друг от друга и контролируются специфическими системами плазмид. Однако вегетативная репликация плазмид и распределение их между дочерними клетками скоординированы с клеточным делением так, что дочерняя клетка стабильно получает необходимое число копий данной плазмиды.

Распространение плазмид

Плазмиды распространяются среди бактерий двумя способами: путем передачи от родительской клетки дочерним клеткам в процессе клеточного деления, т. е. по вертикали, и путем переноса между клетками в популяции бактерий независимо от клеточного деления, т. е. по горизонтали. Существует несколько генетических механизмов переноса плазмид между бактериальными клетками:

а) путем трансформации;

б) с помощью трансдуцирующих фагов;

в) путем мобилизации на перенос с помощью конъюгативных плазмид;

г) с помощью механизма самопереноса, контролируемого системой генов, объединенных в tra-оперон.

В зависимости от наличия или отсутствия этого оперона плазмиды делятся на конъюгативные и неконъюгативные. Основную роль в широком распространении плазмид играет механизм конъюгационной передачи.

Системы tra-оперонов у разных конъюгативных плазмид имеют определенное сходство, что свидетельствует о том, что они возникли, очевидно, из одного общего предшественника. Однако у разных конъюгативных плазмид они существенно различаются как по количеству tra-генов, так и по характеру их локализации (рис. 51; см. рис. 50). Наиболее подробно система tra-оперона изучена у F-плазмиды, которая является наиболее типичным представителем конъюгативных плазмид. Ее главное биологическое назначение у энтеробактерий – обеспечение их донорными функциями. Именно F-плазмиды контролируют у них конъюгативный обмен генетическим материалом. F-плазмида состоит из 94,5 тыс. пар нуклеотидов и имеет около 90 генов (см. рис. 51). Система tra-генов у F-плазмиды имеет следующий состав: oriT finO traO traM finP traJ traY traA traL traE traK traB traP traV traW traC traU traN traF traQ traH traG traS traT traD traI traZ.

Рис. 51. Генетическая карта F-плазмиды

Область oriТ – точка начала переноса F-плазмиды при конъюгации. Гены traY – traZ (21 ген) образуют оперон переноса. Область traJ finP traM traO finO участвует в регуляции транскрипции и конъюгативного метаболизма ДНК плазмиды; traО – оператор для гена traJ (белок TraJ участвует в позитивной, а белок FinP вместе с finO – в негативной регуляции tra-оперона). Продукты генов traT и traS опосредуют поверхностное исключение. В системе tra-генов F-плазмиды три самостоятельных оперона: traY – traZ, traJ finP и traM.

Классификация плазмид

В основу современной классификации плазмид положено такое их уникальное генетическое свойство, как несовместимость – неспособность родственных плазмид стабильно сосуществовать в одной клетке. Она проявляется после проникновения плазмиды в клетку, уже содержащую близкородственную ей плазмиду.

Плазмиды, несовместимые друг с другом, но совместимые с другими, объединяются в одну Inc-группу (англ. incompatibility – несовместимость); Inc-группа соответствует биологическому виду в других группах организмов. Плазмиды энтеробактерий разделены на 39 Inc-групп (табл. 5).

Многочисленными наблюдениями установлено, что плазмиды, относящиеся к одной и той же Inc-группе, обладают многими общими признаками, в то время как плазмиды, принадлежащие к разным Inc-группам, существенно отличаются по свойствам. В частности, плазмиды одной и той же группы имеют сходную молекулярную массу, высокую степень гомологии ДНК, показывают одинаковые или очень сходные рестриктограммы при обработке их соответствующими рестриктазами. Плазмиды одной и той же группы наделяют клетку способностью синтезировать морфологически подобные и серологически родственные донорные ворсинки, которые не только служат аппаратом конъюгационного переноса плазмид, но и являются специфическими рецепторами для донорспецифических фагов. Такие фаги прикрепляются либо к кончикам ворсинок, либо по их сторонам и вызывают лизис плазмидсодержащих клеток. О близком родстве плазмид, принадлежащих к одной и той же Inc-группе, свидетельствует также изучение их физических и генетических карт. В частности, области репликации плазмид, относящихся к одной и той же Inc-группе, также очень сходны структурно и функционально. Поскольку внутри Inc-групп выявляется тесное филогенетическое родство между ее членами, группа несовместимости как таксономическая единица приравнивается к такой категории как вид. Принадлежность выявленных плазмид к той или иной Inc-группе определяется с помощью метода ДНК-зонда; донорспецифических фагов, а также путем конъюгации бактерий, несущих прототипные плазмиды, с бактериями, несущими исследуемую плазмиду, и последующего установления факта их сосуществования (совместимости) или вытеснения одной из них (несовместимости). Обязательным условием для последнего метода является наличие селективных признаков у каждой из скрещиваемых бактерий – хозяев этих плазмид. Селективными являются признаки, которыми плазмида специфически наделяет клетку-хозяина.

Таблица 5

Inc-группы, выявленные среди плазмид энтеробактерий

Медицинское и общебиологическое значение плазмид

Значение плазмид для медицины состоит в том, что они контролируют синтез различных факторов патогенности у многих видов бактерий, в том числе у возбудителей чумы, сибирской язвы, иерсиниозов, дизентерии, эшерихиозов и др. Не вызывает сомнения, что возникновение диареегенных кишечных палочек (энтеротоксигенных, энтеропатогенных, энтероинвазивных и др.) является следствием приобретения ими плазмид, которые наделяют их факторами адгезии, инвазии и способностью синтезировать термолабильные и термостабильные энтеротоксины. Наличие в природе таких плазмид (особенно с широким кругом хозяев) может стать причиной образования новых вариантов патогенных бактерий.

Не менее важную роль играют R-плазмиды. В условиях широкого применения антибиотиков и других химиопрепаратов происходит естественный отбор тех штаммов патогенных бактерий, которые являются носителями R-плазмид. Среди них формируются новые эпидемические клоны патогенных бактерий. В настоящее время они играют ведущую роль в эпидемиологии инфекционных болезней, и от их распространения во многом зависит эффективность антибиотико– и химиотерапии, а в итоге – здоровье и жизнь людей.

Общебиологическое значение плазмид заключается в том, что они выполняют по крайней мере три важнейшие функции для бактерий, обеспечивая одновременно существование как бактерий, так и собственное. Во-первых, они контролируют у бактерий обмен генетическим материалом. Во-вторых, контролируя синтез факторов патогенности, они обусловливают благоприятные возможности для размножения патогенных бактерий в естественных для них условиях (в организме животного и человека), а следовательно, для сохранения этих видов в природе. В-третьих, плазмиды являются уникальным биологическим средством самозащиты бактерий, так как они обеспечивают их приобретенным и наследуемым специфическим иммунитетом против различных химических (лекарственных и иных веществ) и других агентов.

Таким образом, представляя собой особую группу наиболее просто организованных живых существ, плазмиды сохраняются в природе благодаря взаимовыгодным отношениям, сложившимся между ними и бактериями. Бактерии для них – естественная среда обитания, а они для бактерий – дополнительные свободно циркулирующие между ними геномы с наборами таких генов, которые благоприятствуют сохранению бактерий в природе.

«Мириады микробов населяют стихии и повсюду окружают нас. Незримо они сопутствуют человеку на всем его жизненном пути, властно вторгаясь в его жизнь то в качестве врагов, то как друзья. В громадном количестве они встречаются в пище, которую мы принимаем, в воде, которую пьем, и в воздухе, которым мы дышим. Окружающие нас предметы, наша одежда, поверхность нашего тела, все это буквально кишит микробами, среди которых встречаются и болезнетворные виды», – так образно охарактеризовал микрофлору, которая нас окружает, выдающийся русский микробиолог В. Л. Омелянский. По-видимому, в биосфере нет такой среды, в которой не встречались бы микроорганизмы. Всюду, где есть хотя бы какие-то источники энергии, углерода и азота, обязательно встречаются и микроорганизмы, различающиеся по своим физиологическим потребностям и свойствам. Именно это разнообразие, в основе которого лежит способность использовать любые, даже минимальные возможности для своего существования, исторически обусловило вездесущность микроорганизмов. С другой стороны, активная жизнедеятельность мириадов микроорганизмов, их гигантская роль в круговороте веществ в природе имеют исключительное значение для поддержания (сохранения) динамического равновесия всей биосферы, нарушение которого привело бы к катастрофическим последствиям.

Естественной средой обитания микроорганизмов служат в первую очередь почва, вода и воздух. Они заселяют также кожные покровы и сообщающиеся с внешней средой слизистые оболочки человека и животных.

Везде и всюду микроорганизмы сосуществуют в виде сложных ассоциаций – биоценозов, представленных многими и разнообразными видами, между которыми складываются своеобразные взаимоотношения. Особенности этих взаимоотношений таковы, что они обеспечивают существование всех многочисленных видов бактерий и в конечном счете всего царства прокариот, которое, в свою очередь, сосуществует с другими царствами жизни на Земле.

Микрофлора почвы

Почва – среда обитания многочисленных видов микроорганизмов и крупнейший резервуар их в природе. Количество микробов в 1 г почвы измеряется обычно сотнями и тысячами миллионов клеток. Оно варьирует от 200 млн в глинистой почве до 5 млрд в черноземной почве. В 1 г пахотного слоя почвы содержится 1 – 10 млрд бактерий, а в слое ее толщиной 15 см на площади в 1 га может содержаться от 1 до 5 – 6 тонн микробной массы. Даже в песках пустынь, где почти отсутствует влага, содержится до 100 000 микробов в 1 г. Численность и видовой состав их в почве зависят от содержания в ней органических веществ и влаги, структуры почвы, способа ее сельскохозяйственной обработки, климатических условий, характера растительного покрова, степени загрязнения почвы отходами хозяйственной деятельности человека и многих других факторов. Состав микрофлоры почвы складывается из различных комбинаций бактерий (сотни и тысячи видов), грибов, простейших и вирусов. Фактически она содержит представителей всех царств жизни – вирусов, архебактерий, эубактерий и эукариот во всем их многообразии, которое зависит от действия многих факторов.

Самый поверхностный слой почвы содержит ограниченное число микробов из-за действия солнечных лучей и высушивания. Главная масса микробов содержится на глубине 10 – 20 см, в нижележащих ее горизонтах количество микроорганизмов уменьшается, и на глубине 5 – 6 метров почва может быть уже стерильной, так как распространению микробов в глубину препятствует высокая поглотительная способность почвы.

Почва постоянно загрязняется различными отбросами, выделениями человека и животных, мертвыми растениями и животными. Огромная роль в процессах самоочищения почвы и в круговороте веществ в природе принадлежит микроорганизмам. В превращении органических веществ, поступающих в почву и образующихся в ней, принимают участие различные группы микробов: гнилостные, нитрифицирующие, азотфиксирующие, денитрифицирующие и др.

Патогенные микроорганизмы попадают в почву с испражнениями, мочой, гноем, мокротой, слюной и другими выделениями, с трупами людей и животных, погибших от инфекционных заболеваний. Попадая в почву, значительная часть патогенных микроорганизмов, не образующих спор, рано или поздно погибает. Сроки выживания в почве возбудителей кишечных инфекций (дизентерии, брюшного тифа, холеры), чумы, бруцеллеза, туляремии, туберкулеза широко варьируют и составляют от нескольких часов до нескольких месяцев. Отмирание патогенных бактерий в почве зависит от ряда причин: высушивания; отсутствия необходимых питательных субстратов; действия антибиотических веществ, вырабатываемых почвенными бактериями и грибами; солнечных лучей; бактериофагов и т. п. Значительно дольше в почве сохраняются спорообразующие патогенные бактерии – аэробные (споры B. anthracis сохраняются в почве свыше 15 лет) и анаэробные – возбудители столбняка, газовой гангрены, ботулизма (их споры также сохраняются в почве многие годы, а при благоприятных условиях прорастают и бактерии размножаются, поддерживая тем самым свое существование в почве). Поэтому почва играет основную роль в эпидемиологии столбняка, газовой гангрены (особенно в военных условиях) и ботулизма, она является основным резервуаром возбудителей этих заболеваний.

Микрофлора воды

Вода, как и почва, является естественной средой обитания для многих видов микроорганизмов всех царств жизни. Разнообразные микроорганизмы обитают как в воде открытых водоемов, так и в грунтовых водах: палочки, кокки, вибрионы, спириллы, спирохеты, различные фотосинтезирующие бактерии, грибы, простейшие, вирусы и плазмиды. Многие виды галофильных бактерий обитают в морских водах. Численность микроорганизмов в воде определяется главным образом содержанием в ней органических веществ, которые под влиянием микроорганизмов подвергаются совершенно таким же превращениям, как и в почве. В 1 мл воды количество микробов может превышать несколько миллионов. Грунтовые подземные воды чище, так как, просачиваясь через почву, вода подвергается своеобразной фильтрации, в результате которой большинство микробов задерживается в фильтрующем слое. Численность микроорганизмов в воде открытых водоемов подвержена колебаниям и зависит от климатических условий, времени года, а главным образом, от степени загрязнения рек, озер и морей сточными и канализационными водами и отходами промышленных, агропромышленных и других предприятий. В реки, озера, моря из прибрежных городов и других населенных пунктов выбрасывается такое количество сточных вод, несущих мириады микробов и содержащих огромное количество органических веществ, что вода не успевает самоочищаться.

В результате возникла и сохраняется серьезная глобальная экологическая проблема.

По степени микробного загрязнения различают три категории воды (или зоны водоема):

1. Полисапробная зона – наиболее сильно загрязненная вода, бедная кислородом, богатая органическими веществами. В 1 мл воды содержание микроорганизмов достигает 1 млн и более, преобладают E. coli и анаэробные бактерии, вызывающие процессы гниения и брожения.

2. Мезосапробная зона – вода, загрязненная умеренно, в ней активно происходит минерализация органических веществ с интенсивными процессами окисления и нитрификации. Содержание микроорганизмов в 1 мл воды – сотни тысяч бактерий, количество E. coli значительно меньше.

3. Олигосапробная зона – зона чистой воды, количество микроорганизмов в 1 мл воды – десятки или сотни, не более; E. coli отсутствует или встречается в количестве нескольких клеток на 1 л воды.

Питьевая вода считается хорошей, если общее количество бактерий в 1 мл – не более 100; сомнительной – 100 – 150; загрязненной, – если содержание бактерий в 1 мл 500 и более. Количество микроорганизмов в придонном слое ила озер и рек варьирует в пределах от 100 до 400 млн на 1 г.

Вода играет исключительно важную роль в эпидемиологии многих инфекционных заболеваний, особенно кишечных (брюшного тифа, дизентерии, сальмонеллезов, холеры, вирусных гепатитов, полиомиелита и т. п.), возбудители которых выделяются вместе с испражнениями от больных и носителей и вместе со сточными водами поступают в воду открытых водоемов, а оттуда нередко и в питьевую воду. Хотя патогенные бактерии слабо приспособлены к существованию в воде, где на них оказывают неблагоприятное действие солнечный свет и различные другие факторы, включая конкурентную водную микрофлору, многие из них могут достаточно длительное время сохраняться в воде. Более того, в летнее время при наличии в воде органических веществ, щелочной рН и благоприятной температуры некоторые из них, в том числе холерный вибрион, могут даже размножаться. Заразиться можно и через лед, в котором патогенные бактерии могут сохраняться в течение нескольких недель и даже месяцев.

Загрязненная вода – главный источник заражения холерой, дизентерией, брюшным тифом и другими кишечными инфекциями, а также лептоспирозом и, нередко, туляремией.

Микробиологические методы исследования воды сводятся к определению общего количества микроорганизмов в 1 мл воды и выявлению тех или иных видов патогенных бактерий (особенно холерного вибриона). Кроме того, поскольку прямое выделение патогенных бактерий из воды требует специальных исследований, существуют косвенные методы, позволяющие дать количественную оценку степени фекального загрязнения воды (см. раздел «Санитарная микробиология и ее значение», гл. 16).

Микрофлора воздуха

Воздух как среда обитания для микроорганизмов менее благоприятен, чем почва и вода, так как в нем не содержится или содержится очень мало питательных веществ, необходимых для размножения микроорганизмов. Кроме того, на них сильнее действуют такие неблагоприятные факторы, как высушивание и ультрафиолетовые лучи солнечного света. Тем не менее, попадая в воздух, многие микроорганизмы могут сохраняться в нем более или менее длительное время. Воздух особенно загрязнен вблизи земной поверхности, а с высотой он становится все более чистым. На степень загрязнения воздуха микробами влияют и климато-географические условия. Больше всего микробов в атмосфере содержится летом, меньше всего – зимой. Главным источником загрязнения воздуха является почва, в меньшей степени – вода.

В воздухе в естественных условиях обнаруживаются сотни видов сапрофитных микроорганизмов, представленных кокками (в том числе сарцинами), споровыми бактериями и грибами, отличающимися большой устойчивостью к высушиванию и к другим неблагоприятным воздействиям внешней среды, например действию солнечных лучей. Нужно различать воздух открытых пространств (он относительно чист, так как сказывается действие солнечных лучей, высушивания и других факторов) и воздух закрытых помещений. В последних факторы самоочищения действуют слабее, поэтому и загрязненность может быть значительно больше. В воздухе закрытых помещений, особенно если они плохо проветриваются, накапливается микрофлора, выделяемая через дыхательные пути человека. Патогенные микроорганизмы попадают в воздух из мокроты и слюны при кашле, разговоре и чихании. Даже здоровый человек при каждом акте чихания выделяет в воздух 10 000 – 20 000 микробных тел, а больной – иногда во много раз больше.

Заслуга выяснения механизма передачи возбудителей заболеваний через воздух принадлежит П. Н. Лащенкову. Он одним из первых установил, что при чихании, кашле и разговоре в воздух выбрасывается множество капелек жидкости, внутри которых содержатся микроорганизмы. Особенно важно, что эти мельчайшие капельки могут часами удерживаться в воздухе во взвешенном состоянии, т. е. образуют стойкие аэрозоли. В этих капельках за счет влаги микроорганизмы выживают дольше. Таким воздушно-капельным способом происходит заражение многими острыми респираторными заболеваниями, в том числе гриппом и корью, а также коклюшем, дифтерией, легочной чумой и т. д. Этот путь распространения возбудителей – одна из основных причин развития не только эпидемий, но и крупных пандемий гриппа, а в прошлом и легочной чумы.

Помимо капельного способа, распространение патогенных микробов через воздух может осуществляться «пылевым» путем. Находящиеся в выделениях больных (мокроте, слизи и т. п.) микроорганизмы окружены белковым субстратом, поэтому они более устойчивы к высыханию и другим факторам. Когда такие капли высыхают, они превращаются в своеобразную бактериальную пыль (внутри белкового субстрата сохраняются и выживают многие патогенные бактерии). Частички бактериальной пыли имеют обычно диаметр от 1 до 100 мкм. У частиц диаметром более 100 мкм сила тяжести превышает сопротивление воздуха, и они быстро оседают. Скорость переноса бактериальной пыли зависит от интенсивности сил воздушных перемещений. Пылевой путь играет особенно важную роль в эпидемиологии туберкулеза, дифтерии, туляремии и других заболеваний.

Количество микробов в воздухе варьирует в больших диапазонах – от нескольких бактерий до десятков тысяч их в 1 м³. В 1 г пыли может содержаться до 1 млн бактерий. Большое значение имеет чистота воздуха в операционных, реанимационных и перевязочных отделениях хирургических госпиталей. Общее количество микробов в операционной до операции не должно превышать 500 в 1 м³, а после операции – 1000 в 1 м³.

Для исследования микрофлоры воздуха используют различные методы: седиментационный (метод Коха), фильтрационный (воздух продувают через воду) и методы, основанные на принципе ударного действия воздушной струи с использованием специальных приборов (В. С. Киктенко, Л. М. Соколинского [и др.]). Последние методы наиболее надежны, так как позволяют точно определить количественное загрязнение воздуха микроорганизмами и изучить их видовой состав.

В настоящее время в биотехнологической промышленности широко используются различные микробы-продуценты, в том числе генетически модифицированные формы их. Поскольку эта технология связана с неизбежными периодическими выпусками (интродукциями) в открытую систему (воздух, вода, почва) генетически измененных форм микроорганизмов, возникает важный вопрос об их дальнейшей судьбе и о возможном влиянии на биосферу и человечество. Несомненно, этот вопрос как часть общего вопроса охраны окружающей среды должен решаться в глобальном плане.

Роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе

Предполагается, что в предбиологический период атмосферные газы находились в восстановленном состоянии: азот – в форме аммиака (NH₃); кислород – в составе воды (H₂O); углерод – в форме метана (СН₄). Современное их состояние в виде окисленных форм: азота и кислорода в форме простых газов (N₂ и О₂), а углерода в виде оксида углерода (СО₂) – в значительной степени является следствием активности живых организмов, в том числе микробов. Количественное содержание в атмосфере N₂, O₂ и СО₂, других химических элементов, обнаруженных на поверхности Земли и необходимых для жизни, отражает равновесие между их образованием и использованием в биологических и геологических процессах. Эти превращения происходят во всей биосфере, т. е. в той тонкой оболочке жизни на поверхности Земли, которая охватывает океаны, моря, пресные водоемы, почву континентов и нижнюю часть атмосферы и в которой только и содержатся живые организмы. Общего количества главных химических элементов, необходимых для жизни, в частности углерода и азота, имеющихся в атмосфере, при их одностороннем потреблении вряд ли хватило бы на миллионы лет.

Биосфера находится в более или менее устойчивом состоянии благодаря непрерывному притоку солнечной энергии и постоянному круговороту углерода, кислорода, азота, серы и фосфора. В целом эти процессы выглядят так. С помощью солнечной энергии фотосинтезирующие организмы превращают СО₂ и другие неорганические вещества в глюкозу и другие органические соединения, которые прямо или косвенно служат источником энергии для всех других организмов. В свою очередь фотосинтезирующие организмы – одноклеточные водоросли (в основном, диатомовые и динофлагелляты), обитающие в океане, и высшие растения, растущие на суше, – служат источником питания для животных. Поэтому основные биологически важные элементы сохраняются в органическом состоянии в ходе превращений, которые приводят к включению этих элементов в клетки и ткани животных. Чтобы снова стать доступными для фотосинтезирующих организмов, органические вещества должны снова перейти в неорганическую форму, т. е. подвергнуться минерализации. Эти превращения происходят из-за разложения (гниения) растительных и животных остатков, осуществляемого главным образом микроорганизмами. Подсчитано, что минерализация 90 % органического углерода, т. е. превращение его в СО₂, осуществляется микроорганизмами. Остальные 10 % СО₂ образуются в результате дыхания других организмов, а также за счет сгорания топлива и других материалов. Микроорганизмы, благодаря легкости их расселения по воздуху и воде, распространены по всей биосфере, и вследствие их чрезвычайно высокой метаболической активности они играют главную роль в химических превращениях, которые происходят на поверхности Земли. Подсчитано, что метаболический потенциал микроорганизмов в верхнем 15-сантиметровом слое одного гектара хорошо удобренной почвы в любой момент времени эквивалентен метаболическому потенциалу нескольких десятков тысяч людей.

Другим важным фактором, определяющим роль микроорганизмов в природе, является высокая скорость их размножения при благоприятных условиях.

Под круговоротом веществ в природе понимают циклические превращения химических элементов, из которых построены живые существа, происходящие вследствие разнообразия и гибкости метаболизма микроорганизмов. По-видимому, в природе нет таких органических веществ, которые не разрушались бы теми или иными микроорганизмами.

Круговорот азота и микробы, участвующие в нем

Запасы азота в природе очень велики. Он входит в состав всех организмов на Земле. Общее содержание его в организмах составляет более 25 млрд тонн, большое количество азота находится также в почве. Но еще более грандиозен запас азота в атмосфере: над каждым гектаром почвы поднимается столб воздуха, содержащий около 80 000 тонн молекулярного азота. Ежегодно на образование вновь вырастающих растений требуется около 1,5 млрд тонн азота в форме, доступной для усвоения растениями. Имеющегося в воздухе и почве азота хватило бы для обеспечения урожая, даже при одностороннем использовании, на несколько миллионов лет. Однако растения часто дают низкие урожаи именно из-за недостатка азота в почве. Это объясняется тем, что только небольшая группа азотистых соединений может быть быстро усвоена растениями. Не только свободный азот, но и многие формы связанного азота не могут служить источником азотного питания для растений. Азот, поступающий в виде белковых веществ в почву вместе с остатками растений и животных, совсем не годится для этих целей, он должен быть подвергнут минерализации, а образующийся при этом аммиак должен быть окислен в соли азотистой и азотной кислот. В основе процессов круговорота азота лежат следующие биохимические процессы: гниение белков, разложение мочевины, нитрификация, денитрификация и фиксация атмосферного азота.

Гниение, или аммонификация белков, – микробиологический процесс, при котором под воздействием гнилостных микроорганизмов происходит гидролитическое расщепление белков, поступающих в почву с трупами животных и отмирающими растениями, с образованием промежуточных продуктов (альбумоз, пептонов, амино– и амидокислот), а также дурно пахнущих веществ – индола, сероводорода, меркаптана, летучих жирных кислот.

Конечным продуктом гидролиза белков и дезаминирования аминокислот является NH₃, почему этот процесс и называется аммонификацией белка. Таким образом, при гниении происходит минерализация белковых веществ, которая в зависимости от химического состава белков субстрата, вида гнилостных бактерий и условий их жизнедеятельности может быть полной или не доведенной до конца. При полной минерализации белка образуются H₂O, CO₂, NH₃, H₂S и минеральные соли. При широком доступе кислорода продукты гидролиза белков подвергаются полному окислению, зловонных веществ образуется значительно меньше, чем при анаэробных условиях. Такой процесс называется тлением.

Гниение – преимущественно анаэробный процесс, при котором полного окисления некоторых продуктов, например жирных кислот, не происходит. Гнилостные микробы широко распространены в почве, воде, воздухе, в животных и растительных организмах. Поэтому любой продукт, не защищенный от них, быстро подвергается гниению. Его вызывают как анаэробные, так и аэробные микроорганизмы, причем они могут действовать и преемственно, и одновременно. Наиболее энергичными возбудителями гниения, сопровождающегося глубоким распадом белка и образованием азотистых и безазотистых соединений (индола, скатола, жирных кислот, NH₃, H₂, H₂S и др.), являются Bacillus mycoides, B. subtilis, B. mesentericus, бактерии семейства Enterobacteriaceae (Proteus, Escherichia и др.), а также Clostridium putrificum, C. sporogenes. Последние два – анаэробы, содержатся в кишечнике и после смерти вызывают зловонное разложение трупов.

Процессы гниения протекают только при наличии условий, благоприятных для жизнедеятельности их возбудителей (влажность, температура и т. п.). В сухой песчаной почве трупы подвергаются мумификации (высушиванию без гниения). Гнилостные процессы происходят и в организме человека, в частности в кишечнике; причиной их являются E. coli и другие микробы. По мнению И. И. Мечникова, продукты гниения (скатол, индол и др.), постоянно образующиеся в организме, вызывают хроническую интоксикацию и являются одной из причин преждевременного старения.

Гнилостные процессы протекают также при газовой гангрене: ткани, омертвевшие под влиянием образуемых возбудителями этой болезни экзотоксинов, заселяются гнилостными аэробными и анаэробными бактериями и подвергаются распаду. Некоторые гнилостные процессы используются в промышленности с полезной целью, например при выработке кожи для отделения от нее шерсти – швицевании.

Исключительное значение процессов гниения заключается в том, что они играют важную роль в естественном самоочищении почвы и воды. Этим пользуются при строительстве специальных очистных сооружений (полей ассенизации, орошения и т. п.) для биологической переработки и обезвреживания фекальных нечистот и сточных вод, содержащих много мертвых белковых субстратов. Гниение ведет к обогащению почвы азотистыми продуктами.

Большое количество связанного азота поступает в почву также в виде мочевины (диамида угольной кислоты) – NH₂– CO – NH₂. Ежегодно люди и животные выделяют ее около 20 млн тонн. Но мочевина не может быть непосредственно использована в качестве азотного продукта для питания растений. Она подвергается также аммонификации, которую вызывают различные уробактерии. При этом вначале образуется нестойкая углеаммиачная соль, которая далее расщепляется с образованием NH₃, CO₂ и H₂O.

Мочевая кислота, выделяемая в почву птицами и рептилиями, также быстро минерализуется особыми группами микроорганизмов с образованием NH₃ и CO₂.

Следующим важным этапом круговорота азота вслед за образованием NH₃ является процесс нитрификации, т. е. окисление NH₃ вначале в азотистую, а затем в азотную кислоту, соли которых наиболее пригодны для азотного питания растений. Процесс нитрификации вызывается двумя группами открытых С. Н. Виноградским нитрифицирующих бактерий. Нитрозобактерии окисляют NH₃ до азотистой кислоты:

а нитробактерии окисляют азотистую кислоту в азотную:

Нитрифицирующие бактерии – строгие аэробы, хемолитотрофы. Энергию окисления они используют для восстановления CO₂ в гексозу. Благодаря нитрифицирующим бактериям в почве могут образовываться огромные скопления солей азотной кислоты в виде селитры (в Чили, Перу). Завершая процесс минерализации белковых веществ, нитрифицирующие бактерии играют исключительно важную роль и в процессах самоочищения почвы и воды, и в санитарно-гигиенических устройствах (поля орошения и т. п.). Таким образом, нитрифицирующие бактерии способствуют повышению урожайности почвы благодаря накоплению в ней азотнокислых солей.

Однако в почве происходят и противоположные процессы, т. е. денитрификации, или восстановления микроорганизмами солей азотной кислоты в соли азотистой кислоты и в другие простые азотистые соединения, вплоть до свободного азота, который уходит в атмосферу.

Способностью восстанавливать нитраты в нитриты обладает большое количество видов бактерий и грибов. Денитрификация протекает в три фазы:

1) 2HNO₃ → 2HNO₂ + O₂;

2) 2HNO₂ → промежуточные соединения + О₂;

3) промежуточные соединения → N₂ + H₂O + O₂.

Рис. 52. Круговорот азота (по Р. Стейнеру и [др.])

Окисление азота показано сплошными стрелками; восстановление – точечными стрелками; реакции без изменения валентности – пунктирными стрелками

Денитрифицирующие бактерии (в частности, некоторые виды Pseudomonas) в анаэробных условиях используют денитрификацию как основную форму дыхания. Для них соли азотной и азотистой кислот служат источниками азота. Энергию для своей специфической деятельности денитрифицирующие бактерии получают из органических веществ, которыми богата почва. Денитрифицирующие бактерии наносят вред сельскому хозяйству, так как способствуют обеднению почвы минеральным азотом и переходу свободного азота в атмосферу. Особенно энергично процессы денитрификации развиваются в слежавшейся, плохо аэрируемой почве. Однако убыль азота из почвы, вызванная активностью денитрифицирующих бактерий, компенсируется деятельностью свободноживущих аэробных и анаэробных и клубеньковых азотфиксирующих бактерий. Более 90 % азота связывают азотфиксирующие бактерии: на каждый гектар почвы ежегодно от 25 до 300 кг азота привносят только они.

Так, при самом активном участии многих видов микроорганизмов, происходит непрерывный круговорот азота, поддерживающий существование жизни на Земле (рис. 52).

Круговорот углерода

Процессы распада безазотистых органических веществ обусловлены по преимуществу жизнедеятельностью микроорганизмов, а процессы созидательные – фотосинтезом зеленых растений, водорослей и фотосинтезирующих бактерий. Ежегодно зеленые растения потребляют около 60 млрд тонн углекислого газа (или 20 млрд тонн углерода), а в атмосфере содержится около 600 млрд тонн углерода. Таким образом, его при одностороннем использовании хватило бы всего на 30 лет. Только благодаря непрерывному круговороту сохраняется равновесие между потреблением углерода и его выделением в атмосферу. В основе процессов распада безазотистых органических веществ лежат различные формы брожения, которые постоянно происходят в природе. Брожение – анаэробное дыхание, при котором микроорганизмы используют выделяющуюся энергию для своей жизнедеятельности.

Спиртовое брожение углеводов вызывают дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), некоторые виды бактерий (Sarcina ventriculi) и отдельные представители мукоровых грибов рода Mucor. При спиртовом брожении молекула гексозы распадается на этанол и углекислый газ:

Это уравнение отражает лишь конечный результат. В ходе брожения образуется много промежуточных продуктов – гексозомонофосфат, фруктозодифосфат, фосфотриозы, фосфоглицериновая кислота, фосфопировиноградная кислота, пировиноградная кислота, уксусный альдегид и, наконец, этиловый спирт.

Спиртовое брожение широко используется в промышленности для производства вина и пива, а также в хлебопечении. Для этих целей применяют определенные расы дрожжей в виде чистых культур. Дрожжи для заквашивания теста впервые были использованы около 6000 лет назад в Египте, а затем этот способ получения хлеба постепенно распространился по всему свету. Способ перегонки спирта был открыт, согласно литературным данным, в Китае или арабских странах. Винокуренные заводы в Европе появились в середине VII в. Вначале спирт использовали только для приготовления напитков, а затем в связи с развитием промышленности он стал широко применяться как растворитель и химическое сырье.

При содержании в сбраживаемом растворе более чем 30 % сахара часть его остается неиспользованной, так как при этих условиях образуется до 15 % спирта, а при такой концентрации спирт подавляет жизнедеятельность дрожжей. Поэтому натуральные вина содержат не более 15 % спирта. Главное преимущество чистых культур дрожжей заключается в том, что брожение виноградного сока протекает и заканчивается быстро, а отсутствие посторонней микрофлоры позволяет получать вина хорошего вкуса и аромата (с хорошим «букетом»).

По окончании брожения молодое вино стабилизируют и дают ему созреть. Эти процессы занимают несколько месяцев, а при изготовлении высококачественных красных вин – даже несколько лет.

В течение первого года во многих красных винах происходит второе, спонтанное брожение – яблочно-молочнокислое, которое вызывается рядом молочнокислых бактерий (Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus). В результате этого яблочная кислота винограда превращается в молочную кислоту и СО₂, т. е. дикарбоновая кислота превращается в монокарбоновую, и кислотность вина уменьшается, оно становится высококачественным. Игристые вина типа шампанского подвергают второму спиртовому брожению под давлением, добавляя в вино сахар. Образующийся СО₂ газирует вино. Второе брожение вызывается различными винными дрожжами, которые после брожения образуют комки и легко удаляются. Вино типа «Херес» крепят добавлением спирта до 15 % и выдерживают на воздухе; на его поверхности интенсивно размножаются определенные дрожжи, что придает вину специфический вкус. В некоторых районах Франции для приготовления десертных вин виноград заражают грибом Botrytis cinerea, а к виноградному суслу добавляют глюкофильные дрожжи, которые сбраживают глюкозу, но не разрушают более сладкой фруктозы, и получается сладкое десертное вино.

Распространенные в природе дикие расы дрожжей рода Torula часто причиняют вред бродильной промышленности, вызывая помутнение и горький вкус напитков.

Уксуснокислое брожение – биологический окислительный процесс, при котором с помощью уксуснокислых бактерий спирт окисляется в уксусную кислоту. Если какуюлибо жидкость, содержащую небольшое количество спирта (вино, пиво), оставить открытой, то в ней постепенно появляются уксусная кислота и кожистая пленка (уксусная матка) на поверхности. Уксуснокислые бактерии объединены в род Acetobacter, содержащий ряд видов и подвидов. Этиловый спирт под влиянием уксуснокислых бактерий подвергается окислению, в результате которого вначале образуется уксусный альдегид, а затем – уксусная кислота. При использовании специальных рас уксуснокислых бактерий максимальный выход уксуса достигает 14,5 %. Уксуснокислые бактерии превращают ряд многоатомных спиртов в сахар. Одна из таких реакций используется для получения сорбозы из сорбитола. Сорбоза – промежуточный продукт синтеза аскорбиновой кислоты. Она применяется в качестве суспендирующего агента при изготовлении многих лекарственных препаратов. Уксуснокислые бактерии могут наносить вред в виноделии и пивоваренной промышленности, вызывая прокисание вина и пива.

Молочнокислое брожение – широко распространенное биохимическое явление, давно известное на примере скисания молока. Под влиянием молочнокислых бактерий (семейство Lactobacillaceae) лактоза расщепляется на составляющие ее гексозы – глюкозу и галактозу, которые затем специфическими ферментами превращаются в молочную кислоту. Свертывание молока происходит вследствие того, что молочная кислота отщепляет кальций от казеина, белок превращается в параказеин и выпадает в осадок. Молочнокислые бактерии широко распространены в природе. Они обнаруживаются в молоке, воздухе, на коже, шерсти, в тонком и толстом кишечнике и представлены большим количеством видов палочковидных и кокковидных бактерий, различающихся не только по морфологии, но и по физиологическим свойствам (по использованию различных источников углерода и азота). Различают две группы возбудителей молочнокислого брожения:

1) возбудители типичного молочнокислого брожения (гомоферментативного брожения):

2) возбудители нетипичного (гетероферментативного) молочнокислого брожения:

К первой группе относятся бактерии, которые образуют значительное количество молочной кислоты, превращение сахара в молочную кислоту происходит без образования побочных продуктов (или образуются только следы их). Образование молочной кислоты происходит быстро и интенсивно, а белки гидролизуются до аминокислот. Возбудители типичного молочнокислого брожения – Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus caucasicus, Lactobacillus acidophilus и другие виды. С помощью чистых культур истинных молочнокислых бактерий получают высококачественные сорта молочнокислых продуктов.

Наряду со спиртовым молочнокислое брожение имеет большое значение в пищевой промышленности. Целый ряд молочнокислых, спирто-молочнокислых и кислоовощных продуктов получают благодаря жизнедеятельности молочнокислых бактерий или их комбинации с дрожжами:

обыкновенная простокваша – S. lactis;

мечниковская простокваша – S. lactis + L. bulgaricus;

ацидофильное молоко – L. acidophilus;

кефир – L. caucasicus + S. lactis + дрожжи (Torula) (молочнокислое и спиртовое брожение, содержание спирта до 0,2 %);

кумыс – из сырого кобыльего молока – L. bulgaricus + S. lactis + Torula (молочнокислое и спиртовое брожение, содержание молочной кислоты около 1 %, спирта до 2,5 %);

йогу́рт – L. bulgaricus + Streptococcus thermophilus;

сыры – первичное молочнокислое брожение при температуре 35 °C – S. lactis или S. cremoris, при температуре 42 °C – различные термофильные молочнокислые бактерии, в основном Lactobacillus. Получение сливочного масла также связано с микробиологическим процессом, так как вначале происходит молочнокислое брожение молока, вызываемое L. bulgaricus, а затем для отделения жира в процессе сбивания необходимо предварительное скисание сливок, которое вызывают стрептококки молока. Они образуют небольшое количество ацетоина, который спонтанно окисляется до диацетила, обусловливающего вкус и запах масла.

Сметана, творог, квашеная капуста, хлебный квас и другие продукты получают при участии молочнокислых бактерий.

К возбудителям нетипичного (гетероферментативного) молочнокислого брожения относятся E. coli, Enterobacter aerogenes и другие бактерии. Наряду с молочной кислотой (она получается в небольших количествах и медленно) эти бактерии образуют и другие продукты брожения: углекислый газ, водород, уксусную, пропионовую кислоты и другие соединения. Эти бактерии осуществляют более глубокое расщепление белков, вплоть до органических соединений и аммиака. Гетеромолочнокислому брожению принадлежит большая роль при силосовании зеленых кормов. Маслянокислое брожение также широко встречается в природе. Возбудитель маслянокислого брожения был открыт Л. Пастером. На примере маслянокислого брожения Л. Пастер разработал учение об анаэробах. Типичный представитель бактерий маслянокислого брожения – азотфиксирующий Clostridium pasteurianum. Маслянокислые бактерии в больших количествах встречаются в почве, навозе, на растениях, в молоке, сыре. Многие из них являются анаэробами и относятся к роду Clostridium.

Маслянокислое брожение – сложный биохимический процесс расщепления углеводов, в ряде случаев жиров и белков, на масляную кислоту, углекислоту и воду:

При этом образуется много побочных продуктов – уксусная, молочная, пропионовая и другие кислоты.

Из числа других форм брожения чрезвычайно важным является брожение целлюлозы (клетчатки), в которой заложены огромные запасы углерода. Разложение целлюлозы, которая в количественном отношении представляет собой один из основных компонентов растительных тканей, осуществляется главным образом высоко специализированными в отношении питания аэробными и анаэробными микроорганизмами. Среди аэробных бактерий, расщепляющих целлюлозу, наиболее важны скользящие бактерии рода Cytophaga. Целлюлоза – единственное вещество, которое они могут использовать в качестве источника углерода. Цитофаги быстро растворяют и окисляют целлюлозу.

Общая схема важнейших типов брожения представлена на рис. 53. Факультативные анаэробы, в том числе представители семейства Enterobacteriaceae, образуют при брожении в первую очередь органические кислоты: уксусную, муравьиную, янтарную и молочную, а также этанол, глицерин, ацетоин; 2,3-бутандиол, CO₂ и H₂. Основные продукты брожения углеводов, которые образуют строгие спорообразующие анаэробы, – масляная кислота, бутанол, ацетон, изопропанол, другие органические кислоты и спирт. Процессы брожения используют для промышленного производства некоторых из этих продуктов, например бутандиола.

Рис. 53. Суммарная схема важнейших типов брожения (по Г. Шлегелю)

Участие микроорганизмов в круговороте серы, фосфора и железа

Сера – составная часть некоторых белков. Одним из конечных продуктов гниения белков является H₂S. Сероводород не усваивается высшими растениями. Биохимические превращения серы восстановительного и окислительного порядка осуществляются серобактериями. Для них H₂S является источником энергии. Серобактерии окисляют H₂S с выделением свободной серы, которая отлагается у них в цитоплазме в виде капель:

В клетках бактерий сера окисляется далее до серной кислоты:

Образующиеся сульфаты (соли H₂SO₄) служат прекрасным питательным веществом для высших растений. H₂S в серную кислоту окисляют различные виды пурпурных серобактерий:

Наряду с такими сульфурирующими бактериями в природе не менее широко распространены и десульфурирующие микробы (аналоги денитрифицирующих бактерий), они восстанавливают сульфаты, вызывая образование H₂S. Выделение H₂S десульфурирующими бактериями происходит в глубинах морей, поэтому в Черном море на глубине 2500 м содержание H₂S доходит до 6,5 мл в 1 л воды. Значительное накопление H₂S в результате биологического восстановления серы наблюдается в целебных грязях, в лиманах и других водоемах. В санитарном отношении серобактерии являются важными агентами начальной стадии биологического очищения сточных вод и разложения органических отбросов, содержащих серу. Большинство серобактерий принадлежит к родам Thiobacillus, Sulfolobus и Thiospira. Общая схема круговорота серы представлена на рис. 54. Кроме биологического круговорота серы в атмосфере происходят небиологические превращения ее газообразных форм. Согласно некоторым подсчетам, в атмосферу ежегодно выделяется около 90 млн тонн серы в виде H₂S, образующегося биологическим путем. Кроме того, еще 50 млн тонн поступает в атмосферу в виде SO₂, образующейся при сжигании топлива, и около 0,7 млн тонн в форме H₂S и SO₂, возникающих в результате действия вулканов. В атмосфере H₂S быстро окисляется до SO₂ атомарным (О) и молекулярным (О₂) кислородом или озоном (О₃). SO₂ может растворяться в воде с образованием H₂SO₃ или окисляться медленно до SO₃, которая при растворении в воде превращается в H₂SO₄. Основная масса H₂SO₄ вместе с неокисленной H₂SO₃ возвращается на землю в форме кислоты, которая становится причиной разрушения различных каменных строений, в том числе многих каменных скульптур.

С химической стороны круговорот фосфора достаточно прост, поскольку он встречается в живых организмах только в пятивалентном состоянии в виде свободных фосфатных ионов (РО₄^{3 —}) или в составе органических фосфатных компонентов клетки. Бактерии не способны поглощать большинство органических фосфорсодержащих соединений, свои потребности в фосфоре они удовлетворяют путем поглощения фосфатных ионов, из которых затем синтезируют органические фосфатные соединения. При разложении гнилостными бактериями белковых веществ одновременно с минерализацией азота происходит превращение органического фосфора в фосфатные ионы. Поскольку большая часть фосфатов, несмотря на быстрый круговорот фосфора, находится в виде нерастворимых солей кальция, железа или алюминия, фосфаты также служат

Рис. 54. Круговорот серы (по Р. Стейнеру [и др.])

Окисление атома серы показано сплошными стрелками; восстановление – точечными стрелками; реакции без изменения валентности – пунктирными стрелками

фактором, ограничивающим рост растений. Растворимые фосфаты постоянно переносятся из почвы в море вследствие выщелачивания. Этот перенос имеет однонаправленный характер. Лишь небольшая часть фосфатов возвращается на сушу, главным образом в виде отложений гуано морскими птицами. Поэтому доступность фосфатов для растений зависит от непрерывного перевода в раствор нерастворимых фосфатных отложений – процесса, в котором важную роль играют микроорганизмы. Образуемые ими кислые продукты метаболизма (органические кислоты, а также азотная и серная) растворяют фосфат кальция, а образуемый ими H₂S способствует растворению фосфата железа. В круговороте в природе железа большую роль играют железобактерии, для которых железо служит источником окислительного дыхания (донором электронов). Железобактерии окисляют закисные соединения в окисные, а освобождающуюся энергию используют для усвоения углерода из СО₂ или карбонатов. Окисление протекает по формуле:

Из железобактерий лучше других изучена не образующая спор подвижная палочка Thiobacillus ferroxidans, которая окисляет и серу. К железобактериям относятся некоторые нитчатые бактерии из рода Leptothrix, а также Gallionella, состоящая из спиральных, закрученных в виде пучков тонких (0,01 – 0,3 мкм) нитей, образующих стебелек, на поверхности которого откладывается гидрат окиси железа. Нитчатые железобактерии в водоемах прикрепляются к различным подводным предметам. Нити бактерий одеты слизистым влагалищем, которое пропитывается гидратом окиси железа. Размножаясь в некоторых озерах в огромных количествах, железобактерии образуют накопления железной руды (например, в Карелии). При размножении в водопроводах железобактерии могут вызывать закупорку просвета труб.

Этапы круговорота различных элементов осуществляются микроорганизмами разных групп. Непрерывное существование каждой отдельной их группы зависит от химических превращений элементов, осуществляемых другими группами микроорганизмов. Разрыв цикла в какой-либо одной точке привел бы к прекращению жизни на Земле. Жизнь непрерывна на Земле потому, что все основные элементы, необходимые для ее проявления (C, N, H, O, P, S), подвергаются циклическим превращениям, во многом благодаря деятельности микроорганизмов.

Ребенок развивается в полости матки в стерильных условиях и рождается стерильным. Но уже с первых минут после рождения он вступает в контакт с микрофлорой окружающей среды, и в течение короткого времени его кожные покровы и слизистые оболочки, сообщающиеся с внешней средой, заселяются разнообразными микроорганизмами из воздуха, а также в результате контакта с матерью, обслуживающим персоналом родильного дома и предметами ухода. В результате этого формируется новая экологическая система – организм человека + населяющая его микрофлора. Эта система очень динамична, так как взаимоотношения в ней – симбиоз микроорганизмов с макроорганизмом – могут носить характер мутуализма, комменсализма или паразитизма.

Под мутуализмом понимаются такие взаимоотношения, которые имеют взаимовыгодный характер, т. е. микроорганизмы питаются за счет своего хозяина, но не только не причиняют ему никакого вреда, а, напротив, приносят пользу, например синтезируют для него витамины.

Комменсализм – форма сосуществования, при которой микроорганизмы питаются за счет своего хозяина, не нанося ему особого ущерба. Но при известных условиях комменсалы, которыми обычно являются условно-патогенные бактерии, могут стать виновниками различных, чаще всего гнойно-воспалительных, заболеваний (стафилококки, стрептококки, грамотрицательные бактерии).

Паразитизм – существование микроорганизмов за счет хозяина, сопровождающееся нанесением ему серьезного ущерба в виде того или иного заболевания.

Нормальная, т. е. в условиях здорового организма, микрофлора в количественном и качественном отношении представлена на различных участках тела неодинаково. Причина этого – неодинаковые условия обитания на коже и слизистых оболочках разных органов. Заселение тела человека микроорганизмами происходит в результате оседания пыли и проникновения их вместе с вдыхаемым воздухом, принимаемой пищей и т. д. Общее количество микроорганизмов, обнаруживаемых у взрослого человека, достигает 10¹⁴, что почти на порядок больше числа клеток всех тканей человека. В разных участках человеческого тела в соответствии с условиями обитания формируются ассоциации (биотопы) микроорганизмов, состоящие из разнообразных видовых сочетаний. На слизистых оболочках, особенно желудочно-кишечного тракта, представители нормальной микрофлоры обитают в виде двух форм: часть из них располагается в просвете, другая часть заключена в высокогидратированный матрикс, который состоит из экзополисахаридномуциновых компонентов, образуя своеобразную биопленку. Заключенные в эту биопленку микроорганизмы обладают по сравнению с просветными более высокой устойчивостью к действию физических, химических и биологических факторов. В случае, когда эти факторы подавляют компенсаторные возможности экологической системы (хозяин и его микрофлора), могут возникать микроэкологические нарушения, результатом которых могут быть различные патологические состояния и другие неблагоприятные последствия (формирование антибиотикоустойчивых и атипичных штаммов, образование новых микробных биотопов и т. п.).

Микрофлора кожи. Кожные покровы обильно заселены микроорганизмами, особенно места, защищенные от действия света и высыхания (подмышечные впадины, межпальцевые и паховые складки, промежность). Количество бактерий на 1см² варьирует от нескольких единиц до сотен тысяч особей. По расчетам П. Ремленже, общее число микробов на коже одного человека колеблется от 100 млн до 1 млрд клеток. Существенное значение имеет гигиеническое содержание кожных покровов. Наиболее постоянен состав микрофлоры не на поверхности кожи, где он нередко имеет случайный характер, а в глубоких слоях ее, в области устьев сально-волосяных фолликулов. Наиболее частыми представителями кожной микрофлоры являются Staphylococcus epidermidis, S. saprophyticus и грибы рода Candida, реже встречаются дифтероиды, микрококки. На кожных покровах условия для размножения бактерий не очень благоприятны, так как на них губительно действуют высыхание, десквамация эпителия, образующиеся перекиси, кислая рН и другие антимикробные факторы. При нормальном состоянии кожных покровов человек не ощущает присутствия на них микроорганизмов, но при травмах, потертостях, потливости, экзематозных поражениях они тотчас же дают о себе знать, вызывая процессы гнилостного разложения, отторжения эпидермиса, воспаление сальных и потовых желез и нагноительные процессы. Сдвиг пропорции микрофлоры кожи в сторону увеличения доли грамотрицательных бактерий служит указанием на нарушение ее нормального состава.

Микрофлора верхних дыхательных путей представлена стрептококками, дифтероидами, моракселлами, псевдомонадами. Основная масса микрофлоры ротои носоглотки приходится на долю зеленящего стрептококка (до 99 % всех микроорганизмов). Постоянно, но в меньшем количестве, встречаются нейссерии, коринебактерии (дифтероиды) и стафилококки. На состав микрофлоры оказывают влияние бактерицидные вещества слюны (лизоцим, ингибин), фагоцитарная активность лейкоцитов, адсорбционные свойства слизи и ресничек эпителиальных клеток. При спокойном дыхании человек с каждым вдохом поглощает от 1500 до 14 000 и более микробных клеток, но все они задерживаются в верхних отделах дыхательных путей (это было доказано исследованиями плеврального воздуха при естественном пневмотораксе). Слизистая оболочка гортани, трахеи, бронхов и альвеолы здорового человека не содержат микроорганизмов.

Микрофлора мочеполового тракта менее обильна, но по видовому составу разнообразна и представлена стафилококками, дифтероидами, стрептококками, микобактериями, бактероидами, фузобактериями. В наружных отделах половых органов и мочевыводящих путей чаще всего обнаруживаются микобактерии смегмы и фузобактерии. Во влагалище здоровых женщин преобладают молочнокислые палочки Додерлейна и дифтероиды, значительно реже встречаются стрептококки, стафилококки, пептострептококки, клостридии и грамотрицательные палочки. Число бактерий в мочеполовом тракте значительно уменьшается по мере удаления от его наружных отделов. Полость матки, фаллопиевы трубы и мочевой пузырь здоровых людей обычно микробов не содержат. На состав микрофлоры мочеполового тракта оказывают влияние бактерицидные свойства секретов половых путей, а у женщин – высокая кислотность влагалищного секрета (рН 4,0 – 4,6), которая регулируется молочнокислой палочкой Додерлейна (разные виды рода Lactobacillus) за счет образуемой ею молочной кислоты при расщеплении углеводного компонента слизи, прежде всего гликогена. Кислая среда угнетает рост стафилококков и грамотрицательных бактерий.

Микрофлора желудочно-кишечного тракта. Микрофлора полости рта представлена многочисленными видами аэробных и анаэробных микроорганизмов, так как для них здесь имеются вполне благоприятные условия – щелочная реакция слюны, наличие пищевых остатков, благоприятная для размножения температура (37 °C). Сразу после рождения ребенка в его ротовой полости формируется аэробная флора – кокки, палочки; с прорезыванием зубов появляются анаэробные бактерии, в том числе вибрионы, спириллы, спирохеты, клостридии. В полости рта происходит непрерывное загрязнение микробами и самоочищение под влиянием лизоцима, ингибина и других факторов, вследствие чего формируется более или менее постоянная микрофлора, наиболее частыми представителями которой являются стафилококки, стрептококки, грибы Candida, лактобактерии, нейссерии, спирохеты, вибрионы, постоянно присутствуют анаэробы – вейллонеллы, бактероиды, пептострептококки. Иногда из слюны здоровых людей выделяют простейших, аспергиллы, дрожжи и другие микроорганизмы (см. также гл. 73).

Пищевод у здоровых людей обычно свободен от микроорганизмов или заселен ими очень мало.

Желудок. В связи с кислой реакцией среды, неблагоприятной для развития микроорганизмов, в желудке прижилась специфическая микрофлора: дрожжи, сарцины, грибы, лактобактерии, стафилококки, стрептококки, кампилобактерии и др., но не гнилостные бактерии (всего до 30 видов). Изменение состава микрофлоры, в частности появление гнилостных бактерий, – признак нарушения нормальной функции желудочной секреции.

Тонкий кишечник. Микрофлора не обильная и довольно однообразная: лактобактерии, энтерококки, бифидумбактерии, E. coli и некоторые другие. Размножению бактерий препятствуют бактериостатическое действие желчи, секретов слизистой оболочки и секреторные иммуноглобулины класса IgAs. В ряде случаев, например в связи с нарушением желудочной секреции или с повреждением слизистой оболочки кишечника в результате радиационного облучения, или вследствие заболевания печени, желчных путей и поджелудочной железы, или иммунодефицита, у людей развивается синдром избыточной колонизации тонкого кишечника. Он заключается в том, что в тонкой кишке резко увеличивается концентрация бактериальной популяции, аналогичной по видовому и количественному составу микрофлоре толстого кишечника. Такое накопление в тонком кишечнике необычной для него микрофлоры может привести к различным нарушениям его функции и к явлениям энтеральной недостаточности.

Микрофлора толстого кишечника наиболее обильна и многообразна. Особенности условий обитания для микроорганизмов в толстом кишечнике состоят в том, что это орган не секреторный, а экскреторный, в нем отсутствует лизоцим, лимфоидная ткань представлена менее мощно, в то же время здесь благоприятные рН, температура, обилие питательных веществ и т. п. Формирование микрофлоры толстого кишечника начинается с первым вздохом ребенка, но в первые три дня, пока ребенок питается молозивом (молоко, обогащенное иммуноглобулинами матери), в толстом кишечнике размножаются разнообразные, в том числе гнилостные, бактерии. Как только он начинает питаться грудным молоком матери, гнилостные бактерии исчезают и формируется постоянная микрофлора, в которой преобладают бактерии, образующие при ферментации глюкозы молочную кислоту. В толстом кишечнике обнаружено более 260 видов бактерий, общая биомасса их составляет около 1,5 кг.

Микрофлору толстого кишечника можно разделить на четыре следующие группы:

• Основную массу микрофлоры составляют строгие анаэробы, не образующие спор: грамположительные бактерии рода Bifidobacterium и грамотрицательные бактерии семейства Bacteroidaceae. На долю бифидобактерий и бактероидов приходится до 96 – 99 % всей микрофлоры толстого кишечника. Они выделяются из испражнений даже при разведении 10^– 12– 10^– 10 степени.

• Вторую группу составляют факультативные анаэробы, представленные главным образом грамотрицательной E. coli и грамположительными энтерококками и молочнокислыми палочками рода Lactobacillus (спор не образуют). На их долю приходится 1 – 4 % всей микрофлоры.

• Третью группу составляет так называемая остаточная микрофлора, на которую приходится 0,001 – 0,01 % всех микроорганизмов толстого кишечника. К этой группе принадлежат: Staphylococcus, Proteus, Candida, Clostridium, Pseudomonas.

• К четвертой группе относятся различные другие представители семейства Enterobacteriaceae, которые могут временно или постоянно обнаруживаться в кишечнике и вызывать кишечные инфекции (Salmonella, Shigella, Enterobacter и другие роды).

Таким образом, кожные покровы и слизистая оболочка организма заселены различными видами микроорганизмов, которые образуют с макроорганизмом единую целостную экологическую систему. Состав и состояние микрофлоры зависят от макроорганизма, но, в свою очередь, и микрофлора, особенно толстого кишечника, оказывает существенное и многообразное влияние на макроорганизм. Ее воздействие на макроорганизм проявляется в следующем:

1. Она является одним из важных факторов естественной резистентности организма, так как проявляет высоко антагонистическое действие по отношению к другим, в том числе патогенным, бактериям, препятствуя их размножению в организме. На это обстоятельство давно указывал И. И. Мечников: «Природа пользуется конкуренцией безобидных микробов, чтобы помешать поселению патогенных микробов». И. И. Мечникову принадлежит идея употребления в пищу молочнокислых продуктов с целью подавления развития в кишечнике гнилостных бактерий и продления жизни человека.

2. Микрофлора своими антигенными факторами стимулирует развитие лимфоидной ткани организма и таким образом также способствует развитию неспецифической и опосредованной специфической резистентности.

3. Микрофлора, особенно толстого кишечника, участвует в процессах пищеварения, в том числе в обмене холестерина и желчных кислот.

4. Важная роль микрофлоры заключается также в том, что она обеспечивает организм человека различными витаминами, которые синтезируются ее представителями (витамины В₁, В₂, В₆, В₁₂, К, никотиновая, пантотеновая, фолиевая кислоты и др.). Эти витамины обеспечивают бZольшую часть потребностей в них организма. Однако представители нормальной микрофлоры не всегда приносят только пользу. При определенных условиях, в частности при воздействии факторов, снижающих естественную резистентность, особенно в результате ионизирующего облучения, практически все представители нормальной микрофлоры, за исключением бифидумбактерий, могут стать виновниками различных эндогенных инфекций, чаще всего гнойно-воспалительных заболеваний с различной локализацией: ангины, менингиты, циститы, отиты, сепсисы, нефриты, аппендициты, абсцессы, флегмоны и т. п. Нередко после перенесенных кишечных заболеваний и особенно после длительного и нерационального применения антибиотиков возникают дисбактериозы.

Дисбактериоз – изменение количественного соотношения и состава нормальной микрофлоры организма, главным образом кишечника, при котором происходит уменьшение количества или исчезновение обычно составляющих ее микроорганизмов и появление в большом количестве редко встречающихся или не свойственных ей микробов. Обычно это соотношение изменяется в сторону увеличения количества факультативно-анаэробной или остаточной микрофлоры, главным образом грамотрицательных палочек, стафилококков, дрожжеподобных грибов Candida или Clostridium. Причиной дисбактериоза очень часто бывает бесконтрольное применение антибиотиков, особенно с широким спектром действия. Подавляя жизнедеятельность нормальной микрофлоры кишечника, они способствуют колонизации его другими видами антибиотикоустойчивых бактерий, что и служит причиной диарей, а иногда и очень тяжелых форм дисбактериоза и заболеваний различной этиологии (стафилококковый сепсис, псевдомембранозный колит и др.). Для лечения и профилактики дисбактериоза и других диарей, улучшения функционирования желудочнокишечного тракта во многих странах мира все в большем количестве начинают применять в различных формах эубиотики, пробиотики, пребиотики, синбиотики и другие биологически активные вещества.

Эубиотики – микроорганизмы, участвующие в формировании естественного, исторически сложившегося микробиоценоза в кишечнике (главным образом в толстом). К ним относятся прежде всего лактобациллы и бифидумбактерии, метаболическая активность которых определяет положительное влияние микрофлоры кишечника на организм человека.

Пробиотики – эубиотики, добавляемые к молочным продуктам (йогурт, кефир, молоко и т. д.) или используемые в виде чистых культур, жидких или таблетированных (бифидумбактерин, лактобактерин, колибактерин и др.), или в виде различных комбинаций (бификол – смесь бифидумбактерин + E. coli М-17, обладающая выраженным антагонистическим действием в отношении ряда других бактерий). В качестве пробиотиков используют также и некоторые споровые бактерии (Bacillus cereus, B. subtilis).

Пребиотики – неперевариваемые ингредиенты продуктов питания, которые селективно стимулируют рост и метаболическую активность эубиотиков, способствуют улучшению здоровья человека (низкомолекулярные углеводы, лактулоза и др.). Пребиотики содержатся в артишоке, луке репчатом, цикории, чесноке, кукурузных хлопьях, горохе, фасоли, овсяной крупе и других продуктах.

Синбиотики – смеси пробиотиков и пребиотиков.

Дисбактериозы развиваются потому, что антибиотики, особенно с широким антимикробным спектром, действуют не только на возбудителя заболевания, но и на чувствительных к ним представителей нормальной микрофлоры, угнетая их размножение. В этих условиях те микроорганизмы, на которые антибиотики не действуют, начинают беспрепятственно размножаться, особенно если понижена и естественная резистентность организма. Чаще всего устойчивыми являются стафилококки, грибы Candida и различные грамотрицательные палочки (кишечная палочка, протей, псевдомонады). Это и приводит к развитию дисбактериозов. Наиболее тяжелыми формами дисбактериозов, представляющими уже самостоятельные заболевания, являются стафилококковые пневмонии, стафилококковые сепсисы, кандидомикозы (в том числе генерализованные) и антибиотико-ассоциированные колиты, особенно стафилококковый и псевдомембранозный колит, вызываемый Clostridium difficile. Для лечения дисбактериозов кишечника и колитов рекомендуется применение специальных бактерийных препаратов, способствующих восстановлению нормальной микрофлоры: колибактерин (высушенная взвесь живых бактерий антагонистически активного в отношении шигелл Флекснера и Зонне штамма E. coli M-17), бифидумбактерин (высушенная взвесь живых бифидобактерий), лактобактерин (высушенная взвесь антагонистически активных штаммов лактобактерий), бификол (высушенная взвесь живых антагонистически активных бифидобактерий и E. coli M-17), бактисубтил или других, сходных по назначению и составу биопрепаратов.

Санитарная микробиология и ее значение

Микрофлору окружающей среды и обусловливаемые ее жизнедеятельностью процессы, которые могут оказать влияние на здоровье человека, изучает санитарная микробиология. Это самостоятельная наука со своими целями, задачами и методами исследования. Она сформировалась на стыке трех дисциплин: микробиологии, эпидемиологии и гигиены. Санитарная микробиология призвана решать следующие задачи:

1. Разработка, совершенствование и оценка методов микробиологических исследований разнообразных объектов внешней среды (воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов, предметов обихода и т. п.).

2. Оценка путей воздействия человека и животных на окружающую среду, которые могут стать причиной загрязнения ее опасными для здоровья микроорганизмами, включающая изучение: а) естественного взаимообмена микрофлорой между людьми, животными и средой их обитания; б) различных сторон общественной и индивидуальной деятельности людей, которые могут стать причиной накопления опасных микроорганизмов и загрязнения ими различных объектов; в) тех производственных и бытовых процессов, которые приводят к нарушению естественного самоочищения и обеззараживания окружающей среды.

3. Разработка государственных санитарных стандартов, а также других нормативов, определяющих соответствие микрофлоры объектов внешней среды гигиеническим требованиям, включая микробиологические показатели.

4. Разработка рекомендаций и мероприятий по оздоровлению объектов внешней среды путем воздействия на их микрофлору и проверка эффективности этих мероприятий.

5. Охрана окружающей среды. Эта задача является одной из главных задач санитарной микробиологии и гигиены. В ее основе лежат всестороннее изучение закономерностей взаимодействия человека с факторами внешней среды и разработка научно обоснованных рекомендаций по сохранению здоровья человека.

Санитарно-микробиологические исследования объектов внешней среды должны прежде всего решать вопрос о наличии или отсутствии в них патогенных для человека микроорганизмов (бактерий, вирусов и грибов). Однако непосредственное обнаружение их в объектах окружающей среды сопряжено с рядом трудностей. Поэтому санитарная микробиология использует свой особый, непрямой способ оценки санитарного благополучия объектов внешней среды. Способ основан на том, что главным источником возбудителей инфекционных болезней являются люди и теплокровные животные, выделяющие патогенные микроорганизмы в окружающую среду, главным образом фекальным и воздушно-капельным путем. Поэтому, чем обильнее загрязнены объекты внешней среды этими выделениями, тем вероятнее, что эти объекты заражены и соответствующими патогенами.

Для многих видов микроорганизмов кишечник – биотоп, т. е. единственная естественная среда их обитания. Следовательно, обнаружение в исследуемом материале представителей микрофлоры кишечника служит непосредственным доказательством фекального загрязнения объекта и указанием на возможное присутствие в нем возбудителей кишечных инфекций (брюшного тифа, холеры и т. п.). Полость рта – биотоп для многих других микроорганизмов. Обнаружение их в исследуемом материале служит указанием на возможное заражение объекта возбудителями капельных инфекций (дифтерии, скарлатины и т. п.). Выделяемые в этих случаях микроорганизмы выступают в роли показателей санитарного неблагополучия, т. е. потенциальной эпидемиологической опасности исследуемых объектов, поэтому они получили название «санитарно-показательных». Однако в качестве таковых выступают не все представители нормальной микрофлоры тела человека или животного, а только те из них, которые отвечают следующим требованиям (Кочемасова З. Н. [и др.], 1987):

1. Они должны постоянно содержаться в выделениях человека или теплокровных животных и выделяться в окружающую среду в больших количествах.

2. Они не должны иметь другого природного резервуара, кроме организма человека или животного.

3. После выделения в окружающую среду они должны сохранять жизнеспособность в течение сроков, близких к срокам выживания патогенных микробов, выводимых из организма теми же путями.

4. Они не должны активно размножаться в окружающей среде.

5. Они не должны сколько-нибудь значительно изменять свои биологические свойства в окружающей среде.

6. Они должны быть достаточно типичными, чтобы их дифференциальная диагностика осуществлялась без особого труда.

7. Обнаружение, идентификация и количественный учет должны производиться современными, простыми, легко доступными и экономичными микробиологическими методами.

8. Рост санитарно-показательных микроорганизмов на питательных средах должен быть свободен от влияния других присутствующих микробов.

9. В объекте внешней среды они должны быть распределены по возможности равномерно. В случае исследования плотных пищевых объектов последние подвергаются гомогенизации для равномерного распределения микробов.

10. Санитарно-показательные микроорганизмы должны встречаться как в организме своего хозяина, так и во внешней среде в количествах, значительно больших, чем соответствующие патогенные микроорганизмы.

Чем большему числу указанных требований удовлетворяет тот или иной представитель нормальной микрофлоры тела человека или животного, тем в большей степени он соответствует функции санитарно-показательного микроорганизма.

Наиболее важными показателями фекального загрязнения во всем мире признаются бактерии группы кишечной палочки (БГКП). Под этим общим понятием объединяют бактерии семейства Enterobacteriaceae, родов Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella. К категории БГКП относят грамотрицательные, не образующие спор и не обладающие оксидазной активностью палочки, ферментирующие лактозу и глюкозу до кислоты и газа при температуре 37 °C в течение 24 ч. Эти бактерии выделяются в окружающую среду только с испражнениями человека и теплокровных животных.

Среди БГКП выделяют лактозоположительные палочки (колиформные по международной классификации), которые ферментируют лактозу при температуре 37 °C с образованием кислоты и газа, а из этой группы – фекальные кишечные палочки (ФКП), ферментирующие лактозу при температуре 44,5 °C. Из ФКП к E. coli относятся только бактерии, не способные расти на среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии цитрат. Эти бактерии являются показателями свежего фекального загрязнения. К показателям фекального загрязнения относят, помимо БГКП, энтерококки (разновидность S. faecalis), клостридии (C. perfringens), бактерии рода Proteus и колифаги. Перспективными для этих целей могут быть и бифидобактерии, но их трудно культивировать (строгие анаэробы) и идентифицировать. Поскольку энтерококки выживают во внешней среде относительно недолго, их обнаружение, как и обнаружение E. coli, служит показателем свежего фекального загрязнения.

Для оценки санитарно-гигиенических показателей безопасности питьевой воды, продовольственного сырья и пищевых продуктов, воды минеральной питьевой, лечебной и лечебно-столовой, вод поверхностных стоков, открытых водоемов и морей, всех категорий сточных вод, лечебных грязей и почвы используются унифицированные методы анализа, предусмотренные соответствующими нормативными документами, ГОСТами, методическими указаниями и другими актами санитарного законодательства страны.

Например, в соответствии с этими актами, нормативы микробиологических показателей питьевой воды таковы:

1. Общее микробное число (количество микроорганизмов в 1 мл воды) – не более 100.

2. Число бактерий группы кишечной палочки (коли-индекс) – количество БГКП в 1000 мл воды – не более 3.

3. Эшерихии (показатель свежего фекального загрязнения) – количество эшерихий в 1000 мл воды – отсутствие.

4. Колифаги – количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1000 мл воды – отсутствие.

Кроме того, в 25 л питьевой воды должны отсутствовать патогенные простейшие (цисты лямблий, дизентерийных амеб, балантидий) и яйца гельминтов.

Для оценки бактериального загрязнения почвы санитарно-показательными микроорганизмами служат БГКП, энтерококки, клостридии (C. perfringens), термофилы; воздуха – стафилококки и стрептококки; предметов обихода – БГКП, стафилококки, энтерококки; пищевых продуктов – БГКП, энтерококки, стафилококки, бактерии группы протея.

Микробиологические нормативы для стерилизованных продуктов детского питания: не допускается в массе 10 см³ продукта наличия БГКП, E. coli, S. aureus, и в массе 100 см³ – патогенных бактерий, в том числе сальмонелл. Допускается в1см³ продукта не более 100 КОЕ (колониеобразующих единиц) мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Для кисломолочных продуктов детского питания не допускается в массе 3 см³ продукта БГКП, в 10 см³ – E. coli и S. aureus, в 50 см³ – патогенных бактерий, в том числе сальмонелл. В пастообразных продуктах (творог), готовых кашах и напитках не допускается в 1 г продукта содержания БГКП, E. coli и S. aureus; патогенных бактерий, в том числе сальмонелл – в 50 г.

С 1 сентября 2002 г. вступило в силу новое Постановление СанПиН 2.3.2.1078-01, утвержденное Главным государственным санитарным врачом РФ от 14.11.2001 г.

№ 36, дополненное и измененное в 2008 г. СанПиН 2.3.2.2401-08.

Слово «инфекция» происходит от латинского «inficio» – вношу что-либо вредное, заражаю, и позднелатинского «infectio» – заражение. Однако буквальный перевод слова не вполне отвечает вкладываемому в это понятие содержанию. В обиходе это слово употребляют, вкладывая в него три различных понятия. Очень часто термин «инфекция» отождествляется с понятием «инфекционное заболевание». В других случаях под инфекцией понимают заразное начало (т. е. инфект – возбудитель заболевания); наконец, под инфекцией понимают сам процесс заражения. В действительности, под термином «инфекция» правильнее понимать процесс взаимодействия между микро– и макроорганизмом, протекающий в конкретных условиях внешней среды (в том числе социальной). При таком самом широком понимании термина «инфекция» учитываются все три варианта его толкования.

Инфекционное заболевание есть одна из форм инфекции, самая крайняя (тяжелая), но не единственная форма ее проявления. Вместе с тем именно при таком подходе к понятию инфекция становится ясным, какие факторы обусловливают инфекцию и в чем заключается сущность инфекционного процесса.

На заре развития микробиологии господствовала так называемая триада Генле – Коха, которая подчеркивала главную, ведущую роль в развитии инфекционного процесса микроорганизма – возбудителя заболевания. В соответствии с ней: 1) микроорганизм всегда должен встречаться при данной болезни и не встречаться у здоровых людей и у больных другими болезнями; 2) микроорганизм должен быть выделен от больного в чистой культуре; 3) чистая культура микроорганизма должна вызвать то же самое заболевание. Однако многочисленные наблюдения со временем привели к пересмотру этой доктрины. Стало очевидным, что развитие болезни зависит не только от свойств возбудителя, но во многом и от состояния макроорганизма, которое, в свою очередь, зависит от условий его существования. Вместе с тем было бы ошибочно сущность инфекционного процесса рассматривать без учета роли микроорганизма – возбудителя данного заболевания. Задача науки в том и состоит, чтобы раскрыть и показать роль того и другого участника этого очень сложного процесса взаимодействия и обеспечить правильное воздействие на развитие и исход инфекционного заболевания. Врач должен эффективно влиять на возбудителя, назначая рациональное антибактериальное лечение, и на организм человека, мобилизуя его защитные механизмы.

Вот почему основным положением современного учения об инфекции является признание того непреложного факта, что возникновение, развитие и исход инфекции как процесса взаимодействия между микро– и макроорганизмом зависят от свойств того и другого участников этого конкурентного взаимодействия и от условий внешней среды, в которых оно происходит. Инфекции принято разделять на две основные группы: а) манифестная инфекция, т. е. инфекционная болезнь, которая может протекать типично, атипично, хронически и т. п.; б) бессимптомная инфекция (носительство, латентная, абортивная, дремлющая и т. п.).

В зависимости от свойств главных факторов инфекционного процесса (т. е. возбудителя и макроорганизма) различают следующие основные формы инфекции:

1. Абортивная. Возбудитель проникает в организм, но не размножается в нем или в связи с надежной естественной резистентностью, или с приобретенным специфическим иммунитетом, подавляющим возбудителя. Таким образом, инфекционный процесс обрывается, и возбудитель рано или поздно погибает или удаляется из организма.

2. Латентная (инаппарантная). Возбудитель проникает в организм, размножается в нем, макроорганизм отвечает на него соответствующими иммунобиологическими реакциями, ведущими к формированию приобретенного иммунитета и удалению возбудителя из организма. Однако никаких внешних клинических проявлений этой инфекции нет, она протекает скрыто (латентно). Нередко в такой латентной форме люди переносят полиомиелит, бруцеллез, некоторые вирусные гепатиты и другие болезни.

3. Дремлющая инфекция. Бессимптомное пребывание возбудителя в организме может сохраняться долгое время после латентной инфекции или после перенесенного заболевания, например легочного туберкулеза, закончившегося формированием первичного комплекса (см. главу 65). Под влиянием условий, понижающих сопротивляемость организма, сохраняющиеся в нем живые микроорганизмы активизируются и вызывают заболевание или его рецидив. Таким образом, патогенные микробы находятся некоторое время как бы в «дремлющем» состоянии. Такие «дремлющие» микробы могут проникать в организм из внешней среды или быть результатом перехода в «дремлющее» состояние микробавозбудителя, подавленного в своей активности, но сохранившего жизнеспособность и потенциальную готовность к активации при благоприятных для него условиях. Поэтому они получили название «микробов, готовых к выходу» (франц. «microbes de sortie»). В тех случаях, когда «дремлющие» в организме микробы сосредоточены в местном ограниченном очаге, откуда они могут распространяться и вызывать заболевание, применяют термин «фокальная» инфекция (например, заглохший воспалительный процесс в кариозном зубе, в котором его возбудитель – стрептококк – сохраняется в «дремлющем» состоянии до поры до времени).

4. Типичная для данного возбудителя форма инфекции. Возбудитель проникает в организм, активно в нем размножается, вызывая характерные (типичные) для данной болезни клинические проявления, которые также характеризуются определенной цикличностью.

5. Атипичная форма. Возбудитель проникает в организм, активно в нем размножается, организм отвечает соответствующими иммунобиологическими реакциями, которые приводят к формированию активного иммунитета, но клинические симптомы болезни носят невыраженный, стертый или атипичный характер. Чаще всего это связано либо со слабыми патогенными свойствами возбудителя, либо с высокой естественной резистентностью организма, либо с эффективным антибактериальным лечением, либо с действием всех этих трех факторов.

6. Персистентная (хроническая). Возбудитель проникает в организм, размножается в нем, вызывает активную форму болезни, но под влиянием иммунных систем организма и химиопрепаратов подвергается L-трансформации. Поскольку L-формы бактерий не чувствительны ко многим антибиотикам и химиопрепаратам, чей механизм действия связан с нарушением синтеза клеточной стенки, а также к антителам, они могут длительное время переживать (персистировать, англ. persistence – живучесть) в организме. Возвращаясь в свою исходную форму, возбудитель восстанавливает патогенные свойства, размножается и вызывает обострение (рецидив) болезни. Типичным примером такой хронической инфекции является туберкулез. Сохраняющиеся в организме больного L-формы туберкулезной палочки являются главной причиной хронического течения этой болезни, а превращение L-форм туберкулезных палочек в исходные Mycobacterium tuberculosis – главная причина обострения и рецидивов ее.

7. Медленные инфекции. Возбудитель проникает в организм и может долгое время – месяцы, годы – сохраняться в нем внутриклеточно в латентном состоянии. В силу ряда биологических особенностей возбудителей медленных инфекций организм не в состоянии от них избавиться, а при благоприятных для возбудителя условиях он начинает беспрепятственно размножаться, заболевание протекает все тяжелее и тяжелее и, как правило, заканчивается смертью больного. Медленные инфекции характеризуются длительным инкубационным периодом, длительным прогрессирующим развитием болезни, слабым иммунным ответом и тяжелым исходом. Типичным примером медленной инфекции является СПИД.

8. Бактерионосительство. Очень часто после либо латентной инфекции, либо перенесенного заболевания организм человека не в состоянии полностью освободиться от возбудителя. При этом человек, будучи практически здоровым, становится его носителем в течение многих месяцев или даже лет. Являясь источником заражения для других лиц, бактерионосители играют большую роль в эпидемиологии многих заболеваний (брюшного тифа, дифтерии и др.), поскольку они выделяют их возбудителей в окружающую среду, заражают воздух, воду, пищевые продукты. Около 5 – 8 % людей, переболевших брюшным тифом, становятся хроническими (на срок более 3 мес.) носителями S. typhi и служат основным их резервуаром в природе.

Существуют понятия реинфекции, суперинфекции, микст-инфекции, вторичной инфекции.

Реинфекция – повторное заражение и развитие инфекции, вызванной тем же возбудителем, обычно в форме клинически выраженной инфекционной болезни, так как после заболевания напряженный иммунитет не вырабатывается.

Суперинфекция – инфицирование организма болеющего тем же возбудителем до наступления выздоровления.

Микст-инфекция (коинфекция) – одновременное возникновение двух инфекционных процессов, вызванных различными микроорганизмами. Противоположное понятие – моноинфекция.

Вторичная инфекция – возникает как следствие ослабления иммунитета на фоне первичного инфекционного заболевания и может вызываться различными возбудителями (бактериями, вирусами, грибами). Вторичные инфекции, вызванные малопатогенными или непатогенными для здорового человека микроорганизмами, у страдающего иммунодефицитом человека принято называть оппортунистическими.

Аутоинфекция – развитие инфекционного процесса, вызванного собственной (как правило, условно-патогенной) микрофлорой, населяющей кожу и слизистые оболочки, при попадании ее в другие биотопы (например, в рану) в результате самозаражения.

Различают также инфекцию экзогенную и эндогенную (в том числе аутоинфекцию), очаговую (локальную) и генерализованную.

Динамика развития инфекционной болезни

Развитие инфекционной болезни характеризуется определенной цикличностью, сменой периодов. Различают инкубационный и продромальный периоды, периоды развития (расцвета) болезни и выздоровления (реконвалесценции).

Инкубационный период – период от момента заражения до появления первых признаков заболевания. В течение этого периода в организме происходит активное размножение и накопление возбудителя и его токсинов до определенного порогового количества, после которого организм начинает отвечать теми или иными клиническими проявлениями, т. е. наступает следующий, продромальный период. Продолжительность инкубационного периода варьирует в среднем от нескольких дней до нескольких недель, но он может быть равен и нескольким часам и длиться несколько месяцев, а при лепре – несколько лет. Это зависит от ряда причин – величины заражающей дозы и степени патогенности возбудителя, а также от состояния резистентности организма.

Продромальный период, или период предвестников. Он характеризуется обычно неспецифическими, общими проявлениями – слабость, разбитость, головная боль, общее недомогание, повышение температуры и т. п. Его продолжительность варьирует в пределах 24 – 48 ч.

Период развития (расцвета) болезни. Он также часто характеризуется известной цикличностью. Различают стадию нарастания симптомов (стадия incrementum), расцвета болезни (стадия acme) и период угасания симптомов (стадия decrementum). При типичной форме болезни этот период характеризуется проявлением специфических для данной болезни симптомов, а также и некоторыми общими симптомами, в частности, лихорадкой, интоксикацией, воспалением, иногда появлением сыпи.

Период выздоровления, или реконвалесценции. Клиническое выздоровление наступает обычно раньше патологоанатомического и бактериологического выздоровления. Человек практически здоров, но на месте локализации процесса еще остаются какие-либо патологоанатомические изменения (например, после перенесенной дизентерии на слизистой оболочке толстой кишки). Реконвалесценция может быть полной: все процессы заканчиваются полностью без каких-либо отягощающих последствий. Однако некоторые болезни оставляют тяжелые последствия, например паралич мышц после полиомиелита, энцефалита; цирроз печени после вирусного гепатита В и т. п. Особо следует принимать во внимание бактериологическое выздоровление после инфекционного заболевания, т. е. полное освобождение организма от возбудителя. При различных инфекционных заболеваниях срок бактериологического выздоровления варьирует, и это учитывается при выписке таких больных из больницы. Например, при брюшном тифе до 80 % реконвалесцентов в течение первых двух недель являются бактерионосителями. Бактериологическое выздоровление контролируют лабораторными бактериологическими анализами. Об эпидемиологическом значении бактерионосительства сказано выше.

Патогенность и вирулентность

Термин «патогенность» означает способность микроорганизмов вызывать заболевания. Он состоит из двух греческих слов: pathos – страдание, болезнь, и genes – рождающий. Патогенными, т. е. болезнетворными, являются далеко не все бактерии. Поэтому закономерным является вопрос, как они возникли или чем определяется их патогенность. Однозначного ответа на него дать невозможно, так как патогенность разных бактерий определяется их особыми свойствами. Одним из объяснений происхождения патогенных бактерий служит допущение того факта, что их появление связано с приспособлением к паразитическому существованию и приобретением в связи с этим таких биологических свойств, которые обеспечивают им способность противостоять защитным механизмам макроорганизма. Как уже отмечалось, между микро– и макроорганизмом существуют различные формы симбиоза: мутуализм, комменсализм и паразитизм. Переход от комменсализма к паразитизму вполне логичен. Это положение подтверждает наличие в природе так называемых микробов-двойников. Например, есть микобактерии, патогенные для человека и теплокровных животных, патогенные для холоднокровных и растений, и микобактерии непатогенные (например, Mycobacterium smegmatis – представитель микрофлоры слизистой оболочки мочеполовых путей человека). Вероятнее всего предположение, что патогенные микобактерии обособились в разные группы в результате адаптации к паразитизму за счет соответствующих организмов. Вместе с тем возбудители таких заболеваний, как ботулизм и столбняк, постоянно существуют во внешней среде: естественной средой обитания для них служит почва. Их патогенность для человека и теплокровных животных связана со способностью вырабатывать сильнейшие токсины. Однако не ясно, какую роль токсинообразование играет в жизни и экологии этих бактерий.

Другой механизм превращения непатогенных бактерий в патогенные связан с получением первыми дополнительных генов от бактериофагов либо плазмид. Например, дифтерию у человека вызывают только патогенные Corynebacterium diphtheriae, а способность синтезировать дифтерийный экзотоксин они приобретают в результате лизогенной конверсии (см. главу 47). Иначе говоря, болезнетворность этих бактерий зависит от передачи им генов токсигенности от особых токсигенных коринефагов. Интегрируясь в хромосому непатогенных коринебактерий, такие фаги привносят в них свои гены, которые и превращают непатогенные коринебактерии в возбудители дифтерии. В свою очередь, многие варианты диареегенных кишечных палочек возникли в результате приобретения ими плазмид, в составе которых имеются гены, превращающие непатогенную E. coli в патогенную, способную вызывать различные формы эшерихиозов.

Наконец, в природе существуют различные виды бактерий, способных с помощью сенсорно-регуляторных систем перестраивать свой метаболизм в зависимости от того, в каких условиях они существуют – во внешней среде или в организме теплокровных животных. Эти бактерии (легионеллы, иерсинии и др.) получили название сапронозных, так как естественной средой их обитания являются почва и растительные организмы. Однако, попадая в организм человека или животных, они изменяют свой метаболизм в сторону, способствующую их размножению и в этих условиях, т. е. при более высокой температуре в живом организме с его механизмами самозащиты.

Патогенность, или способность вызывать заболевание, не является абсолютной.

Ее обусловленность находит свое выражение в следующих фактах:

1. Патогенность микробов проявляется всегда по отношению к определенному виду (видам) животных. Есть бактерии, патогенные только для человека, есть патогенные только для животных, но есть патогенные и для человека, и для животных (возбудители чумы, бруцеллеза, туляремии и др.).

2. Непатогенный в одних условиях (естественных) для макроорганизма возбудитель может стать патогенным в других, измененных условиях. Например, в естественных условиях куры не болеют сибирской язвой, но если температуру их тела искусственно понизить, они ею заболевают.

3. Микроорганизмы, являющиеся непатогенными или условно-патогенными для физиологически здоровых организмов, могут стать патогенными при ослаблении их естественной резистентности, особенно под влиянием радиационного облучения.

Патогенность – способность вызывать заболевание – видовое свойство бактерий, присущее виду в целом, но она может проявляться в разной степени у разных представителей данного вида. Поэтому для оценки степени патогенности используют термин вирулентность. Патогенность и вирулентность (лат. virulentus – ядовитый) означают одно и то же – способность вызывать заболевание, но под вирулентностью понимают количественную оценку, т. е. меру, степень патогенности. Вирулентность может быть усилена (повышена) и ослаблена (понижена). Это достигается разными способами воздействия на соответствующего возбудителя. Но так как все признаки патогенности контролируются генами, то фактически получение авирулентных или высоковирулентных штаммов возбудителей сводится к селекции таких вариантов, всегда имеющихся в каждой популяции, т. е. к созданию благоприятных для их отбора условий. Л. Пастер получил вакцину против сибирской язвы путем выращивания ее возбудителей при высокой температуре (42 °C), которая способствовала утрате плазмид (плазмиды), определяющих патогенность этого возбудителя. Вакцину против бешенства он получил путем селекции штамма вируса бешенства, высоковирулентного для кроликов, но безвредного для человека. А. Себин получил живую вакцину против полиомиелита путем селекции невирулентных вариантов всех трех типов полиовируса.

Для количественного выражения вирулентности микроорганизмов используют три метода: определение Dlm, Dcl и Dl₅₀. Dlm (Dosis letalis minima) – минимальная смертельная доза микроорганизмов или их токсинов, способная вызвать гибель животного за определенный срок, – величина относительная, зависит от вида животного. Dlm для кролика, собаки и морской свинки будет различной. Dcl (Dosis certа letalis) – безусловно смертельная доза, т. е. доза, вызывающая гибель любого животного; она также является относительной. Поэтому статистически наиболее достоверной летальной дозой принято считать дозу (количество микроорганизмов или их токсинов), вызывающую гибель 50 % зараженных животных, – Dl₅₀. Она устанавливается на основании статистической обработки полученных результатов по методу Рида и Менча.

Факторы патогенности (вирулентности)

Патогенность как биологический признак бактерий реализуется через их три свойства: инфекциозность, инвазивность и токсигенность (или токсичность).

Под инфекциозностью (или инфективностью) понимают способность возбудителей проникать в организм и вызывать заболевание, а также «способность ми-кробов передаваться с помощью одного из механизмов передачи, сохраняя в этой фазе свои патогенные свойства и преодолевая поверхностные барьеры (кожу и слизистые)» (Королюк А. М., 1995). Она обусловлена наличием у возбудителей факторов, способствующих их прикреплению к клеткам организма и колонизации.

Под инвазивностью понимают способность возбудителей преодолевать защитные механизмы организма, размножаться, проникать в его клетки и распространяться в нем. Это свойство также связано с наличием у патогенных микроорганизмов большой группы факторов патогенности, которые наделяют их способностью к внедрению в клетки и размножению в них; факторов, подавляющих фагоцитоз и препятствующих ему; большой группы ферментов «агрессии и защиты».

Токсигенность бактерий обусловлена выработкой ими экзотоксинов. Токсичность обусловлена наличием эндотоксинов. Экзотоксины и эндотоксины обладают своеобразным действием и вызывают глубокие нарушения жизнедеятельности организма.

Инфекциозные, инвазивные (агрессивные) и токсигенные (токсические) свойства относительно слабо связаны друг с другом, они по-разному проявляются у разных микроорганизмов. Существуют микроорганизмы, у которых на первый план выходят агрессивные (инвазивные) свойства. К ним относится, например, возбудитель чумы. Хотя Y. pestis и образует экзотоксин («мышиный» токсин), однако основными факторами его патогенности служат те, которые подавляют защитные силы организма, обеспечивая быстрое внутриклеточное размножение возбудителя и распространение его по организму.

В то же время возбудители столбняка, дифтерии и ботулизма, обладая слабыми инфекциозными свойствами, продуцируют сильнейшие экзотоксины, которые и обусловливают развитие болезни, ее патогенез и клинику.

Следовательно, такое сложное биологическое свойство, как патогенность, обусловлено наличием у патогенных бактерий конкретных факторов патогенности, каждый из которых ответствен за проявление определеннных свойств. К ним относятся следующие факторы:

1. Хемотаксис и подвижность (у бактерий, имеющих жгутики). С помощью хемотаксиса бактерии ориентируются в отношении своих клеток-мишеней, а наличие жгутиков ускоряет их приближение к клеткам.

2. Ферменты, разрушающие субстраты слизи, которая покрывает эпителиальные клетки слизистых оболочек. Протеазы, нейраминидазы, лецитиназы и другие ферменты, разрушая слизь, способствуют высвобождению рецепторов, с которыми взаимодействуют микроорганизмы.

3. Факторы адгезии и колонизации, с помощью которых бактерии распознают рецепторы на мембранах клеток, прикрепляются к ним и колонизируют клетки. У бактерий функцию факторов адгезии выполняют различные структуры клеточной стенки: фимбрии, белки наружной мембраны, ЛПС и другие компоненты. Адгезия является пусковым механизмом реализации патогенности. Бактерии могут размножаться либо в клетках, либо на поверхности клеток слизистой (на их мембранах) либо проходить через них и далее распространяться по организму. Поэтому ни один возбудитель, в том числе и вирусы, не может реализовать свою патогенность, если он не способен прикрепиться к клетке (адсорбироваться на ней). В свою очередь и токсины, до тех пор, пока они не свяжутся с рецепторами мембран клеток-мишеней, также не смогут реализовать токсические функции. Поэтому адгезия и колонизация – начальные, пусковые механизмы развития болезни.

4. Факторы инвазии, т. е. факторы, с помощью которых бактерии проникают в клетку. Обычно они сопряжены с факторами, подавляющими клеточную активность и способствующими внутриклеточному размножению бактерий. Факторы инвазии у грамотрицательных бактерий обычно представлены белками наружной мембраны.

5. Факторы, препятствующие фагоцитозу, т. е. защищающие от фагоцитоза. Они также связаны с компонентами клеточной стенки и либо маскируют бактерии от фагоцитов, либо подавляют их активность. Такие факторы есть у многих бактерий. Они представлены либо капсулой из гиалуроновой кислоты, которая не распознается фагоцитами как чужеродная, так как химически не отличается от таковой организма, либо капсулами другой химической природы (у B. anthracis, Y. pestis и т. д.); различными белками, тормозящими фагоцитоз, – белок А (у стафилококков), М-белок (у стрептококков), антиген FraI у возбудителя чумы; пленка из фибрина, образующаяся у стафилококков, имеющих плазмокоагулазу; к их числу относятся также пептидогликан, тейхоевые кислоты и другие компоненты клеточной стенки.

6. Факторы, подавляющие фагоцитоз, например V-W-антигены у Y. pestis. Наличие таких факторов обусловливает незавершенный характер фагоцитоза. Чаще всего он связан с образованием бактериями веществ, которые подавляют «окислительный взрыв» фагоцитов. Незавершенный фагоцитоз – одна из важных причин хронизации течения болезни (хрониосепсис).

7. Ферменты «защиты и агрессии» бактерий. С помощью таких ферментов, как фибринолизин, лецитиназа, гиалуронидаза, протеазы и т. п., бактерии реализуют (наряду с факторами, подавляющими фагоцитоз и защищающими от него) свои агрессивные свойства. Эти ферменты способствуют их распространению в тканях организма. Одним из главных ферментов защиты (например, у стафилококков) является плазмокоагулаза. Превращая фибриноген в фибрин, этот фермент образует своеобразную белковую пленку вокруг клеток, которая и защищает их от фагоцитоза. Патогенность может быть связана и с другими ферментами бактерий, например с аминопептидазами, подавляющими хемотаксис фагоцитов, а также с продуктами жизнедеятельности бактерий, обладающими токсическими свойствами (птомаины и т. п.).

8. Токсины микробов. Различают эндотоксины и экзотоксины. Эндотоксины имеются только у грамотрицательных бактерий. Они представлены липополисахаридами и связанными с ними белками. Особенность эндотоксинов в том, что они термостабильны и высвобождаются из бактериальных клеток после их разрушения. Эндотоксины, в отличие от экзотоксинов, не обладают специфичностью действия. Их токсичность и пирогенность обусловлены липидом А, входящим в состав ЛПС и имеющим сходную структуру у разных грамотрицательных бактерий. Пирогенное действие эндотоксинов не связано с их непосредственным действием на терморегулирующие центры головного мозга. Они индуцируют выброс какого-то пирогенного вещества из полиморфно-ядерных лейкоцитов. Эндотоксины являются воспалительными агентами: они увеличивают проницаемость капилляров и оказывают разрушающее действие на клетки. Их воспалительное и пирогенное действие неспецифично. Многообразие проявлений отравления эндотоксином обусловлено не только самим ЛПС, но и высвобождением многочисленных биологически активных соединений, синтез которых он индуцирует в организме человека и животных (гистамин, серотонин, простагландины, лейкотриены и др., всего более 20). Эти вещества и обусловливают нарушения в различных органах и тканях.

Все три компонента ЛПС – липид А, ядро полисахарида и его боковая цепочка из повторяющихся сахаров – обладают выраженными антигенными свойствами. ЛПС стимулирует синтез интерферонов, активизирует систему комплемента по классическому пути, оказывает митогенное действие на лимфоциты, а также аллергенное действие. Его токсические свойства, в отличие от экзотоксинов, не снимаются при обработке формалином, и ЛПС не превращается в анатоксин.

Экзотоксины. Их продуцируют как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии. У грамположительных бактерий экзотоксины активно секретируются через ЦМ и клеточную стенку в окружающую среду с использованием специальных секретирующих систем. У грамотрицательных бактерий (холерный вибрион, токсигенные кишечные палочки, сальмонеллы) некоторые экзотоксины (энтеротоксины) синтезируются только при определенных условиях непосредственно в инфицированном организме и нередко сохраняются в цитоплазме, освобождаясь из клетки только после ее разрушения.

Основные свойства экзотоксинов

Все известные бактериальные экзотоксины – белки, среди них есть термолабильные и термостабильные. С белковой природой экзотоксинов связаны их основные свойства: они обладают высокой силой действия (самые сильные токсины в природе – микробного происхождения), высокой избирательностью и связанной с ней специфичностью действия (картина столбняка у лабораторных животных одинакова, как при заражении их возбудителем, так и его экзотоксином), которое они проявляют после некоторого латентного периода. Экзотоксины являются сильными антигенами, а некоторые – даже суперантигенами. Они индуцируют образование в организме антител, т. е. антитоксинов, которые нейтрализуют их действие. При обработке формалином экзотоксины обезвреживаются и превращаются в анатоксины. Анатоксины лишены токсических свойств, но сохраняют свою способность индуцировать синтез антитоксинов, поэтому широко используются для создания искусственного иммунитета против дифтерии, столбняка, ботулизма и других заболеваний.

По молекулярной организации различают две основные группы экзотоксинов:

1. Экзотоксины, состоящие из двух фрагментов – А и В. Каждый фрагмент сам по себе не активен. Свойствами токсина они обладают, будучи связанными друг с другом. При этом фрагмент В выполняет две функции – акцепторную (распознает рецептор на мембране и связывается с ним) и формирования внутримембранного канала. Фрагмент А проникает через него в клетку и проявляет в ней токсическую активность, воздействуя на различные процессы метаболизма клетки. Такую структуру имеют, например, энтеротоксины холерного вибриона и патогенных грамотрицательных бактерий.

2. «Разрезанные» токсины. Эти экзотоксины синтезируются в бактериальных клетках в виде единой неактивной полипептидной цепи. В активную форму протоксин превращается в результате разрезания его протеазой. Образующийся при этом активный токсин состоит из двух связанных между собой дисульфидными связями пептидных цепей. Активация токсина (разрезание полипептидной цепи) может осуществляться либо собственной бактериальной протеазой, либо протеазами кишечного тракта макроорганизма. Такой тип экзотоксинов синтезируют Clostridium tetani и C. botulinum, причем в их токсинах содержатся дополнительные белки с иными, нетоксическими свойствами.

Вероятно, существуют микробные экзотоксины и с иной химической структурой. По характеру токсического действия экзотоксины также отличаются друг от друга. Например, экзотоксины с мембрано-повреждающим механизмом действия разрушают эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, базофилы, мастоциты и другие клетки, а также клетки культур тканей, протопласты и сферопласты.

Механизм действия других экзотоксинов связан с нарушением жизненно важных процессов в клетке: подавлением биосинтеза белка (дифтерийный экзотоксин) и переноса электронов по цепи («мышиный» токсин Y. pestis).

Энтеротоксины холерного вибриона и патогенных грамотрицательных бактерий, воздействуя на аденилатциклазную систему энтероцитов, вызывают выход ионов и воды из тканей в кишечник, что и обусловливает патогенез холеры и других форм диареи. Экзотоксин C. botulinum подавляет выделение ацетилхолина в нервно-мышечном синапсе и блокирует передачу нервного импульса на мышечное волокно. Механизм действия экзотоксина C. tetani также связан с торможением передачи синаптических медиаторов (γ-аминомасляной кислоты, ацетилхолина, норадреналина и др.).

Особым образом проявляют свое действие энтеротоксины, продуцируемые стафилококками. Эти белки обладают свойствами суперантигенов, т. е. антигенов, которые стимулируют синтез излишнего количества Т-лимфоцитов. Последние начинают вырабатывать огромное количество интерлейкина-2, а это и приводит к токсическому эффекту. Таким образом, свое отравляющее действие на организм стафилококковые энтеротоксины реализуют через индуцируемый ими синтез интерлейкина-2.

Особенности генетического контроля синтеза факторов патогенности бактерий

У бактерий обнаружено два типа генов, контролирующих синтез факторов патогенности: гены собственной хромосомы клетки и гены, привнесенные в хромосому так называемыми мобильными генетическими элементами. Эта вторая группа включает в себя умеренные конвертирующие фаги, фаги-транспозоны, плазмиды и транспозоны. Мобильными их называют потому, что они содержат собственные генетические компоненты, кодирующие транспозазу, интегразу, а также сайт-специфические участки, которые взаимодействуют со специфическими сайтами хромосомы клетки и обеспечивают интеграцию в нее.

Включение генома (или части генома) профага приводит к образованию в составе хромосомы бактерий островов патогенности (англ. pathogenicity islands), которые содержат ген или кассету генов, контролирующих продукцию основных факторов патогенности. Например, в хромосоме холерного вибриона есть два острова патогенности. В одном из них расположены гены умеренного профага CTXϕ, а в другом – фага VPIϕ. Как правило, гены патогенности, содержащиеся в островах патогенности, регулируются координированно, т. е. функционируют как самостоятельный геном патогенности в составе хромосомы клетки. В результате рекомбинации умеренных фагов с хромосомой бактерий возникли многие патогенные бактерии (Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, EHEC и др.), а в результате переноса генов патогенности плазмидами – Bacillus anthracis, Yersinia pestis, ETEC, EIEC, EPEC и др. Во всяком случае, острова патогенности в форме мобильных генетических элементов обнаружены у многих видов патогенных бактерий, но их нет у близкородственных непатогенных бактерий.

Основные источники инфекции

Существуют три основных возможных источника инфекции: человек (больной, реконвалесцент, бактерионоситель), животные и объекты внешней среды, служащие естественной средой обитания некоторых патогенных бактерий или контаминированные выделениями от больных людей или животных. В соответствии с этим различают болезни: антропонозные (ими болеют только люди, например, брюшной тиф, дизентерия, холера и др.); зоонозные (греч. zoon – животное и nosos – болезнь, ими болеют только животные, например, чума рогатого скота, чума свиней и др.); зооантропонозные (ими болеют и животные, и заражающиеся от них люди). Существует около 100 зооантропонозных болезней (чума, туляремия, бруцеллез, лептоспироз и др.), некоторые их них – в виде естественных природных очагов. Чаще всего это связано с тем, что переносчиками возбудителей заболеваний являются кровососущие членистоногие, в организме которых возбудитель может сохраняться продолжительное время, иногда пожизненно, и даже трансовариально передаваться потомству. Такие природные очаги, например некоторых риккетсиозов, туляремии, вирусных энцефалитов и других заболеваний, при которых переносчиками являются различные виды иксодовых, гамазовых, краснотелковых клещей и других кровососущих членистоногих, имеются в различных странах мира. Их длительное существование объясняется тем, что в дополнение к инфицированным позвоночным животным присутствует второй длительно действующий резервуар возбудителя – инфицированные членистоногие, для которых позвоночные являются прокормителями. В других случаях передача возбудителя в природных очагах от больного животного к здоровому может происходить при их совместном содержании с помощью прямого или непрямого контакта (например, в очагах лептоспирозов, Ку-лихорадки и т. п.). Таким образом, в природных очагах, благодаря постоянно действующей цепи передачи возбудителя: больное животное → кровососущие членистоногие (или различные факторы внешней среды) → здоровое животное – сложились естественные резервуары возбудителей многих заболеваний. Человек, включаясь в эту цепь, может заразиться либо через укусы кровососущих переносчиков, либо путем прямого или непрямого контакта с инфицированными животными. Особенно большая опасность заражения в постоянно действующих природных (эндемических) очагах существует для вновь прибывающих в эти очаги людей, так как лица, постоянно в них проживающие, нередко переносят эти заболевания в раннем возрасте и приобретают к ним иммунитет.

Третьим постоянным источником заражения человека является сама внешняя среда, главным образом, почва и вода. В почве постоянно находятся патогенные бактерии из рода Clostridium – возбудители раневых инфекций и ботулизма, может долго сохраняться возбудитель сибирской язвы. Кроме того, нормальными обитателями почвы и некоторых водоемов являются возбудители сапронозных заболеваний (греч. sapros – гнилой и nosos – болезнь, т. е. болезни, вызываемые возбудителями, средой обитания которых служат гниющие растения) – легионеллы, иерсинии и др. Обитателями прибрежной морской воды и разнообразных морских организмов являются некоторые виды вибрионов, способные вызывать заболевание человека. Особенно важную роль в эпидемиологии кишечных инфекций играют инфицированные вода и пищевые продукты.

Пути заражения человека

Заражение человека патогенными микроорганизмами может произойти только через поврежденную кожу и слизистые оболочки глаза, дыхательных, пищеварительных и мочеполовых путей. Заражение через неповрежденную кожу если и возможно, то происходит исключительно редко, так как кожа для большинства микроорганизмов трудно проницаема. Однако даже самые ничтожные повреждения ее (укус насекомого, укол иглой, микротравмы и т. п.) могут стать причиной заражения. Место проникновения возбудителя в организм человека или животного называется входными воротами инфекции. В случае, если ими является слизистая оболочка, возможны три типа инфекции: размножение возбудителя на поверхности эпителиальных клеток; проникновение его в клетки с последующим внутриклеточным размножением; проникновение возбудителя через клетки и распространение его по организму.

Способы заражения

Заражение человека происходит одним из следующих способов:

1. Воздушно-капельным или воздушно-пылевым.

2. Фекально-оральным. Возбудитель выделяется с испражнениями или мочой, заражение происходит через рот при употреблении инфицированных пищевых продуктов или воды.

3. Трансмиссивным, т. е. через укусы кровососущих членистоногих.

4. Контактным – прямой контакт с больным, реконвалесцентом, бактерионосителем или через загрязненные предметы обихода, т. е. непрямым контактом.

5. Половым путем.

6. При использовании нестерильных медицинских приборов, особенно шприцев и т. п.

7. Вертикальным, т. е. от матери ребенку через плаценту, во время родов или сразу после них.

Способ заражения, от которого зависит локализация входных ворот возбудителя, имеет немаловажное значение для развития болезни, так как некоторые возбудители могут проникать в организм разными способами. Например, в случае заражения Y. pestis через укусы насекомых (блох) чума протекает в относительно более легкой бубонной форме, а при заражении воздушно-капельным путем развивается наиболее тяжелая форма этой болезни – легочная чума. Точно так же, в зависимости от способа заражения, наблюдаются различные клинические формы туляремии: бубонная или язвенно-бубонная (при трансмиссивном заражении через укусы кровососущих членистоногих), глазо-бубонная (при заражении через слизистую глаза), легочная (при воздушно-пылевом заражении) и т. д.; сибирской язвы (кожная, легочная, кишечная).

Однако для других возбудителей, например ВИЧ, способ заражения не имеет значения: заболевание развивается в одинаковой степени тяжело. В то же время для многих возбудителей существуют преимущественные способы заражения макроорганизма, так, для возбудителей кишечных инфекций – фекально-оральный; возбудителей респираторных заболеваний – воздушно-капельный и др.

Распространение проникших в организм возбудителей может происходить по-разному, в зависимости от свойств возбудителя и имеющихся в клетках ткани рецепторов для них: контактным путем, т. е. от клетки к клетке, лимфогенным или гематогенным путем; некоторые возбудители распространяются по нервным путям.

Кровь здорового человека и животного стерильна, ибо она обладает сильным антимикробным свойством, обусловленным наличием в ней системы комплемента и различных иммунокомпетентных клеток. Однако почти при всех инфекционных процессах в крови появляются и циркулируют в течение различного срока возбудитель заболевания или его токсин, а также образующиеся при распаде возбудителя антигены. Через кровь очень часто происходит распространение возбудителя по организму, т. е. генерализация инфекционного процесса. Выход возбудителя или его антигенов в большом количестве в кровь, как правило, сопровождается лихорадкой, которая не только служит сигналом попадания возбудителя в кровь, но и имеет защитное значение.

Для характеристики явлений, связанных с проникновением в кровь возбудителя, его токсина и антигенов, введены следующие понятия: антигенемия, бактериемия, вирусемия, сепсис, септикопиемия, септицемия, токсемия, токсинемия.

Антигенемия (антиген + греч. haima – кровь) – циркуляция в крови чужеродных антигенов и аутоантигенов. При наличии в крови антител к данному антигену формируются циркулирующие иммунные комплексы – ЦИК (антиген + антитело), способствующие очищению организма от антигенов. С помощью ЦИК антигены выводятся из организма. Выявляют антигены и ЦИК в крови с помощью различных серологических реакций, например, при бруцеллезе – с помощью реакции агрегат-гемагглютинации.

Бактериемия – наличие в циркулирующей крови бактерий – возникает в результате проникновения возбудителя в кровь через естественные барьеры макроорганизма, а также при трансмиссивных инфекциях после укуса кровососущих членистоногих. При заболеваниях, которые передаются членистоногими (сыпной тиф, возвратный тиф, чума, туляремия, риккетсиозы и т. д.), бактериемия – главная и обязательная стадия патогенеза болезни. Она обеспечивает передачу возбудителя другому хозяину, т. е. сохраняет его как вид. Причиной бактериемии могут быть хирургические вмешательства, травмы, лучевая болезнь, злокачественные опухоли, различные тяжелые формы заболеваний, вызванные условно-патогенными бактериями, и т. п. В отличие от сепсиса и септикопиемии, бактерии в крови только циркулируют, но не размножаются. Таким образом, бактериемия – симптом болезни и одна из ее стадий. Диагноз бактериемии ставится путем выделения гемокультуры возбудителя или заражения кровью больного лабораторного животного.

Вирусемия – состояние организма, при котором в его крови циркулируют вирусы.

Сепсис, или гнилокровие (греч. sepsis – гниение) – тяжелое генерализованное острое или хроническое лихорадочное заболевание человека, обусловленное непрерывным или периодическим поступлением в кровь возбудителя из очага гнойного воспаления. Для сепсиса характерно несоответствие тяжелых общих расстройств местным изменениям и частое образование новых очагов гнойного воспаления в различных тканях и органах.

В отличие от бактериемии, при сепсисе из-за снижения бактерицидных свойств крови возбудитель размножается в кровеносной и лимфатической системах.

Чаще всего сепсис является следствием генерализации локализованных гнойных очагов. Этиология сепсиса разнообразна. Наиболее частые его возбудители – стафилококки, стрептококки, грамотрицательные бактерии из семейств Enterobacteriaceae и Pseudomonadaceae, менингококки, другие бактерии, в том числе условно– и слабопатогенные, и некоторые грибы. В зависимости от локализации первичного гнойного очага и места входных ворот возбудителя различают пуэрперальный (послеродовый), отогенный, одонтогенный, послеабортный, перитонеальный, раневой, ожоговый, пупочный, ротовой (стоматогенный), уросепсис и другие формы болезни. Может наблюдаться сепсис новорожденных (неонатальный сепсис), обусловленный инфицированием плода при родах или в период внутриутробного развития. Кроме того, бывает сепсис криптогенный, при котором первичный очаг гнойного воспаления остается нераспознанным.

Септикопиемия – форма сепсиса, при которой наряду с интоксикацией организма происходит образование гнойных метастатических очагов в различных тканях и органах, сочетающееся с присутствием и размножением возбудителя в лимфатической и кровеносной системах.

Септицемия – форма сепсиса, при которой не происходит образования метастатических очагов гнойного воспаления, а единственным местом обитания и размножения возбудителя в организме служат его кровеносная и лимфатическая системы.

Токсемия – состояние организма человека или животного, при котором в его крови циркулируют бактериальные эндотоксины. Наблюдается при тяжелых формах заболеваний, вызванных грамотрицательными бактериями, имеющими эндотоксин (ЛПС), например при сальмонеллезах, эшерихиозах, менингококковых и иных инфекциях. Нередко сочетается с бактериемией и сепсисом.

Токсинемия – состояние организма, при котором в кровеносной системе циркулирует бактериальный экзотоксин или другой токсин. Возбудитель при этом в крови, как правило, отсутствует, а токсин через кровеносную или нервную систему проникает в клетки-мишени. Наблюдается при заболеваниях, возбудители которых продуцируют экзотоксины (ботулизм, дифтерия, столбняк, анаэробная инфекция и др.; поэтому эти болезни называют токсинемическими).

Отдельные виды патогенных микроорганизмов могут поражать любые органы и ткани (возбудитель туберкулеза, патогенные стафилококки и др.). В то же время есть возбудители, для которых характерна органотропность, т. е. способность избирательно поражать определенные ткани. Так, возбудитель туберкулеза чаще всего поражает легочную ткань, гонококки – слизистую уретры и конъюнктиву глаза, вирусы гепатитов – клетки печени, вирус гриппа – слизистую верхних дыхательных путей и т. д. Избирательностью действия обладают и бактериальные экзотоксины. Такая органотропность возбудителей и их токсинов определяется, по-видимому, тремя обстоятельствами. Во-первых, наличием для возбудителей и их экзотоксинов соответствующих рецепторов на мембранах клеток. Во-вторых, особенностями метаболизма микроорганизмов, в соответствии с которыми они находят оптимальные условия для размножения в определенных клетках (или на определенных клетках). В-третьих, это зависит от наличия или отсутствия в данной ткани антимикробных веществ типа лизоцима, ингибина, интерферона и других, подавляющих размножение возбудителя. Локализацией возбудителя в организме определяются и пути его выделения – с испражнениями, мочой, гнойно-воспалительным материалом, мокротой, слюной, слизью и т. п. Эти выделения, а также кровь, спинномозговая жидкость, пунктат лимфоидной ткани и служат чаще всего материалом для бактериологической диагностики инфекционных заболеваний. Знание источников инфекции, свойств возбудителя, путей и способов заражения при инфекционных заболеваниях лежат в основе организации и проведения всех противоэпидемических мероприятий, а также в выборе методов микробиологической диагностики.

Места обитания в организме человека основных возбудителей бактериальных инфекций приведены в табл. 6 (Покровский В. И. [и др.], 1991).

Таблица 6

Преимущественные места обитания в организме человека основных возбудителей бактериальных инфекций и микозов

Примечание: +обнаруживаются часто; ± наличие возможно; – обнаруживаются редко.

На современном этапе развития медицины антибиотики – наиболее эффективные препараты для лечения заболеваний, вызываемых микроорганизмами.

Понятие «антибиотики» предложено С. Ваксманом. Под антибиотиками он понимает такие «химические вещества, образуемые микроорганизмами, которые обладают способностью подавлять рост или даже разрушать бактерии и другие микроорганизмы».

Однако З. В. Ермольева дала более широкое толкование этому понятию: «Антибиотики – вещества природного происхождения, обладающие выраженной биологической активностью. Они могут быть получены из микробов, растений, животных тканей и синтетическим путем».

Каждый антибиотик обладает специфическим избирательным действием на определенные виды микробов. Благодаря такому избирательному действию многие антибиотики способны подавлять жизнедеятельность патогенных микробов в безвредных для организма концентрациях. Такие антибиотики широко используют для лечения различных инфекционных болезней.

Основными продуцентами антибиотиков служат микроорганизмы, обитающие в почве и воде, где они постоянно вступают между собой в самые разнообразные взаимоотношения. Последние могут быть нейтральными, взаимовыгодными (например, деятельность гнилостных бактерий создает условия для деятельности нитрифицирующих бактерий), но очень часто они являются антагонистическими. И это понятно. Только таким путем в природе могло сложиться сбалансированное сосуществование громадного числа видов живых существ. Антагонистические взаимоотношения между бактериями наблюдал еще Л. Пастер. И. И. Мечников предложил использовать антагонизм между бактериями на пользу человеку. Он, в частности, рекомендовал подавлять активность гнилостных бактерий в кишечнике человека, продукты жизнедеятельности которых, по его мнению, сокращают жизнь человека, молочнокислыми бактериями.

Механизмы микробного антагонизма различны. Они могут быть связаны с конкуренцией за кислород и питательные вещества, с изменением рН среды в сторону, неблагоприятную для конкурента, и т. д.

Одним из универсальных механизмов микробного антагонизма является синтез химических веществ-антибиотиков, которые либо подавляют рост и размножение других видов микроорганизмов (бактериостатическое действие), либо убивают их (бактерицидное действие).

Источники антибиотиков в природе неисчерпаемы. Их обнаружены тысячи, но далеко не все из них могут быть использованы в медицине. Чтобы быть хорошим лечебным средством, антибиотик должен иметь по крайней мере некоторые обязательные свойства.

1. При низкой концентрации (10 – 30 мкг/мл) он должен убивать возбудителя болезни или подавлять его рост и размножение.

2. Активность антибиотика не должна существенно снижаться под действием жидкостей организма.

3. Он должен быстро воздействовать на микроорганизм, чтобы за короткий срок прервать его жизненный цикл.

4. Антибиотик не должен вредить макроорганизму. Аллергенность и токсичность и после введения разовой дозы, и после многократного введения должны отсутствовать.

5. Антибиотик не должен препятствовать процессу выздоровления.

6. Антибиотик не должен снижать и тем более подавлять иммунологические реакции. Он не должен наносить никакого ущерба иммунной системе организма.

Правда, здесь есть исключения. Речь идет о поиске таких антибиотиков, которые бы подавляли трансплантационный иммунитет. К числу последних относится циклоспорин А, который обладает мощным иммуносупрессивным действием. Однако его широкому применению препятствует цитотоксическое действие на почки. Поэтому поиск иммуносупрессивных антибиотиков, лишенных токсических свойств, представляет большой интерес.

Наконец, исключительное значение представляет поиск таких антибиотиков, которые бы обладали способностью стимулировать противоопухолевый иммунитет. К сожалению, успехи в этом направлении пока очень скромны, хотя и не безнадежны.

Наступлению эры антибиотикотерапии предшествовал длительный период разработки эффективных методов химиотерапии. Медицину всегда привлекала идея таких химических препаратов, которые бы избирательно, не нанося вреда макроорганизму, воздействовали на возбудителя какой-либо болезни, а еще лучше – на многих возбудителей.

Датой зарождения научной химиотерапии следует считать 1891 г., когда русский врач Д. А. Романовский впервые доказал возможность воздействия лекарственного средства на возбудитель в организме человека (хинина на малярийный плазмодий) и впервые сформулировал основные принципы химиотерапии инфекционных болезней вообще.

Эти принципы получили дальнейшее использование и развитие в классических работах П. Эрлиха, который применил метод химической вариации исходных антибактериальных веществ и ввел понятие химиотерапевтического индекса для оценки качества лечебных препаратов. Индекс представляет собой отношение максимальной переносимой дозы к минимальной лечебной дозе и не должен быть менее 3.

В результате для лечения инфекционных болезней стали применять самые различные препараты, в том числе мышьяковистые – сальварсан, новарсенол и другие для лечения сифилиса, возвратного тифа и других болезней; висмута – для лечения энтероколитов, а сейчас и язвы желудка и двенадцатиперстной кишки; производные сурьмы, ртути, акридина, препараты нитрофуранового ряда (фуразолидон, фурадонин и др.); различные противомалярийные средства (акрихин, плазмоцид, бигумаль, хлоридин, хиноцид и др.); производные парааминосалициловой кислоты (ПАСК) и изоникотиновой кислоты, которые применяют для лечения туберкулеза, а также различные другие химические соединения.

Большую роль в развитии химиотерапии сыграли работы Г. Домагка, в результате которых в 1932 г. был открыт путь к созданию большого семейства сульфаниламидных препаратов (стрептоцид, норсульфазол, сульфазин, метилсульфазин, сульфадимезин, фталазол, сульгин и др.).

Сульфаниламидные препараты оказались весьма эффективным средством для лечения различных гнойно-воспалительных заболеваний, пневмонии, дизентерии и других болезней.

Однако поистине революционное значение для медицины имело открытие антибиотиков, которые по своей антибактериальной эффективности превзошли все применявшиеся ранее химиопрепараты.

История открытия антибиотиков связана с именами английского ученого А. Флеминга и американских ученых Г. Дюбо и С. Ваксмана. А. Флеминг в 1929 г. установил, что фильтрат культуры плесневого гриба Penicillium notatum содержит какое-то вещество, угнетающее рост стафилококка. Это вещество и получило название пенициллина. Однако в чистом виде препарат был получен лишь в 1940 г., после чего стало возможным установить его химическую природу, а затем и наладить промышленное производство этого препарата, оказавшегося истинным королем антибиотиков по силе воздействия на бактерии и относительной безвредности для человека. Г. Дюбо выделил из культуры Bacillus brevis два антибиотика – тироцидин и грамицидин, однако они не получили столь широкого применения, как пенициллин. Последний оказался очень эффективным для лечения гнойно-воспалительных заболеваний, вызываемых стафилококками, которые по своей частоте всегда занимали ведущее место среди прочих бактериальных инфекций. Вместе с тем пенициллин оказался эффективным средством и против других видов грамположительных бактерий.

С. Ваксман открыл ряд антибиотиков, продуцентами которых были различные виды актиномицетов, и в том числе в 1944 г. – стрептомицин; его продуцентом является Actinomyces griseus.

Значение открытия стрептомицина заключается в том, что он и его производные оказались очень эффективными препаратами для лечения туберкулеза и чумы. Кроме того, стрептомицин оказался гораздо более эффективным, чем пенициллин, против грамотрицательных бактерий.

В связи с открытием пенициллина и стрептомицина стало возможным успешно лечить б^ольшую часть бактериальных инфекций. Фактически в течение двух десятилетий (с 1940 по 1960 гг.) были открыты все наиболее часто применяемые антибиотики: стрептомицин (1944); хлорамфеникол, полимиксин (1947); хлортетрациклин (1948); бензилпенициллин, неомицин (1949); нистатин (1950); эритромицин, циклосерин (1952); новобиоцин (1953); олеандомицин (1954); канамицин (1955); леворин (1959). Темпы изыскания новых и совершенствования препаратов на основе старых антибиотиков не снижаются. Возникла и развивается быстрыми темпами промышленность, в том числе на основе биологической технологии, производящая антибиотики в огромном количестве. Если в 1943 г. было произведено всего 13 кг пенициллина, то сейчас ежегодно выпускаются десятки тысяч тонн антибиотиков все новых и новых поколений. Одних только антибиотиков пенициллинового ряда (бета-лактамные антибиотики) выпускается около 100 наименований препаратов. Они по-прежнему занимают доминирующее положение в клинике.

Результаты применения антибиотиков в медицине оказались исключительно впечатляющими. Они во много раз сократили смертность, особенно детскую, от инфекционных болезней, смягчили тяжесть их течения, уменьшили количество постинфекционных осложнений. В результате применения антибиотиков уже к концу 50-х гг. XX в. средняя продолжительность жизни людей на Земле, особенно в развивающихся странах, заметно выросла. Не менее важную роль сыграли и играют антибиотики и в сельском хозяйстве, особенно в животноводстве и птицеводстве, для лечения и профилактики инфекционных заболеваний среди поголовья скота и птиц.

Широкое применение сульфаниламидных препаратов и особенно антибиотиков породило новую сложную проблему – проблему лекарственной устойчивости микроорганизмов. Ее последствия и меры борьбы с ней лучше всего можно проследить на примере антибиотиков пенициллинового ряда.

Пенициллины – это сложные соединения, основу молекул которых составляет бета-лактамное кольцо, общая структура их представлена на рис. 55. Буквой R обозначен радикал, который может иметь различное строение, в соответствии с которым известно большое число природных типов пенициллинов. Наиболее активным из них оказался бензилпенициллин с радикалом С₆Н₅– СН₂– .

До 1945 г. процент стафилококков, устойчивых к пенициллину, не превышал 5 – 10 %. Однако по мере все более широкого использования антибиотиков возрастало и количество устойчивых к нему штаммов, и к началу 1960-х гг. оно уже достигло 75 – 80 %. Это повлекло за собой и резкое снижение эффективности лечения пенициллином. Стали искать пути преодоления резистентности к нему. Решению этой проблемы помогло изучение путей биосинтеза пенициллина. В качестве продукта его биосинтеза в 1959 г. была выделена 6-аминопенициллановая кислота (рис. 56).

Рис. 55. Структура пенициллинов

Рис. 56. 6-Аминопенициллановая кислота (6-АПК)

C открытием 6-АПК как основной бициклической системы, которая входит в состав молекулы антибиотика, появилась возможность синтеза путем ацилирования свободной аминной группы пенициллинов нового поколения – полусинтетических пенициллинов: метициллина, ампициллина, оксациллина, клоксациллина и т. д. Их преимущество перед бензилпенициллином заключается в том, что, обладая сходным с бензилпенициллином спектром антибактериального действия, они оказались активными в отношении пенициллинрезистентных штаммов, за исключением ампициллина, но зато последний оказался активным в отношении многих грамотрицательных бактерий. Однако постепенно и к этим новым пенициллинам появились резистентные штаммы стафилококков и других бактерий.

Их резистентность, как и резистентность к бензилпенициллину, оказалась связанной с образованием ферментов, разрушающих бета-лактамное кольцо, – бета-лактамаз. Следующим шагом на пути преодоления устойчивости к пенициллиновым антибиотикам стало получение антибиотиков цефалоспоринов, продуцентами которых служат грибы рода Cephalosporium. Цефалоспорины по биологическим свойствам и химическому строению принадлежат к пенициллинам, но несколько отличаются от них. Ядро молекулы цефалоспоринов составляет 7-аминоцефалоспорановая кислота, которая послужила основой для получения новых препаратов цефалоспоринов (рис. 57). Они, в отличие от пенициллинов, обладают значительно меньшей аллергической активностью и более широким спектром действия, подавляют развитие как грамположительных (в том числе устойчивых к пенициллинам), так и грамотрицательных бактерий.

Например, цефтриаксон – цефалоспорин третьего поколения – устойчив к беталактамазам, имеет широкий спектр действия – подавляет грамположительные и грамотрицательные бактерии, аэробные и некоторые анаэробные. Но и к цефалоспоринам появились резистентные штаммы бактерий, обладающие бета-лактамазами, способными разрушать молекулу цефалоспорина. Бета-лактамазы – один из главных факторов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам большинства бактерий. Существуют различные классы бета-лактамаз, продуцируемых разными видами бактерий и отличающихся друг от друга по специфичности действия в отношении различных пенициллинов и цефалоспоринов. При этом инактивация последних происходит либо вне клетки, либо внутри ее. Бета-лактамазы гидролизуют пенициллины и цефалоспорины, в результате чего они не успевают проявить свое антимикробное действие. Гены, контролирующие синтез бета-лактамаз, могут быть хромосомными или плазмидными. Бета-лактамазы хромосомного происхождения могут быть конститутивными или индуцибельными.

Рис. 57. 7-Аминоцефалоспорановая кислота (7-АЦК)

Рис. 58. Клавулановая кислота

Для преодоления устойчивости к бета-лактамным антибиотикам использован принципиально новый подход. Он заключается в поиске таких антибиотиков, которые бы разрушали бета-лактамазу. Наиболее мощным ингибитором бета-лактамаз 2 – 5-го классов оказалась клавулановая кислота (рис. 58).

Ее продуцентом является один из видов Streptomyces. Подобно пенициллинам и цефалоспоринам, клавулановая кислота содержит бета-лактамное кольцо, но сама по себе – слабый антибиотик. Зато ее молекула способна проникать в активный центр беталактамазы и вызывать реакции, в результате которых молекула бета-лактамазы ацилируется, и фермент утрачивает свою активность.

На основе амоксициллина – пенициллина широкого спектра действия – и клавулановой кислоты (ингибитора бета-лактамазы) синтезирован комбинированный антибиотик – аугментин. Использование амоксициллина, а не ампициллина, обусловлено тем, что амоксициллин обладает более сильным бактерицидным действием и лучше проникает в ткани и жидкости организма. Резистентные к амоксициллину бактерии также являются чувствительными к аугментину. По своей антибактериальной активности аугментин превосходит большинство антибиотиков широкого спектра. Он активен в отношении грамположительных и грамотрицательных, аэробных и анаэробных бактерий, в том числе и тех, которые вырабатывают беталактамазу. Поэтому он незаменим при инфекциях, где имеется ассоциация разных возбудителей, например при различных гнойно-воспалительных заболеваниях, септицемиях, в случае смешанных аэробно-анаэробных инфекций, а также для эмпирического лечения в тех случаях, когда возбудитель болезни еще не установлен.

Другим примером комбинированного препарата является сулациллин, который состоит из сульбактама – ингибитора бета-лактамаз грамположительных и грамотрицательных бактерий – и ампициллина.

Таким образом, арсенал бета-лактамных антибиотиков по мере появления резистентных к ним форм бактерий пополняется все новыми и новыми препаратами.

Основные группы антибиотиков

Механизм действия антибиотиков

Всем антибиотикам свойственна избирательность действия. Их относительная безвредность для человека определяется прежде всего тем, что они специфически подавляют такие метаболические процессы в микробной клетке или у вируса, которые отсутствуют в эукариотной клетке или не доступны для них. В этом отношении уникален механизм действия бета-лактамных антибиотиков. Мишенями для них являются транспептидазы, которые завершают синтез пептидогликана клеточной стенки. Поскольку клеточная стенка есть только у прокариот, в эукариотной клетке нет мишеней для бета-лактамных антибиотиков. Транспептидазы представляют собой набор белков-ферментов, локализованных в цитоплазматической мембране бактериальной клетки. Отдельные бета-лактамы различаются по степени сродства к тому или иному ферменту, которые получили название пенициллинсвязывающих белков. Поэтому биологический эффект бета-лактамных антибиотиков различен – от бактериостатического до бактерицидного, литического.

Кроме бета-лактамных антибиотиков, синтез клеточной стенки нарушают такие антибиотики, как бацитрацин, фосфомицин, циклосерин, ванкомицин, ристомицин, однако иным путем, чем пенициллин. Все они, кроме циклосерина, вызывают бактерицидный эффект.

Механизм действия таких антибиотиков, как хлорамфеникол, тетрациклины, стрептомицин, аминогликозиды, эритромицин, олеандомицин, спирамицин и другие макролиды, линкозамиды, фузидиевая кислота, пуромицин, связан с угнетением синтеза белка на уровне рибосом 70S. Хотя бактериальные рибосомы 70S имеют такую же в принципе структуру, как рибосомы 80S эукариотных клеток, их белки и белковые факторы, участвующие в работе белоксинтезирующей системы, отличаются от таковых рибосом 80S. Этим и объясняется избирательность действия указанных антибиотиков на белковый синтез бактерий.

Антибиотики по-разному блокируют синтез белка. Тетрациклины блокируют связывание аа-тРНК на А-участке рибосомы 70S. Хлорамфеникол подавляет пептидилтрансферазную реакцию. Стрептомицины препятствуют превращению инициаторного комплекса в функционально активную рибосому. Эритромицин блокирует реакцию транслокации. Пуромицин, присоединяясь к растущему концу синтезируемой полипептидной цепи, вызывает преждевременное отделение ее от рибосомы. Механизм действия фторхинолонов связан с избирательным подавлением ими бактериальных ферментов ДНК-гираз, участвующих в репликации ДНК. Фторхинолоны связываются со специфическими участками ДНК, которые создаются под воздействием ДНК-гиразы, и подавляют ее активность.

Рифампицины угнетают активность ДНК-зависимых РНК-полимераз, вследствие чего у бактерий подавляются процессы транскрипции.

Активность противоопухолевых антибиотиков связана с тем, что они либо подавляют синтез ДНК (брунеомицин), либо подавляют активность ДНК в системе ДНК-зависимой РНК-полимеразы, т. е. блокируют транскрипцию (антрациклины, актиномицины, оливомицин).

Лекарственная устойчивость бактерий

Существуют два типа лекарственной устойчивости бактерий: естественная, или природная, и приобретенная.

Естественная лекарственная устойчивость является видовым признаком. Она присуща всем представителям данного вида и не зависит от первичного контакта (контактов) с данным антибиотиком, в ее основе нет никаких специфических механизмов. Чаще всего эта резистентность связана с недоступностью мишеней для данного антибиотика, обусловленной очень слабой проницаемостью клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, или какими-либо другими причинами. Если низкая проницаемость свойственна нескольким антибиотикам, то она будет обусловливать полирезистентность таких бактерий.

Приобретенная лекарственная устойчивость возникает у отдельных представителей данного вида бактерий только в результате изменения их генома. Возможны два варианта генетических изменений. Один из них связан с мутациями в тех или иных генах бактериальной хромосомы, вследствие которых продукт атакуемого гена перестает быть мишенью для данного антибиотика. Это происходит либо вследствие изменения структуры белка, либо потому, что он становится недоступным для антибиотика.

В другом случае бактерии становятся устойчивыми к антибиотику или даже сразу к нескольким антибиотикам благодаря приобретению дополнительных генов, носителями которых являются R-плазмиды. Никаких других механизмов приобретенной лекарственной устойчивости не существует. Однако, приобретая устойчивость к антибиотику, а тем более сразу к нескольким антибиотикам, такие бактерии получают наивыгоднейшие преимущества: благодаря селективному давлению антибиотиков происходит вытеснение чувствительных к ним штаммов данного вида, а антибиотикоустойчивые варианты выживают и начинают играть главную роль в эпидемиологии данного заболевания. Именно они и становятся источниками формирования тех клонов бактерий, которые обеспечивают эпидемическое распространение возбудителя. Решающую роль в распространении лекарственной устойчивости, в том числе множественной, играют R-плазмиды благодаря способности их к самопереносу.

Биохимические основы антибиотикорезистентности

Можно выделить следующие пять биохимических механизмов формирования резистентности:

1. Разрушение молекулы антибиотика. Такой механизм лежит главным образом в основе формирования устойчивости к бета-лактамным антибиотикам. Бета-лактамазы, разрушая структуру пенициллинов и цефалоспоринов, обеспечивают устойчивость к ним бактерий.

2. Модификация структуры молекулы антибиотика, в результате которой утрачивается ее биологическая активность. Гены, содержащиеся в R-плазмидах, кодируют белки, которые вызывают различные модификации молекул антибиотика путем их ацетилирования, фосфорилирования или аденилирования. Именно таким путем инактивируются аминогликозиды, макролиды, хлорамфеникол, клиндамицин и другие антибиотики. Существуют целые семейства генов, определяющих инактивацию того или иного антибиотика даже по одному из указанных выше механизмов. Например, среди клинических штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий обнаружены различные изоферменты аминогликозидфосфо-, – ацетил– и – аденилтрансфераз, обеспечивающие устойчивость бактерий к различным спектрам аминогликозидных антибиотиков.

3. Изменение структуры чувствительных к действию антибиотиков мишеней. Изменение структуры белков рибосом 70S лежит в основе устойчивости к стрептомицину, аминогликозидам, макролидам, тетрациклинам и другим антибиотикам. Изменение структуры бактериальных гираз в результате мутации приводит к формированию устойчивости к хинолонам; РНК-полимераз – к рифампицину; пенициллинсвязывающих белков (транспептидаз) – к бета-лактамам и т. п.

4. Образование бактериями «обходного» пути метаболизма для биосинтеза белка-мишени, который оказывается нечувствительным к данному химиопрепарату, – механизм, который лежит в основе резистентности к сульфаниламидным препаратам. 5. Формирование механизма активного выведения из клетки антибиотика, в результате чего он не успевает достичь своей мишени (один из вариантов устойчивости к тетрациклинам).

Необычный механизм устойчивости к изониазиду обнаружен у Mycobacterium tuberculosis. Действие изониазида на туберкулезную палочку зависит от наличия у последней плазмиды, в составе которой имеется особый ген. Продукт этого гена превращает неактивный изониазид в активную форму, которая разрушает бактериальную клетку. Утрата этого гена обусловливает устойчивость M. tuberculosis к изониазиду.

В некоторых случаях инактивацию антибиотиков, которая лежит в основе резистентности к ним, бактерии могут осуществлять разными механизмами. Так, например, существует три механизма, ответственных за формирование устойчивости к бета-лактамным антибиотикам: слабая проницаемость наружной мембраны клеточной стенки грамотрицательных бактерий, обеспечивающая природную устойчивость; изменение структуры пенициллинсвязывающих белков в результате мутаций, которое приводит к утрате их сродства к антибиотику; продукция бета-лактамаз, разрушающих антибиотик. Существует три типа устойчивости и к тетрациклинам: 1) устойчивость, определяемая выносом тетрациклина из клетки белком цитоплазматической мембраны; 2) устойчивость, определяемая изменением структуры белка-мишени рибосом; 3) устойчивость, определяемая модификацией тетрациклина в неактивную форму.

Возможно, у бактерий существуют и другие механизмы формирования устойчивости к лекарственным препаратам.

Таким образом, в ответ на мощный натиск, который предпринял человек на бактерии с помощью антибиотиков, они ответили уникальными биологическими реакциями, сила которых не уступает силе атаки. На каждый новый антибиотик бактерии давали адекватный ответ: появлялись резистентные к нему штаммы, которые и сводили на нет биологическую активность этого препарата. Так было и так будет всегда. С этим нельзя не считаться и этого нельзя не учитывать. Поэтому следует постоянно искать пути преодоления этого препятствия, ибо пока существуют инфекционные болезни, их надо уметь эффективно лечить. Пути преодоления устойчивости к лекарственным препаратам будут рассмотрены ниже.

Возникает вопрос: каковы возможности и пути образования лекарственной устойчивости у бактерий? Поскольку они формируются только на генетическом уровне, то возникает и другой вопрос: откуда появляются новые гены лекарственной устойчивости? Устойчивость, возникающая как следствие мутации, объяснима и понятна, но не она играет основную роль. Основная роль принадлежит генам, которые содержатся в R-плазмидах, а они ведь не могут возникать сразу, de novo. Следовательно, в природе должен существовать своеобразный фонд генов лекарственной устойчивости, откуда бактерии могут постоянно «захватывать» те гены, которые необходимы для них в данной ситуации. Наиболее вероятно, что такой фонд образуется за счет генов, имеющихся у продуцентов антибиотиков. Каждый из них защищен от синтезируемого им антибиотика. Эта самозащита контролируется соответствующим геном. Следовательно, сколько бы ни было в природе антибиотиков, против каждого из них должен быть и ген самозащиты, ген устойчивости к этому антибиотику. В природе, особенно в почве, а также в кишечнике человека и животных, микроорганизмы сосуществуют в столь тесных взаимоотношениях, что это обеспечивает им постоянную возможность обмена генетическим материалом с помощью различных механизмов, в том числе с помощью конъюгации. Поскольку многие гены лекарственной устойчивости несут в себе транспонируемые элементы, это обеспечивает им высокую мобильность. Они могут перемещаться внутри хромосомы, переходить из хромосом в плазмиды, формировать новые варианты плазмид и подвергаться другим превращениям. Таким образом, обмен генами лекарственной устойчивости между микроорганизмами в естественных условиях, очевидно, вполне возможен. Решающую роль в их распространении среди возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных начинает играть уже сам антибиотик. Опыт показывает, что раньше всего гены лекарственной устойчивости к каждому новому антибиотику появляются у клинических штаммов, а затем начинается их дальнейшая циркуляция в природе. Обладая определенной мобильностью, эти гены сами подвергаются модификации, мутациям, а в результате образуют группы, семейства генов, определяющих устойчивость к различным вариантам модифицированного антибиотика. Хотя многое еще придется изучить в этом плане, но общая тенденция и масштабы развития у бактерий лекарственной устойчивости уже вполне объяснимы.

Каковы же возможные перспективы поиска новых антибиотиков, иначе говоря, какими новыми свойствами должны обладать новые антибиотики, чтобы преодолеть известные у бактерий механизмы защиты от них?

Желателен поиск таких антибиотиков, которые бы:

1) имели иную молекулярную структуру и иные мишени в бактериальной клетке, отсутствующие (или, по крайней мере, хорошо защищенные от данного антибиотика) в эукариотной клетке;

2) обладали новым механизмом транспорта в бактериальную клетку;

3) были бы нечувствительны к защитным ферментам и не индуцировали бы их синтез;

4) отвечали бы всем остальным требованиям, предъявляемым к антибиотикам.

Способы определения чувствительности (резистентности) бактерий к химиопрепаратам

Чувствительными к антибиотикам и химиопрепаратам в клинической практике считаются те микроорганизмы, на которые препарат в концентрации, достигаемой в очаге инфекции, оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие. Поэтому критерии чувствительности возбудителя зависят от концентрации лечебного препарата в очаге инфекции, величины максимальной терапевтической дозы химиопрепарата, его фармакокинетики и токсичности.

Существуют различные способы определения чувствительности бактерий к антибиотикам, но чаще всего используются два из них: метод диффузии в агар с применением стандартных дисков, пропитанных антибиотиком, и метод серийных разведений антибиотика.

Первый из них заключается в использовании заранее приготовленных из фильтровального картона дисков диаметром 6 ± 0,5 мм. В России выпускается более 20 стандартных дисков. Содержание антибиотика в диске указано на этикетке и соответствует рекомендациям ВОЗ. Содержание антибиотика в диске варьирует в зависимости от его терапевтической дозы и выражается в мкг/мл или в единицах действия (ЕД). Диски одного наименования содержат одну дозу антибиотика; она составляет: 5 мкг/мл (рифампицин), 6 мкг/мл или 10 мкг/мл (бензилпенициллин), 10 мкг/мл (ампициллин, метициллин, оксациллин, гентамицин, сизомицин, доксициклин, фузидин), 15 мкг/мл (эритромицин, линкомицин, олеандомицин), 25 мкг/мл (карбенициллин), 30 мкг/мл (цефалексин, цефалотин, неомицин, стрептомицин, канамицин, мономицин, тетрациклин, левомицетин, ристомицин), 300 ЕД (полимиксин). Диски с различными антибиотиками отличаются друг от друга по цвету (белые, зеленые, желтые и т. д.) или коду, который представляет собой первую букву названия антибиотика, вытисненную на диске.

Поскольку определяемая in vitro степень чувствительности микробов к антибиотикам зависит от условий опыта, для получения достоверных и воспроизводимых результатов необходимо точное соблюдение правил, регламентированных соответствующими методическими указаниями, а также использование стандартных питательных сред и дисков. Оценка результатов определения чувствительности основана на установлении зависимости между размером зон подавления роста исследуемых культур вокруг дисков с антибиотиками и значениями минимальных подавляющих концентраций (МПК) соответствующих антибиотиков в отношении тех или иных культур. Установление такой зависимости в соответствии с методическими указаниями позволяет придать оценке результатов полуколичественный характер и отнести исследуемые культуры бактерий к одной из трех категорий: устойчивые, умеренно устойчивые, чувствительные.

Для испытания чувствительности диски с антибиотиками наносят на поверхность агара, на который перед этим засевают исследуемую культуру. На одну чашку помещают не более 6 дисков. Чашки инкубируют в термостате в течение 18 – 20 часов при температуре 35 – 37 °C. После этого с помощью линейки измеряют диаметр зон задержки роста вокруг дисков (включая диаметр самих дисков) с точностью до 1 мм (рис. 59). Оценку результатов проводят с помощью специальной таблицы, имеющейся в «Методических указаниях по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков» (1983). Эта таблица содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов. Перечень основных микроорганизмов, подлежащих эпидемиологическому наблюдению, и их кодовые наименования приведены в табл. 7.

Более точным является количественный метод, позволяющий определить минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика, выраженную в мкг/мл. С этой целью делают серийные разведения антибиотика и добавляют их в жидкую или плотную питательную среду, а затем определяют, при какой минимальной концентрации антибиотика произошло подавление роста исследуемого штамма возбудителя.

Рис. 59. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам с помощью стандартных дисков

Таблица 7

Основные микроорганизмы – возбудители инфекционно-воспалительных заболеваний

Примечание. Кодовые наименования соответствуют протоколу ВОЗ.

Бактериологические анализаторы. С целью совершенствования методов бактериологической диагностики инфекционных заболеваний и одновременного определения чувствительности возбудителя к антибиотикам разработаны и широко внедряются в практику различные автоматические и полуавтоматические бактериологические анализаторы, которые позволяют избавить бактериолога от значительной части рутинной работы, в широких пределах проводить идентификацию культуры и изучать ее чувствительность к антибактериальным препаратам, быстро получая достоверные результаты. В комплект автоматического бактериологического анализатора (например, серии WalkAway компании Dade AG) входят автоматический анализатор с поддержанием постоянной температуры и влажности, персональный компьютер с программным обеспечением, принтер для нанесения штриховых кодов и принтер для распечатки результатов, прибор для стандартизации мутности. С помощью инокулятора-регидратора суспензия первично выделенной культуры переносится в панели с ячейками, содержащими различные тест-субстраты (более 30), с помощью которых за короткий срок удается дифференцировать многие виды бактерий по их биохимическим свойствам. Кроме того, имеются панели с ячейками, содержащими антибиотики (более 40 препаратов в 30 различных комбинациях). Идентификация и проверка чувствительности к антибиотикам осуществляются за 2 – 3,5 ч спектрофотометрическим и флуоресцентным методами. Система позволяет идентифицировать более 300 видов микроорганизмов, в том числе грамположительные, грамотрицательные, грибы, анаэробы и др. Программное обеспечение позволяет выбирать наиболее эффективный лекарственный препарат с учетом путей его введения, контролировать проводимую антибиотикотерапию, осуществлять ее стоимостный анализ, а также решать вопросы эпидемиологического анализа и контроля, сохранять и обрабатывать полученную информацию.

Побочные реакции, наблюдаемые при антибиотикотерапии

Хотя к антибиотикам предъявляются жесткие требования в отношении их безвредности для человека, в некоторых случаях, особенно при неоднократном или длительном применении, наблюдаются нежелательные реакции, которые можно разделить на следующие 4 группы: аллергические, токсические, эндотоксические и дисбактериозы. Аллергические реакции наблюдаются в тех случаях, когда антибиотик выступает в качестве аллергена. Они не зависят от дозы введенного препарата, могут наступать за первым введением его, но обычно возникают в результате постепенной сенсибилизации при повторных применениях антибиотика. Могут носить характер крапивницы, дерматита, сыпи, ринита и т. п. Наибольшую опасность представляет пенициллиновый шок – реакция гиперчувствительности немедленного типа.

Токсические реакции возникают чаще всего в связи с органотропным фармакодинамическим действием антибиотика и при продолжительном лечении. Проявляются в виде поражения вестибулярного аппарата (неомицин, канамицин, стрептомицин, флоримицин и некоторые другие), почек (полимиксин, бацитрацин, неомицин, мономицин, канамицин, стрептомицин, амфотерицин В и некоторые другие), периферических нервов, различных поражений ЦНС (циклосерин, неомицин, полимиксин, гризеофульвин, пенициллин, стрептомицин и некоторые другие) и других нарушений.

Наиболее тяжелым бывает токсическое воздействие на кровь: агранулоцитоз, апластическая анемия (левомицетин).

Эндотоксические реакции развиваются в тех случаях, когда под влиянием антибиотика происходит массовое разрушение грамотрицательных бактерий, сопровождающееся выделением и поступлением в кровь их эндотоксина (липополисахарида).

Одним из самых частых осложнений, особенно при длительном применении антибиотиков с широким антимикробным спектром, являются дисбактериозы. Они развиваются в результате того, что применяемый антибиотик действует не только на возбудителя, но и на нормальную микрофлору, угнетая ее. Это ведет к тому, что беспрепятственно начинают размножаться те микроорганизмы, которые к этому антибиотику нечувствительны. Чаще всего это стафилококки, дрожжеподобные грибы Candida, клостридии, некоторые грамотрицательные палочки (псевдомонады, протей и др.). Наиболее тяжело протекают генерализованный кандидоз (кандидосепсис); стафилококковый энтероколит; псевдомембранозный колит, вызываемый Clostridium difficile; вторичные пневмонии, вызываемые стафилококком и грамотрицательными палочками.

Некоторые принципы рациональной антибиотикотерапии

Рациональное лечение антибиотиками должно строиться на основе знания индивидуальных особенностей пациента, течения заболевания, биологии возбудителя и его отношения к антибиотикам, а также свойств назначаемого препарата (препаратов). По мнению С. М. Навашина, необходимо придерживаться следующих основных принципов рациональной антибиотикотерапии:

1) выделение и идентификация возбудителя, изучение его антибиотикограммы;

2) выбор наиболее активного и наименее токсичного препарата;

3) определение оптимальных доз и методов введения на основе знания особенностей кинетики антибиотика в организме больного для создания в крови, жидкостях и тканях организма терапевтических концентраций, превышающих в 2 – 3 раза минимальную подавляющую концентрацию для данного возбудителя;

4) своевременное начало лечения и проведение курсов антибиотикотерапии необходимой продолжительности вплоть до полного закрепления терапевтического эффекта;

5) знание характера и частоты побочных явлений при назначении антибиотиков, особенно в условиях нарушения их распределения в организме больного при некоторых патологических состояниях, например почечно-печеночной недостаточности;

6) комбинирование антибиотиков между собой и с другими препаратами с целью усиления антибактериального эффекта, улучшения их фармакокинетики и снижения частоты побочных явлений.

Эффективность антибиотикотерапии может быть значительно повышена при комбинированном применении препаратов. При сочетании бактерицидных антибиотиков в большинстве случаев действие их усиливается. Комбинация антибиотиков с бактериостатическим действием вызывает суммирование эффекта или не оказывает дополнительного влияния на возбудителя. Сочетание же бактерицидных и бактериостатических антибиотиков нежелательно, так как может привести к их антагонизму (например, пенициллин + тетрациклины). Наиболее эффективными признаны сочетания антибиотиков, которые оказывают синергидный эффект – резкое усиление терапевтической активности:

пенициллины + аминогликозиды,

тетрациклины + макролиды,

пенициллины + сульфаниламиды.

Ни в коем случае нельзя комбинировать антибиотики с идентичным характером побочных реакций (например, ото-, нефро-, гепато-, гемотоксичность).

В тех случаях, когда необходимо прибегать к эмпирическому лечению антибиотиком (т. е. до выделения возбудителя и определения его антибиотикограммы), лучше всего применять тот препарат, который обладает широким антимикробным спектром и к которому еще нет резистентности, например аугментин.

Под видовым иммунитетом понимают невосприимчивость, обусловленную врожденными биологическими особенностями, присущими данному виду животных или человеку. По сути дела, это видовой признак, передающийся по наследству, подобно любому другому признаку вида. Примером подобной формы невосприимчивости может служить иммунитет человека к чуме рогатого скота, животных – к брюшному тифу, дизентерии и т. д. Видовой иммунитет может проявляться у животных одного и того же вида ко многим инфекционным агентам и у разных видов к одному и тому же возбудителю, например, к полиомиелиту невосприимчивы все млекопитающие, кроме обезьян, человека и некоторых видов грызунов. В основе видового иммунитета лежат различные механизмы естественной неспецифической резистентности. В связи с этим многие ученые предполагают, что данную форму невосприимчивости правильней называть не иммунитетом, а естественной неспецифической резистентностью. Характерными особенностями ее являются наследственная передача и отсутствие специфичности.

Биологические факторы, обусловливающие видовую резистентность, не имеют какой-либо избирательной направленности в отношении только одного какого-то возбудителя, их защитная роль проявляется независимо от природы вредного агента. По отношению ко многим возбудителям видовой иммунитет бывает весьма стойким, но не абсолютным. При изменении условий внешней среды в ряде случаев видовой иммунитет может быть преодолен. Например, в обычных условиях лягушка невосприимчива к столбняку, но если после введения возбудителя столбняка лягушку поместить в термостат при температуре 37 °C, она заболевает типичной формой столбняка. Резистентность человеческого организма к инфекционным болезням зависит от пола, возраста, климатических условий, времени года и в значительной степени от социально-экономических условий жизни. Как правило, резистентность наиболее высока, когда организм функционирует нормально во всех отношениях, и снижается под влиянием различных факторов, которые нарушают нормальное физиологическое состояние. В ряде случаев перенесенное заболевание до такой степени снижает резистентность организма, что менее вирулентные бактерии могут стать причиной вторичной инфекции.

Механизмы видового иммунитета

Неспецифическая видовая резистентность обусловлена целым рядом анатомофизиологических механизмов. Схематически их можно разделить на следующие группы факторов: защитная роль кожных и слизистых покровов; нормальная микрофлора макроорганизма; воспаление; лихорадка; барьерная функция лимфатических узлов; гуморальные антимикробные вещества, содержащиеся в тканях и жидкостях организма; функции выделительной системы; фагоцитоз и др.

Кожа. Неповрежденная кожа представляет собой обычно непроницаемый барьер для микроорганизмов. Лишь при некоторых инфекционных болезнях, например лептоспирозах, прямое проникновение возбудителя через неповрежденную кожу, возможно, является первичным путем заражения. Кожа представляет собой не просто инертную механическую преграду для проникновения микроорганизмов. Напротив, здоровая неповрежденная кожа обладает отчетливой бактерицидной активностью в отношении тех микроорганизмов, которые не являются представителями ее нормальной микрофлоры. Так, если нанести на кожу взвесь стрептококков, то количество их через 30 мин уменьшается в 3 раза, через 1 ч – в 20 раз, а через 2 – 3 ч их останется лишь очень немного. Более эффективное действие проявляет чистая кожа. Гибель микроорганизмов значительно замедляется на загрязненной коже. Бактерицидные свойства кожи обусловлены, как полагают, наличием в секрете сальных и потовых желез ненасыщенных жирных кислот, особенно олеиновой. Свободные насыщенные алифатические кислоты, содержащиеся в секрете сальных желез, обладают определенным фунгистатическим действием. Бактерицидное и бактериостатическое действие оказывают также содержащиеся в секрете потовых желез перекись водорода, уксусная кислота, аммиак, мочевина, желчные пигменты и др. Нарушения целостности кожи, ранения – частая причина проникновения в организм возбудителей, в особенности гнойно-воспалительных болезней.

Слизистые оболочки. Слизистые оболочки также выполняют роль не только факторов механической защиты. Они обладают некоторыми приспособлениями и свойствами, которые уменьшают возможность проникновения возбудителя в организм. Так, например, покрытые слизью реснички мерцательного эпителия адсорбируют на себе микроорганизмы, содержащиеся во вдыхаемом воздухе, и способствуют его очищению. Слизь, выделяемая оболочками, наряду с другими физиологическими функциями используется организмом для адсорбции, вымывания и удаления различных раздражителей, в том числе и микробов. Бактерии, попавшие на слизистую глаза, относительно быстро удаляются путем вымывания слезной жидкостью. Наконец, слизистые оболочки вырабатывают различные ферменты и другие продукты жизнедеятельности, которые обладают антимикробным действием. В слюне, в слезной жидкости, в носовом секрете и в различных тканевых соках содержится фермент лизоцим. Идентичный фермент обнаружен и в яичном белке. Лизоцим разрушает клеточную стенку бактерий, разрывая β-гликозидные связи между аминосахарами пептидогликана. В результате этого образуются протопласты, которые оказываются нестойкими и подвергаются лизису. Особенно чувствителен к действию лизоцима Micrococcus lysodeikticus, который разрушается слезной жидкостью, разведенной 1: 40 000. Помимо лизоцима, в носовом секрете присутствует вирусинактивирующий агент, который по своим свойствам отличается от лизоцима. Этот агент действует на вирус гриппа и на ряд других вирусов, чувствительных к дезоксихолату. Механизм действия его пока не установлен. Мощным антимикробным действием обладает нормальный желудочный сок с его кислой реакцией. Большинство бактерий, попадающих в желудок, разрушаются здесь. Поэтому в желудке очень немного живых бактерий. Через желудок в кишечник бактерии могут проникать, очевидно, в том случае, когда они заключены в твердые частицы пищи и, таким образом, на какой-то срок защищены от бактерицидного действия желудочного секрета. Вещества, подавляющие рост микроорганизмов, обнаружены в секретах различных слизистых оболочек.

Нормальная микрофлора организма. Микроорганизмы, которые населяют кожу и слизистые оболочки, сообщающиеся с внешней средой, составляют нормальную микрофлору организма. Эти микроорганизмы способны лучше противостоять защитным механизмам организма, но не способны, за исключением тех случаев, когда резистентность сильно снижена, проникать в ткани.

В соответствии с физиологическими функциями и особенностями свойств секрета (рН среды, наличие питательных веществ, антимикробных факторов и т. п.) в различных участках слизистых оболочек верхних дыхательных путей, желудочно-кишечного и мочеполового трактов сформировались свои характерные сообщества микроорганизмов, составляющих нормальную микрофлору. Помимо прочих функций (снабжение организма дефицитными витаминами, аминокислотами, участие в переваривании ряда питательных веществ), нормальная микрофлора функционирует также как важная составная часть всего комплекса защитных механизмов, лежащих в основе резистентности организма. Защитный эффект нормальной микрофлоры заключается в том, что между ее представителями и патогенными микроорганизмами, которые попадают в данную область, неизбежно возникают сложные формы взаимоотношений, от конкуренции до прямого антагонизма, природа которых может быть самой различной (конкуренция за питательные вещества, обусловленная различной скоростью размножения, выделение антибиотических веществ, изменение рН среды в сторону, неблагоприятную для конкурента, и т. п.). Например, нормальная микрофлора слизистой влагалища у женщин представлена молочнокислыми бактериями. Кислая среда, создаваемая ими, препятствует размножению других, в том числе патогенных, бактерий.

Изменение нормальной микрофлоры – дисбактериоз – наступает или вследствие перенесенного заболевания, или в результате применения веществ, угнетающих нормальную микрофлору.

Воспаление. Как защитная реакция целостного организма на чрезмерное раздражение и повреждение ткани физическими, химическими и биологическими агентами воспаление возникло на более высокой ступени эволюции, чем фагоцитоз, а именно – у организмов, обладающих кровеносной и нервной системами. Помимо фагоцитоза, который является обязательным компонентом воспалительной реакции, в ней действуют и другие механизмы защиты, благодаря которым в очаге воспаления происходят фиксация и аккумуляция микроорганизмов или других инородных веществ и их уничтожение. Существенную роль в механизме воспаления играют гистамин, серотонин и другие биологически активные вещества, которые освобождаются главным образом из тучных клеток (мастоцитов). Они повышают проницаемость стенок капилляров, в результате чего в зоне воспаления появляются макрофаги и экссудат, содержащий комплемент, лейкотаксин, фибриноген и антитела; развивается отек. Лейкотаксин также увеличивает проницаемость капилляров и стимулирует миграцию полиморфноядерных лейкоцитов сквозь стенки сосудов. Фагоциты, скапливающиеся в изобилии в очаге воспаления, создают своеобразный вал, препятствующий дальнейшему распространению микроорганизмов. Коагуляция фибриногена приводит к закупорке межклеточных пространств фибрином. Тромбируются мелкие кровеносные и лимфатические сосуды, что препятствует диссеминации возбудителя гематогенным и лимфогенным путем. Такая «лимфатическая» блокада способствует задержке возбудителя в очаге воспаления. Для последующего размножения возбудителя неблагоприятные условия создаются также за счет развивающегося местного ацидоза, гипоксии и гипертермии, плохо сказывающихся на метаболизме микроорганизма. В результате кооперативного взаимодействия макрофагов, антител и комплемента происходит уничтожение возбудителя, вызвавшего воспаление.

Лихорадка. Повышение температуры тела в той или иной мере наблюдается, как правило, при всех инфекционных болезнях. Оно также является защитной реакцией организма. Повышение температуры тела способствует ускорению кровотока и усилению обменных процессов в организме. Температура 38 – 40 °C является оптимальной для активации макрофагов, дальнейшее ее повышение уже подавляет фагоцитоз. Вместе с тем повышение температуры оказывает мутагенное действие на микроорганизмы, а у возникающих температурочувствительных мутантов при 38 – 40 °C утрачивается или сильно угнетается способность размножаться. Высокая температура оказывает неблагоприятное действие и на внутриклеточное размножение различных вирусов.

Барьерные функции лимфатических узлов. По образному выражению П. Ф. Здродовского (1969), лимфатические узлы являются «своеобразным биологическим фильтром для возбудителей, переносимых с лимфой». У человека имеется около 1000 лимфатических узлов, размер которых варьирует от булавочной головки до зерна фасоли. Лимфа доставляется к ним по лимфатическим сосудам, которые начинаются межклеточными капиллярами в тканях. Особенно богаты лимфатическими сосудами кожа, а также слизистые оболочки желудочно-кишечного и дыхательного трактов. В случае проникновения через кожу или слизистые оболочки микроорганизмы, как и иные чужеродные частицы, током лимфы заносятся в лимфатические узлы, задерживаются в них и становятся объектом действия макрофагов. Таким образом, лимфатические узлы не просто «фильтруют» лимфу, но и активно удаляют из нее микробов, выполняя важнейшую неспецифическую защитную функцию. Именно в них при некоторых инфекционных болезнях, когда фагоцитоз носит незавершенный характер, раньше всего развивается воспалительный процесс (лимфадениты при туберкулезе, бруцеллезе, брюшном тифе, туляремии, чуме).

Лимфатические узлы в мозговом и особенно в корковом слое содержат большое количество лимфоцитов различной степени зрелости, которые играют важную роль в выработке специфического иммунитета. В этом случае барьерно-фиксирующая роль лимфатических узлов заметно возрастает.

Лимфатические узлы не только захватывают чужеродный материал, они являются местом, где происходит избирательное накопление активированных данным чужеродным веществом клеток, которые участвуют в иммунных реакциях против него. Клетки лимфатических узлов уже на самых ранних стадиях развития иммунной реакции вырабатывают особые медиаторы – факторы иммунных лимфатических узлов. Из костного мозга в периферические лимфатические органы постоянно поступают незрелые клетки мононуклеарной системы макрофагов, где они и осуществляют свои иммунорегулирующие функции с помощью синтезируемых ими особых миелопептидов.

Противомикробные вещества, содержащиеся в тканях и жидкостях организма. Давно установлено, что из тканей и жидкостей организма можно выделить много различных веществ с противомикробной активностью. Нередко эти вещества действуют избирательно. Например, из сыворотки непастеризованного коровьего молока выделен белок лактенин, который оказывает сильное бактерицидное действие на стрептококки группы А, но менее активен в отношении других микроорганизмов.

Лактенин обнаружен в молоке матери. Антимикробным действием обладают также пептиды, выделяемые из тканей. Один из них, с большим содержанием лизина, действует на стафилококки, стрептококки, сибиреязвенную палочку, а некоторые пептиды с большим содержанием аргинина активны против туберкулезной палочки.

Эффективным противомикробным действием обладает тромбоцитарный катионный белок (бетализин). Это пептид, бактерицидная активность которого проявляется путем стимуляции фагоцитоза, опсонизации патогенов, торможения колонизации и снижения персистентных свойств за счет предупреждения адгезии, торможения бактериальной пероксидазы и каталазы (О. В. Бухарин).

Установлено, что жирные кислоты с длинными цепями, накапливающиеся в большом количестве в уплотненной ткани легкого, способствуют быстрому исчезновению пневмококков из очагов поражения. Бактерицидное действие полиаминов спермина и спермидина на туберкулезную палочку проявляется после их активирования спермидиноксидазой.

Не подлежит никакому сомнению, что такие факторы, как доступ О₂, содержание СО₂, уровень активной реакции среды, наличие и концентрация различных органических кислот и других метаболитов, наличие или отсутствие у клеток рецепторов, с которыми взаимодействуют бактерии и вирусы, создают своеобразные условия и таким образом оказывают существенное влияние на выживаемость различных возбудителей в тканях организма. Например, вирус гриппа может взаимодействовать лишь с теми клетками, которые имеют на своей поверхности мукопептидные рецепторы. В свою очередь вещества мукоидной природы, содержащиеся в сыворотке крови, связывают вирус гриппа и являются его неспецифическими ингибиторами.

Функции выделительной системы. К числу неспецифических защитных механизмов организма следует отнести также и функции выделительных систем. Освобождение организма от микробов, продуктов их жизнедеятельности и токсинов происходит с помощью желудочно-кишечного тракта, мочевыводящих путей, потовых желез, дыхательной и других систем. Типичным примером такого рода неспецифической защитной реакции является рвота, часто наблюдаемая как при бактериальных, так и небактериальных кишечных отравлениях.

При попадании в организм достаточно больших доз микробов или их токсинов нормальная физиологическая деятельность, т. е. реактивность многих органов, в том числе выделительных систем, в результате воздействия микробных антигенов на рецепторы тканей изменяется. Учащается дыхание, изменяется кровообращение, расширяются кровеносные сосуды и реализуется ряд других реакций, направленных на освобождение организма от возбудителей и нейтрализацию их вредного воздействия.

Из всего вышеизложенного следует, что в организме имеется большое количество неспецифических приспособлений, которые обеспечивают определенную степень его резистентности к различным микроорганизмам. Однако главными биологическими высокоспециализированными системами, обеспечивающими видовой иммунитет, являются системы макрофагов, комплемента, интерферонов, Т-цитотоксических лимфоцитов и главная система гистосовместимости. Поэтому неспецифическую резистентность правильнее определять как видовой иммунитет, поскольку эта резистентность определяется в первую очередь специализированными иммунологическими системами.

Система интерферонов

Давно было подмечено, что если ввести в организм два вируса одновременно или с интервалом не более 24 ч, между ними наблюдается какое-то взаимодействие, проявляющееся во взаимном угнетении (интерференция). В 1957 г. Л. Айзекс и Дж. Линдеман обнаружили, что явление интерференции связано с образованием в клетках, которые были заражены вирусом, особого белка – интерферона. Установлено, что существует не один интерферон, а целая система их, в которой выделены три основных типа. Интерфероны, синтезируемые в клетках человека, различаются по своим физико-химическим свойствам; рецепторам, с помощью которых они взаимодействуют с клетками; кислоточувствительности; антигенной специфичности. Современная номенклатура интерферонов такова.

Номенклатура интерферонов

(разработана специальной комиссией ВОЗ в 1980 г.):

• Новое обозначение:

1) IFN-α; 2) IFN-β; 3) IFN-γ.

• Старое обозначение:

1) тип I (лейкоцитарный), pH 2,0 – стабильный, индуцируемый чужеродными клетками;

2) тип II (фибробластный), pH 2,0 – стабильный;

3) тип III (иммунный), pH 2,0 – лабильный, индуцируемый антигенами и митогенами.

По своей химической природе интерфероны являются гликопротеидами. Каждый из трех типов интерферонов (α, β, γ) разделяют на подтипы. Например, тип (семейство) α-интерферона включает около 20 подтипов, различающихся по биологическим свойствам и структуре. Среди них обнаружены и такие подтипы, которые утрачивают свою активность при рН 2,0, т. е. кислотолабильные. Множественность и структурная гетерогенность интерферонов, очевидно, отражают их функциональную гетерогенность, а также способность синтезироваться под влиянием различных индукторов. Молекулярная масса интерферонов варьирует от 17 до 45 кД у α– и β-интерферонов и от 20 до 80 кД у γ-интерферона; γ-интерферон продуцируют Т-лимфоциты, натуральные, или природные, киллеры, активированные макрофаги. В свою очередь он стимулирует образование молекул МНС класса II, является кофактором дифференцировки и активации В-лимфоцитов и антагонистом действия на них интерлейкина-4. Гены, контролирующие синтез интерферонов у человека, локализованы на 2, 5 и 9-й хромосомах.

В соответствии с гипотезой об индукции интерферона предполагается, что в клетках его синтез блокирован репрессором. При контакте клетки с индуктором, например вирусом, репрессор связывается, что приводит к активации оперона, контролирующего образование интерферона. Затем происходит транскрипция мРНК для интерферона и ее трансляция. Оперон для α-интерферона содержит до 12 структурных генов. Противовирусное действие интерферонов проявляется в их способности подавлять внутриклеточное размножение широкого круга ДНК– и РНК-вирусов. Интерферон не взаимодействует непосредственно с вирусом, он не препятствует адсорбции вируса на клетке и его проникновению в клетку. Антивирусное действие интерферонов не связано с синтезом какого-то нового белка, а проявляется в повышении активности ряда ключевых ферментов клеточного обмена веществ (рис. 62). Один из возможных механизмов антивирусной активности интерферона заключается в том, что он увеличивает продукцию протеинкиназы, которая фосфорилирует один из факторов инициации трансляции и ингибирует синтез белка. Другой механизм сводится к тому, что под влиянием интерферона накапливается олигоаденилатсинтетаза, приводящая к образованию 2,5-олигоадениловой кислоты. Последняя активирует клеточную эндонуклеазу, которая разрушает молекулы РНК, в том числе и мРНК. Так или иначе, под влиянием интерферона блокируется синтез вирусных макромолекул. Повидимому, в зависимости от типа рецепторов клетки, особенностей самих клеток и типов интерферонов, последние реализуют свое воздействие через активацию синтеза разных ферментных систем. Индукция синтеза интерферона происходит под воздействием самых различных факторов: ДНК– и РНК-содержащих вирусов, бактерий, риккетсий, простейших, различных микробных антигенов, а также различных синтетических соединений. Наиболее характерные черты биологического действия интерферона следующие:

Рис. 62. Механизм действия интерферона (по А. Г. Букринской, 1986):

1 – интерферон; 2 – клеточный рецептор

1) универсальность – интерферон активен против широкого круга вирусов;

2) выраженная тканевая специфичность – он активен в гомологичных системах и практически не активен в гетерогенных тканях (поэтому для лечения человека можно использовать только интерферон человеческого происхождения), биологическая активность интерферона определяется его полипептидом, а тканеспецифичность – углеводным компонентом;

3) наличие эффекта последействия – даже после отмывания интерферона в клетках длительное время сохраняется способность подавлять размножение вирусов;

4) отсутствие какого-либо токсического эффекта – обработка интерфероном клеток не нарушает их нормальной жизнедеятельности;

5) высокая эффективность действия – даже небольшое количество интерферона (несколько десятков молекул) обладает противовирусной активностью.

Интерфероны обладают не только противовирусным, но и противобактериальным (более сильным против грамположительных бактерий и хламидий и менее сильным против других грамотрицательных бактерий) и противоопухолевым действием. Такое их действие связано прежде всего с тем, что интерфероны – мощные иммуномодуляторы. Они стимулируют гуморальный иммунитет, усиливая антителообразование, восстанавливают соотношение T-хелперы/T-супрессоры, уменьшают степень иммунодепрессии, стимулируют фагоцитоз, активность цитокинов, всех киллерных клеток и T-цитотоксических лимфоцитов и т. д. В основе такой широкой активности интерферонов лежит их способность включаться в различные метаболические процессы и регулировать их, поэтому систему интерферонов следует рассматривать как неотъемлемую составную часть общей иммунной системы. Синтез молекул интерферонов – первый ответ на получение клетками неспецифического сигнала о появлении чужеродных антигенов. Включаясь в регуляцию метаболических процессов в клетках, тканях и органах, интерфероны обеспечивают поддержание гомеостаза на всех уровнях организации от клетки до целостного организма. В связи с этим для стимуляции синтеза эндогенных интерферонов и усиления их иммуномодулирующего действия в практику лечения и профилактики вирусных и других инфекционных заболеваний, особенно таких, при которых возбудитель оказывает негативное действие на систему интерферонов, помимо собственно интерферонов все шире внедряются различные синтетические стимуляторы интерферонообразования.

Два таких препарата успешно используются: амиксин и арбидол. Амиксин – первый пероральный синтетический низкомолекулярный индуктор эндогенного интерферона. Его применяют по специальным схемам для профилактики и лечения гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ), герпетических, цитомегаловирусных и нейровирусных заболеваний, энтеральных (A, E) и парентеральных вирусных гепатитов (B, C, D, E, G, TTV) и хламидиозов. Амиксин нетоксичен и хорошо совместим с антибиотиками и средствами традиционного лечения вирусных и бактериальных болезней. Арбидол помимо интерферониндуцирующего и иммуномодулирующего обладает и прямым антивирусным действием. Он применяется для профилактики и лечения гриппа и ОРВИ у взрослых и детей по специальным схемам.

Киллерные клетки

Приобретенный иммунитет отличается от видового следующими особенностями. Во-первых, он не передается по наследству. По наследству передается лишь информация об органе иммунитета, а сам иммунитет формируется в процессе индивидуальной жизни в результате взаимодействия с соответствующими возбудителями или их антигенами.

Во-вторых, приобретенный иммунитет является строго специфическим, т. е. всегда направлен против конкретного возбудителя или антигена. Один и тот же организм в течение своей жизни может приобретать невосприимчивость ко многим болезням, но в каждом случае формирование иммунитета связано с появлением специфических эффекторов против данного возбудителя.

Иммунологическая функция, как и всякая другая функция организма, связана с деятельностью определенной специализированной системы клеток и тканей. Органом иммунитета является лимфоидная система. Особенность ее состоит в том, что она существует не в виде единого дискретного анатомического образования, а расселена по всему телу, чтобы во всех его участках осуществлять свою защитную функцию. Кроме того, иммунной системе присущи еще две особенности:

1) ее клетки постоянно рециркулируют через лимфу и кровоток по всему организму, осуществляя иммунологический надзор;

2) она обладает способностью отвечать уникальными реакциями на попадание в организм антигена.

Совокупность всех лимфоидных органов и тканей организма (тимус, селезенка, лимфатические узлы, пейеровы бляшки и другие лимфоидные скопления, лимфоциты костного мозга и периферической крови) представляет единый орган иммунитета. Общий вес лимфоидной системы у человека около 1,5 – 2 кг, количество лимфоидных клеток составляет 10¹².

Приобретенный иммунитет обеспечивается теми же самыми иммунными системами, которые осуществляют видовой иммунитет, но их активность и целенаправленность действия во много раз усиливаются благодаря синтезу специфических антител. Формирование приобретенного специфического иммунитета происходит благодаря кооперативному взаимодействию макрофагов (и других антигенпредставляющих клеток), В– и Т-лимфоцитов и при активном участии всех остальных иммунных систем.

Формы приобретенного иммунитета

В зависимости от механизма образования приобретенный иммунитет подразделяется на искусственный и естественный, а каждый из них в свою очередь – на активный и пассивный. Естественный активный иммунитет возникает вследствие перенесения заболевания в той или иной форме, в том числе легкой и скрытой. Такой иммунитет называется также постинфекционным. Естественный пассивный иммунитет создается в результате передачи ребенку от матери антител через плаценту и грудное молоко. Организм ребенка в этом случае сам не участвует в активной выработке антител. Искусственный активный иммунитет – иммунитет, образующийся в результате прививок вакцинами, т. е. поствакцинальный. Искусственный пассивный иммунитет обусловлен введением иммунных сывороток или препаратов гамма-глобулина, содержащих соответствующие антитела.

Активно приобретенный иммунитет, особенно постинфекционный, устанавливается спустя некоторое время после заболевания или прививки (1 – 2 нед.), сохраняется долго – годами, десятилетиями, иногда пожизненно (корь, оспа, туляремия). Пассивный иммунитет создается очень быстро, сразу после введения иммунной сыворотки, но зато сохраняется очень недолго (несколько недель) и снижается по мере исчезновения введенных в организм антител. Продолжительность естественного пассивного иммунитета новорожденных также невелика: к 6 мес. он обычно исчезает, и дети становятся восприимчивы ко многим болезням (корь, дифтерия, скарлатина и др.).

Постинфекционный иммунитет в свою очередь подразделяют на нестерильный (иммунитет при наличии возбудителя в организме) и стерильный (возбудителя в организме нет). Различают иммунитет антимикробный (иммунные реакции направлены против возбудителя), антитоксический, общий и местный. Под местным иммунитетом понимают возникновение специфической резистентности к возбудителю в той ткани, где он обычно локализуется. Учение о местном иммунитете было создано учеником И. И. Мечникова А. М. Безредкой. Долгое время природа местного иммунитета оставалась неясной. Теперь полагают, что местный иммунитет слизистых оболочек обусловлен особым классом иммуноглобулинов (IgAs). Благодаря наличию в них дополнительного секреторного компонента (s), который вырабатывается эпителиальными клетками и прикрепляется к молекулам IgA при прохождении их через слизистую оболочку, такие антитела оказываются устойчивыми к действию ферментов, содержащихся в секретах слизистых оболочек.

Приобретенный иммунитет во всех формах чаще всего является относительным и, несмотря на значительную в некоторых случаях напряженность, может быть преодолен большими дозами возбудителя, хотя течение болезни будет при этом значительно легче. На продолжительность и напряженность приобретенного иммунитета большое влияние оказывают также социально-экономические условия жизни людей.

Между видовым и приобретенным иммунитетом существует тесная взаимосвязь. Приобретенный иммунитет формируется на базе видового и дополняет его более специфическими реакциями.

Как известно, инфекционный процесс имеет двойственный характер. С одной стороны, он характеризуется нарушением функций организма в различной степени (вплоть до заболевания), с другой – происходит мобилизация его защитных механизмов, направленных на уничтожение и удаление возбудителя. Поскольку неспецифических механизмов защиты для этой цели часто оказывается недостаточно, на определенном этапе эволюции возникла дополнительная специализированная система, способная реагировать на внедрение чужеродного антигена более тонкими и более специфическими реакциями, которые не только дополняют специализированные биологические механизмы видового иммунитета, но и стимулируют функции некоторых из них. Системы макрофагов и комплемента приобретают уже специфически направленный характер действия против конкретного возбудителя, последний распознается и подвергается уничтожению с гораздо большей эффективностью. Одним из характерных признаков приобретенного иммунитета служит появление в сыворотке крови и тканевых соках специфических защитных веществ – антител, направленных против чужеродных веществ. Антитела образуются после перенесенного заболевания и после прививок как ответная реакция на введение микробных тел или их токсинов. Наличие антител всегда свидетельствует о контакте организма с соответствующим возбудителем.

Антигены

Вещества, индуцирующие образование антител, называются антигенами (греч. anti – против, genos – рождение, происхождение). Однако образование антител – это лишь одна из форм иммунного ответа на чужеродный антиген. В связи с этим можно дать следующее общее определение этого понятия.

Антигены – любые вещества, содержащиеся в микроорганизмах и других клетках или выделяемые ими, которые несут признаки генетически чужеродной информации и при введении в организм вызывают развитие специфических иммунных реакций. Необходимо подчеркнуть, что антигены индуцируют реакции как гуморального, так и клеточного иммунитета.

Термин «антиген» употребляют очень часто, вкладывая в него двоякий смысл. Под антигенами понимают вещества, вызывающие появление антител, и вещества, реагирующие с антителами. Однако это совершенно разные характеристики антигена. Важнейшее качество антигена – способность индуцировать образование антител (и другие формы иммунного ответа), т. е. антигенность определяется чужеродностью и зависит от молекулярной массы антигена, его коллоидного состояния и способности метаболизироваться в организме.

Антигенами являются любые вещества или клетки, которые генетически чужеродны данному организму; только в этом случае они и распознаются его иммунной системой. Специфичность работы каждого генома проявляется прежде всего на уровне белка и других биологических макромолекул. Однако для того, чтобы иммунная система смогла распознать антигены, они должны обладать определенной молекулярной массой. Как правило, антигены – высокомолекулярные соединения: их молекулярная масса должна быть не менее 20 – 30 кД. Белки с меньшей молекулярной массой, например рибонуклеаза (молекулярная масса – 14 кД), вазопрессин (молекулярная масса – 1 кД), являются слабыми антигенами. Все известные до настоящего времени антигены являются веществами коллоидной природы. Значение этого обстоятельства для реализации антигенности не совсем ясно.

Установлено также, что реализация антигенности зависит от способности антигена метаболизироваться в организме, т. е. быть объектом разрушающего действия макрофагов и взаимодействовать с другими клетками иммунной системы. Благодаря такому взаимодействию происходит распознавание антигенной специфичности. Все антигены обладают специфичностью, т. е. определенными особенностями, генетически детерминированными и связанными с их структурой, почему они и отличаются друг от друга.

Типы антигенной специфичности

Независимо от происхождения антигенов, у них различают несколько уровней специфичности.

Видовая специфичность – антигенные особенности, присущие представителям данного вида. Отпечаток видовой специфичности имеют многие макромолекулы данного организма. Определение видовых антигенов может быть использовано для дифференциации особей одного вида от другого.

Групповая специфичность – особенности антигенного строения, свойственные определенной группе особей внутри данного вида организмов. Групповые антигены, позволяющие различать отдельных особей или группы особей внутри одного вида, называются изоантигенами. Например, в эритроцитах человека обнаружено помимо изоантигенов АВ0 еще более 70 других, все они объединены в 14 изоантигенных систем. Около 40 антигенов найдено в сыворотке крови. Большой интерес представляют лейкоцитарные изоантигены, относящиеся к антигенам гистосовместимости.

Гетероспецифичность – антигенная специфичность, обусловленная наличием общих для представителей разных видов антигенов. Примером таких гетероантигенов является обнаруживаемый в эритроцитах овец, лошадей, мышей, кур, собак, кошек, но отсутствующий у человека, обезьян и некоторых других животных антиген Форсмана. Гетероантигены обусловливают перекрестные иммунологические реакции.

Помимо перечисленных типов антигенной специфичности, выделяют еще органоидную (антигенные различия клеточных органоидов), функциональную (специфичность белков, связанная с выполнением различных функций), патологическую («ожоговые», «лучевые», «раковые» антигены), стадиоспецифичность (антигены различных тканей, связанные с их морфогенезом) и т. п.

Аутоантигены – вещества, обладающие способностью вызывать иммунные реакции в организме, из которого они получены. Их содержат мозг, хрусталик глаза, сперматозоиды, паращитовидные железы, гомогенаты семенной железы, кожи, почек, печени и других тканей. Так как в обычных условиях аутоантигены не приходят в соприкосновение с иммунными системами организма, антитела к подобным клеткам и тканям не образуются. Однако при повреждении этих тканей аутоантигены могут всасываться и вызывать образование антител, оказывающих повреждающее действие на соответствующие клетки. Аутоантигены могут возникать также из клеток некоторых органов и тканей под влиянием охлаждения, медикаментозного воздействия, вирусных инфекций, бактериальных белков и токсинов, например стрептококков, стафилококков, микобактерий туберкулеза, и других факторов. Они образуются в этом случае вследствие нарушения видовой специфичности собственных антигенов организма.

Для характеристики микроорганизмов помимо родовой, видовой и групповой антигенной специфичности очень важное значение имеет определение типоспецифичности антигенов. Типоспецифичность – особенность антигенного строения, которая обусловливает различия среди особей одной группы сходных организмов данного вида и позволяет выделить среди них серотипы, или сероварианты (серовары). Выявление сероваров дает возможность осуществлять очень тонкую дифференциацию внутри вида микроорганизмов.

Большинство современных классификаций патогенных микроорганизмов построены с учетом этих типов антигенной специфичности.

Полноценные и неполноценные антигены (гаптены и полугаптены)

Одной из важнейших характеристик антигена является его иммуногенность, т. е. способность индуцировать формирование иммунитета к соответствующему возбудителю, в состав которого входит данный антиген. Степень иммуногенной активности у разных микробных антигенов далеко не одинакова. Различают слабоиммуногенные антигены, т. е. антигены, индуцирующие слабый иммунный ответ; высокоиммуногенные антигены, индуцирующие сильный иммунный ответ, и так называемые суперантигены. Такое название получили бактериальные антигены, вызывающие чрезмерно сильный иммунный ответ, который может стать причиной тяжелых побочных реакций или привести к развитию иммунодефицита или аутоиммунных болезней. Об особенностях взаимодействия суперантигенов с клетками иммунной системы рассказано в главе 34. Все вакцины, применяемые для формирования иммунитета к инфекционным болезням, должны обладать высокой иммуногенностью, быть безвредными и не оказывать нежелательного воздействия на иммунную систему.

Изучение антигенных свойств различных сложных химических соединений – белков, полисахаридов, липидов, нуклеиновых кислот и т. д. – показало, что существует два типа антигенов – полноценные и неполноценные. Полноценные антигены обладают обеими функциями антигена: способностью индуцировать образование антител и специфически с ними взаимодействовать. Неполноценные антигены сами по себе способностью индуцировать образование антител не обладают, они приобретают это свойство только после соединения с белками или другими полноценными антигенами. Такие неполноценные антигены называются гаптенами или полугаптенами (греч. hapto – прикрепляю). Неполноценные антигены обладают только одним свойством антигена: они способны специфически взаимодействовать с теми антителами, в индукции синтеза которых они участвовали (после присоединения к белку и превращения в полноценные антигены).

Если взаимодействие неполноценного антигена с антителом сопровождается обычными иммунологическими реакциями, его называют гаптеном. Если неполноценный антиген имеет очень небольшую молекулярную массу и его взаимодействие с антителами не сопровождается обычными видимыми реакциями, его называют полугаптеном. О присутствии полугаптена в этом случае судят по тому признаку, что антитела, будучи связаны с полугаптеном, уже не проявляют себя в обычной реакции с полноценным антигеном (задерживающая реакция Ландштейнера).

Химическая природа антигенов

Из высокомолекулярных соединений биологического происхождения свойствами полноценных антигенов обладают главным образом белки, а также некоторые полисахариды и липополисахариды бактериального происхождения. Например, капсульные полисахариды пневмококка являются антигенами для мышей и человека, но не для кролика и лошадей.

Основными носителями антигенной функции являются белки. Это связано с тем, что именно в структуре белков прежде всего реализуется специфичность работы генома каждого организма. Аминокислоты, моносахара, азотистые основания и другие относительно простые соединения, не говоря уже о химических элементах, которые имеют у всех организмов одинаковую структуру, не обладают признаками чужеродности и не могут поэтому быть антигенами. У разных белков антигенные свойства проявляются в разной степени: наряду с сильными антигенами (микробные экзотоксины, сывороточные белки и др.), есть белки с очень слабой антигенной активностью – гемоглобин, желатин, инсулин и другие низкомолекулярные белки. Низкую антигенную активность инсулина обычно связывают с его небольшой молекулярной массой (менее 6 кД). Однако такие белки, как, например, гемоглобин и актин, имеют большую молекулярную массу (64,5 кД и 50 кД соответственно), но обладают слабыми антигенными свойствами.

В настоящее время полагают, что антигенные свойства белков коррелируют со скоростью их эволюции. Выполняя сходные функции у разных организмов, такие белки, как инсулин, гемоглобин, обладают большим структурным сходством. Лишь инсулин морской свинки отличается от инсулина других млекопитающих по 16 – 18 аминокислотным остаткам. В то же время только морские свинки способны вырабатывать антитела к гетерологичному инсулину.

Таким образом, чем больше различий в аминокислотных последовательностях у белка-антигена по сравнению с аналогичным белком хозяина, тем больше выражена у него способность индуцировать синтез антител, и наоборот, чем более эволюционно консервативен белок, тем слабее у него антигенные качества. К числу наиболее консервативных белков относится семейство гистонов IV. За 1,5 млрд лет в них произошли всего 2 аминокислотные замены. Способность индуцировать синтез антител у гистонов IV не обнаружена.

Антигенность полисахаридов и липополисахаридов имеет такое же происхождение, как и антигенность белков, т. е. обусловлена необычностью структуры, сообщающей им свойства чужеродности. Например, антигенность полисахаридов сальмонелл группы А связана с наличием в их составе паратозы (3,6-ди-дезокси-глюкозы), группы В – абеквозы (3,6-ди-дезокси-галактозы) и т. д. Простые сахара и олигосахариды обладают свойствами гаптенов, т. е. их можно превратить в антиген путем присоединения к белкам. Многочисленные исследования антигенных свойств нуклеиновых кислот дали противоречивые результаты. По-видимому, лишь высокополимерным препаратам нуклеиновых кислот присущи антигенные свойства. Антигенные свойства доказаны для ДНК Т-четных фагов (Т2, Т4, Т6); в ее составе содержатся остатки 5-оксиметилцитозина, к некоторым из них присоединены 1 – 2 остатка глюкозы. Негликозилированная ДНК не способна индуцировать образование антител. Сыворотка крови людей, страдающих системной красной волчанкой, дает реакции преципитации с ДНК различного происхождения. Это связано с наличием в сыворотке крови больных антител к ДНК. Антитела, реагирующие с РНК, удается получить, используя в качестве антигена рибосомы.

Жирные кислоты, а также триглицериды и другие чистые липиды свойствами полноценных антигенов не обладают. Некоторые классы липидов могут быть составной частью молекулы гаптена. Помимо липидов, связанных ковалентной связью с белками, только два класса липидов, содержащиеся в живых тканях, функционируют как гаптены: фосфатиды и гликосфинголипиды. По крайней мере пять хорошо охарактеризованных фосфолипидов обладают свойствами гаптенов: кардиолипин и четыре фосфатидил-инозитол-олигоманнозида, выделенных из туберкулезных бактерий. Липиды обладают способностью усиливать иммуногенность других антигенов, поэтому их используют в качестве адъювантов (англ. adjuvant – помощник, полезный). Применению адъювантов во многом способствовали работы Дж. Фрейнда. В качестве адъюванта Дж. Фрейнд использовал смесь минерального масла с нейтральным детергентом для создания стабильных эмульсий водных растворов антигенов. Добавление к этой эмульсии убитых туберкулезных палочек повышает ее адъювантное действие («полный адъювант Фрейнда»). Применение адъювантов дает хороший эффект при иммунизации низкомолекулярными растворимыми антигенами. Высокомолекулярные антигены в адъювантах практически не нуждаются. По-видимому, основная роль адъювантов состоит в том, что они служат носителями для растворимых антигенов, благодаря чему последние становятся доступными действию фагоцитов. Кроме того, адъюванты вызывают воспалительную реакцию на месте введения, что также способствует фагоцитозу антигенов. Липиды (в основном в виде фосфолипидов) входят в состав эндотоксинов и усиливают их иммуногенность.

Природа специфичности антигенов

Изучение свойств гаптенов и полугаптенов дало возможность искусственно синтезировать комплексные антигены, состоящие из гаптенов и белка. Они получили название конъюгированных антигенов. При этом было установлено, что введение в белковую молекулу любого гаптена или полугаптена изменяет ее антигенную специфичность. Как было впервые показано К. Ландштейнером, если иммунизировать животных конъюгированными антигенами, содержащими один и тот же белок, но разные введенные химические группировки (NO, N=N, I₂, Br₂, бензольное кольцо и т. п.), то появляются антитела, специфичные к этим группировкам. В связи с этим было сделано заключение, что конъюгированные антигены состоят из двух компонентов: 1) активной химической группы, определяющей специфичность антигена, т. е. фактора специфичности, или детерминантной группы, или эпитопа; 2) белковой части антигена – шлеппера, в которую вводится фактор специфичности. Белок является носителем собственно антигенности. Специфичность детерминантной группы определяется следующими факторами: природой самой химической группировки; орто-, мета– или параположением группировки и ее стереоизомерией. Орто-, мета-, параизомеры, цис– и трансформы, лево– и правовращающие изомеры детерминантных групп индуцируют образование антител с различной специфичностью. Антитела к D-изомерам отличаются от антител к L-изомерам и т. д. В крупные белковые молекулы может быть введено несколько детерминантных групп (от 1 до 200 и более), а их размеры могут варьировать от 1 атома до крупных молекул. Каждый детерминант, или эпитоп, вызывает образование особого типа антител, реагирующих с данным детерминантом. Таким образом, сложные конъюгированные антигены с несколькими различными детерминантами индуцируют образование целого комплекса антител.

Природа антигенной специфичности белков

Для выяснения природы антигенности белков и ее специфичности большое значение имели модельные опыты с искусственными аминокислотами и продуктами расщепления белка. Как оказалось, гомополимеры различных аминокислот антигенными свойствами не обладают. Однако если гомополимеры ароматических аминокислот присоединить к желатину, то антигенные свойства последнего значительно усиливаются, в то время как от присоединения, например, полиглицина или полиаланина антигенность желатина не возрастает. Это обстоятельство указывает на важную роль ароматического кольца для проявления антигенности.

Антигенные свойства у искусственно получаемых полиаминокислот возникают только на уровне сополимеров, т. е. когда появляется возможность определенных сочетаний аминокислот в таких структурах. Последовательность расположения аминокислот в каждой природной полипептидной цепи уникальна и генетически детерминирована. Поэтому возможность появления необычных для данного организма сочетаний аминокислот в составе полиаминокислот возникает лишь в том случае, если для их синтеза берутся разные аминокислоты. При этом опять-таки антигенность и специфичность полиаминокислот в значительной степени определяются остатками ароматических аминокислот – тирозина, фенилаланина, триптофана, содержащих в себе жесткое кольцо. По мнению Ф. Гауровитца, жесткость структуры детерминантных групп является обязательным условием антигенности молекулы. Детерминантная группа должна находиться на поверхности молекулы и быть доступной для систем иммунного ответа. Неспособность жирных кислот служить антигенными детерминантами Ф. Гауровитц объясняет тем, что их молекулы содержат длинные цепи парафиновых углеводородов, лишенных жесткой структуры, в связи с чем взаимное расположение химических групп, образующих молекулу жирной кислоты, в пространстве постоянно меняется.

Детерминантные группы нативных белков возникают из различных аминокислотных остатков, представляющих поверхностно расположенные группы определенной конформации. Важную роль в их образовании, очевидно, играют указанные выше аминокислоты. Вместе с тем и общая конформация белковой молекулы, т. е. ее вторичная и третичная структура, также определяет иммунологическую специфичность. Денатурирование белка меняет его антигенную специфичность. В свете этого становится понятным, почему присоединение различных химических группировок к белку приводит к изменению его антигенной специфичности. Гаптен, присоединенный к молекуле белка, изменяет ее конформацию и придает ей новую специфичность. У белка РНКазы, аминокислотная последовательность которой известна, детерминантные группы образованы аминокислотными остатками 39 – 52 и 105 – 124. Окисление или восстановление РНКазы приводит к изменению ее антигенной специфичности. Все три формы молекулы РНКазы – нативная, восстановленная и окисленная – обладают антигенной специфичностью и индуцируют образование различных по специфичности антител.

Таким образом, антигенность белков является функцией их чужеродности, а ее специфичность зависит от аминокислотной последовательности, которая определяет все свойства белка; от вторичной, третичной и четвертичной структуры, т. е. от общей конформации белковой молекулы; от поверхностно расположенных детерминантных групп и концевых аминокислотных остатков. Количество детерминантных групп в белковой молекуле возрастает пропорционально ее молекулярной массе. Например, в молекуле дифтерийного токсина (м. м. 61 кД) обнаружено около 8, тиреоглобулина (м. м. 650 кД) – 40, а гемоцианина (м. м. 6,5 МД) – более 230 детерминантных групп.

Антигенное строение микробной клетки

Для медицинской микробиологии наибольший интерес представляют антигенные свойства бактерий, токсинов и вирусов. Результаты их изучения используются в практике получения высокоэффективных иммуногенных препаратов, а также для совершенствования методов идентификации возбудителей болезней. Обладая сложным химическим строением, бактериальная клетка представляет собой целый комплекс антигенов. Антигенными свойствами обладают жгутики, капсула, клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, рибосомы и другие компоненты цитоплазмы, а также различные продукты белковой природы, выделяемые бактериями во внешнюю среду, в том числе токсины и ферменты. В связи с этим различают следующие основные виды микробных антигенов: соматические, или О-антигены; жгутиковые, или Н-антигены; поверхностные, или капсульные К-антигены (нем. Kapsel – капсула).

Символы, обозначающие названия жгутиковых и соматических антигенов, были предложены в связи со следующим феноменом. Протей, обладающий жгутиками, дает на плотной среде характерный рост в виде роения, напоминающий налет на холодном стекле, образующийся при дыхании на него. Протей, лишенный жгутиков, растет иначе. Поэтому жгутиковые антигены стали обозначать символом «Н» (нем. Hauch – дыхание), соматические антигены – «О» (нем. ohne Hauch – без дыхания).

Соматические антигены в большинстве случаев термостабильны, выдерживают нагревание до 80 – 100 °C. Они представляют собой сложные полисахаридолипидопротеидные комплексы. Антигенную специфичность грамотрицательных бактерий, например сальмонелл, определяют полисахариды, содержащиеся в ЛПС клеточной стенки. Помимо общего гетерополисахарида, в состав которого входят гептозофосфат и N-ацетилглюкозамин, сальмонеллы имеют специфические полисахариды, в молекулах которых концевые дезоксисахара (тивелоза, паратоза, колитоза, абеквоза и др.) выполняют функцию соответствующих антигенных детерминант. Род Salmonella по О-антигенам подразделяется на ряд групп. Каждая группа характеризуется наличием общего группового антигена, специфичность которого определяется указанными дезоксисахарами. Например, в группе А – паратозой, в группе О – колитозой и т. д.

Жгутиковые антигены, имеющие белковую природу, как правило, термолабильны (разрушаются при температуре 60 – 80 °C). Они также отличаются высокой специфичностью. Изучение жгутиковых антигенов позволяет выделить, например в группах сальмонелл, различные серологические варианты. На основании особенностей строения О– и Н-антигенов род Salmonellа подразделяется более чем на 2200 сероваров.

Капсульный антиген пневмококков является чистым полисахаридом, он определяет специфичность, на основании которой пневмококки подразделяются более чем на 80 сероваров. Состав сахаров многих типов известен, и структура некоторых из них установлена. Например, у пневмококков третьего серовара полисахарид представлен полимером из повторяющихся единиц целлобиуроновой кислоты с молекулярной массой 276,5 кД. Целлобиуроновая кислота является дисахаридом D-глюкуроновой кислоты и D-глюкозы, связанных между собой b-1,4-гликозидной связью.

К-антиген располагается поверхностнее О-антигенов. Например, у E. coli, помимо О– и Н-антигенов выявлен ряд К-антигенов. По степени устойчивости к высокой температуре они подразделяются на L-, B– и А-антигены. У вирулентных штаммов S. typhi обнаружен относительно термолабильный поверхностный антиген, получивший название Vi-антигена.

Стрептококки обладают тремя разными по степени специфичности антигенами. У них имеются общий родовой нуклеопротеидный антиген (Р-антиген), групповой полисахаридный С-антиген и типоспецифические антигены. По С-антигену стрептококки подразделяются на 20 серологических групп (А, В, С, D, Е, F…V). В свою очередь стрептококки группы А по типоспецифическому белковому М-антигену дифференцируются на 100 сероваров.

Антигенные свойства присущи также микробным токсинам, ферментам и другим бактериальным белкам. Экзотоксины рассматриваются как внеклеточные антигены. У бактерий выделяют еще так называемые протективные антигены. Впервые они были найдены в экссудатах животных, больных сибирской язвой. Их можно получить при культивировании сибиреязвенных бацилл на животных тканях и специальных питательных средах, состоящих из аминокислот. Протективные антигены обладают весьма высокими предохраняющими свойствами и могут быть использованы в практике иммунизации против некоторых инфекционных болезней, в частности против сибирской язвы и чумы. Подобные антигены найдены у возбудителей коклюша, бруцеллеза, туляремии и у других микроорганизмов. Наконец, у бактерий выявлены также антигены, общие с антигенами тканей млекопитающих, так называемые перекрестно реагирующие антигены. Например, установлено наличие общих антигенов у эритроцитов человека, стафилококков, стрептококков, бактерий чумы, кишечной палочки, некоторых сальмонелл, шигелл, вирусов оспы, гриппа и других возбудителей инфекционных болезней. Если имеется сходство антигенной структуры хозяина и возбудителя, макроорганизм не способен вырабатывать иммунитет, и болезнь протекает более тяжело. Возможно, в отдельных случаях длительное носительство возбудителя и неэффективность вакцинации являются следствием общности антигенов микроба с антигенами тканей человека.

У некоторых бактерий обнаружены так называемые суперантигены. Ими являются, например, стафилококковые экзотоксины: энтеротоксины и токсин, вызывающий синдром токсического шока. Свое название суперантигенов такие белки получили потому, что они, связываясь отличным от других антигенов способом с рецепторами Т-лимфоцитов, активируют их. Т-лимфоциты (Т-хелперы) начинают быстро размножаться и секретировать избыточное количество интерлейкина-2, который и вызывает отравление. В свою очередь избыточное количество Т-лимфоцитов может привести к различным аутоиммунным заболеваниям и подавлению самmой иммунной системы.

Возможны следующие формы иммунного ответа на проникновение антигена в организм: биосинтез антител, образование клеток иммунной памяти, реакция гиперчувствительности немедленного типа, реакция гиперчувствительности замедленного типа (в том числе трансплантационный иммунитет), иммунологическая толерантность, идиотип-антиидиотипические отношения.

Антитела являются уникальными сывороточными белками – глобулинами, которые вырабатываются в ответ на поступление в организм антигена и способны с ним специфически взаимодействовать. При электрофорезе сыворотки антитела мигрируют в составе γ-глобулинов, поэтому ранее их называли гамма-глобулинами. В соответствии с международной классификацией, ныне совокупность сывороточных белков, обладающих свойствами антител, называют иммуноглобулинами и обозначают символом Ig.

Уникальность антител заключается в том, что они способны взаимодействовать только с тем антигеном, который индуцировал их образование. Практически антитела могут быть получены к любому антигену. Число возможных специфичностей антител, вероятно, составляет не менее 10⁹.

Молекулярная структура антител

Важная роль антител в формировании иммунитета и их исключительная специфичность стимулировали огромный интерес к изучению молекулярной структуры иммуноглобулинов, без этого было просто невозможно понять природу антител. В результате было установлено, что существует пять различных классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. Они различаются по молекулярной массе, содержанию углеводов, составу полипептидных цепей, коэффициентам седиментации и другим характеристикам (табл. 12).

Основная структурная единица молекулы иммуноглобулина состоит из двух идентичных полипептидных L-цепей (англ. light – легкий) и двух идентичных H-цепей (англ. heavy – тяжелый). Эти четыре цепи ковалентно связаны дисульфидными связями. Молекулярная масса легких цепей составляет около 23 кД, и они состоят примерно из 214 – 220 аминокислотных остатков. Существуют легкие цепи двух типов, один из них обозначается греческой буквой каппа (χ), а другой – лямбда (λ). Соотношение каппа/лямбда у человека равно 70: 30. Каппа– и лямбда-цепи обладают одинаковой способностью связываться с любой тяжелой цепью.

Таблица 12

Свойства классов иммуноглобулинов человека (по: Д. Джеске, Дж. Капре, 1987)

Молекулярная масса тяжелых цепей варьирует в пределах 50 – 73 кД. Идентифицировано пять классов тяжелых цепей, их обозначают греческими буквами: альфа (α), гамма (γ), эпсилон (ε), мю (μ) и дельта (δ). Соответственно обозначению тяжелой цепи обозначается и класс молекул иммуноглобулинов. У человека класс IgG в соответствии с подклассами гамма-цепи (γ1, γ2, γ3 и γ4) делится на 4 подкласса: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Класс IgA делится на 2 подкласса: IgA1 и IgA2, в соответствии с двумя подклассами альфа-цепи (α1 и α2).

На тяжелых цепях в зависимости от класса иммуноглобулинов может быть различное число углеводных остатков.

Крупным шагом на пути выяснения структуры молекулы антитела явились опыты Р. Портера и Г. Эдельмана. Р. Портер показал, что при обработке папаином молекула IgG распадается на 3 фрагмента (рис. 64). Два из них оказались одинаковыми;

каждый из них имел молекулярную массу около 45 кД и состоял из легкой цепи и половины тяжелой цепи и обладал способностью соединяться с антигеном. Поэтому эти два фрагмента обозначены как F(ab)1 и F(ab)2, т. е. фрагменты, связывающие антитела (англ. antigen binding). При этом каждый из них обладал только одним активным центром и поэтому связывание с антигеном не сопровождалось образованием крупных конгломератов. Таким образом было установлено, что Fab-фрагменты определяют антительную специфичность иммуноглобулина. Третий фрагмент имел молекулярную массу около 55 кД и состоял из других половин H-цепей. В связи с тем, что он характеризовался постоянством аминокислотного состава, его обозначили как Fc-фрагмент (англ. constant – постоянный). Fc-фрагмент не обладает способностью связывать антиген, но определяет ряд других важных видов биологической активности, необходимых для полного проявления всех функций антител. С Fc-фрагментом связана способность антител проходить через плаценту, усиливать фагоцитоз, нейтрализовать вирусы, связывать комплемент, фиксироваться на клетках кожи и пр.

Г. Эдельман для разрушения дисульфидных связей в молекулах антител обрабатывал их меркаптоэтанолом в концентрированном растворе мочевины. Это приводило к распаду молекул антител на две пары полипептидных цепей. Оказалось, что в полной мере активностью антител не обладает ни одна из цепей. Активные центры антител образуются только при совместном участии N-концевых половин тяжелой и легкой полипептидных цепей. Специфичность же активного центра определяется первичной структурой той и другой полипептидной цепи, т. е. генетически предопределена. Это подтверждается следующим опытом. Если поместить IgG в концентрированный раствор гуанидинхлорида, то это приведет к полному развертыванию полипептидных цепей из-за разрушения вторичной и третичной структуры и к утрате антительных свойств. Однако после длительного диализа и удаления таким путем гуанидинхлорида иммуноглобулин вновь приобретает первоначальную структуру и восстанавливает антительную активность.

Для выяснения природы специфичности антител большое значение имело изучение аминокислотной последовательности L– и Н-цепей. Как было установлено, все легкие цепи состоят из двух почти равных областей, по 110 – 112 аминокислотных остатков каждая. Первые 110 аминокислотных остатков очень изменчивы, т. е. составляют вариабельную (V) область, а остальные 110 остатков у данного вида всегда постоянны, составляя константную (C) область L-цепи. Тяжелая цепь также состоит из вариабельной области (V_H), включающей около 110 аминокислотных остатков, и константной части (C_H), на долю которой у молекул IgG приходится около 330 аминокислотных остатков. При более детальном исследовании аминокислотного состава в вариабельных участках L– и Н-цепей установлено наличие в них основных каркасных последовательностей и трех (у L-цепи) и четырех (у Н-цепи) коротких гипервариабельных участков:

у L-цепи – 24 – 34; 50 – 56; 89 – 97;

у Н-цепи – 31 – 37; 51 – 68; 84 – 91; 101 – 110.

Каркасная последовательность состоит из четырех постоянных участков, которые определяют аллотип цепей. Гипервариабельные последовательности определяют структуру активного центра. Он представляет собой своеобразную щель, которая обладает структурной дополнительностью к детерминантной группе «своего» антигена. Антитело только тогда свяжет соответствующий антиген, когда его детерминантная группа полностью вместится в щель активного центра, подобно тому, как ключ полностью входит в замочную скважину. Поскольку активный центр для каждого возможного антигена предопределен первичной структурой L– и Н-цепей, это обстоятельство свидетельствует об уникальном механизме генетического контроля биосинтеза антител. Легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов состоят из отдельных блоков – доменов (см. рис. 64). Каждый домен – это пептид, образованный из 100 – 110 аминокислотных остатков и содержащий одну внутрицепочечную петлю, которая возникает вследствие замыкания дисульфидного мостика внутри цепи. В легких цепях имеется два домена: один вариабельный и один константный; в тяжелых – один вариабельный и три или четыре (в зависимости от класса иммуноглобулина) константных. Активные центры антител образуются доменами вариабельных участков обеих цепей. Домены константных участков ответственны за другие функции молекул антител: домены C_L и C_H1 определяют изоантигенные различия антител; в области доменов C_H2 и C_H3 расположены рецепторы, ответственные за связывание C1q компонента комплемента, фиксацию антител на клетках и другие свойства (табл. 13).

Рис. 64. Структура молекулы IgG. Показана локализация участков, ответственных за различные функции (по: Д. Джеске, Дж. Капре, 1987)

С доменом C_H2 связаны также цепочки углеводов. Иммуноглобулины различных классов значительно отличаются по числу и локализации углеводных групп, хотя ряд олигосахаридов располагается в гомологичных положениях – между доменами или на их поверхности. Углеводные компоненты иммуноглобулинов имеют сходное строение. Они состоят из постоянного ядра (внутренняя часть олигосахаридной цепи) и вариабельной наружной части, определяющей специфичность углеводов. Углеводные компоненты влияют на реализацию биологических свойств антител в норме и обусловливают необычные свойства молекул при различных заболеваниях.

В молекуле IgG имеется единственный участок гликозилирования на Н-цепи, к которому могут присоединяться более 30 типов N-гликозилсахаров, что обусловливает микрогетерогенность молекул IgG. Наружные участки сахаров молекул иммуноглобулинов выступают в роли участков связывания с различными клеточными и белковыми рецепторами. Роль углеводов заключается, очевидно, в том, что они участвуют в транспорте и секреции гликозилированных белков молекул антител. Кроме того, они поддерживают конформацию доменов, необходимую для их функций, и защищают антитела от разрушения, прикрывая места, чувствительные к протеолизу.

Участок тяжелых цепей, соединяющий С_Н1 с Fc-фрагментом молекулы антитела, называется шарнирной областью; они у γ-, α– и δ-цепей не похожи на домены. У каждого класса тяжелых цепей шарнирная область имеет своеобразное строение, они представляют наиболее вариабельную часть тяжелых цепей и в связи с этим обусловливают различия между классами иммуноглобулинов по аминокислотной последовательности и варьированию сегментной гибкости.

Антитела, будучи сложными гликопротеидными молекулами, сами по себе также являются антигенами. В их составе различают три типа антигенных детерминантов (эпитипов): изотипы, аллотипы и идиотипы.

Таблица 13

Биологические функции доменов иммуноглобулинов человека

Изотипы – детерминанты, по которым различаются классы и подклассы тяжелых цепей и варианты каппа– и лямбда– легких цепей.

Аллотипы – детерминанты, кодируемые аллелями данного иммуноглобулинового гена.

Идиотипы – антигенные детерминанты, образуемые активными центрами молекул антител.

Полное схематическое изображение структуры молекулы IgG представлено на рис. 64. На долю этого класса приходится около 75 % общего количества всех иммуноглобулинов сыворотки крови человека.

Электронно-микроскопические исследования показали, что антитела класса IgG – гибкие молекулы, имеющие Y-форму, в которой две «руки» представлены Fab-фрагментами, а «талия» – Fc-фрагментом. Молекула IgG имеет размеры 240 × 57 × 19. Иммуноглобулины других классов характеризуются таким же типом строения, имеются лишь некоторые различия в дополнительной организации их функциональных единиц.

IgM – иммуноглобулины класса М

На поверхности зрелых В-лимфоцитов молекулы IgM располагаются в виде мономеров. Однако в сыворотке они существуют в форме пентамеров: молекула IgM состоит из пяти структурных единиц, аналогичных IgG, которые соединены между собой дисульфидными связями и J-цепью. Пять мономерных субъединиц в молекуле располагаются радиально, их Fc-фрагменты обращены к центру, а Fab-фрагменты – кнаружи (рис. 65).

Рис. 65. Схема пентамерной молекулы IgM (по Д. Джеске, Дж. Капре, 1987)

Тяжелая цепь IgM (μ-цепь) состоит из 576 аминокислотных остатков, 124 из них образуют вариабельный домен, а 452 – четыре константных домена. Эта тяжелая цепь не имеет шарнирной области, ее роль выполняет домен С_μН₂, обладающий некоторой конформационной лабильностью. J-цепь (англ. join – соединять) представляет собой особый полипептид, необходимый для полимеризации IgM и IgA. Он имеет молекулярную массу 15 кД и состоит из 129 аминокислотных остатков и одного сложного углеводного компонента. Синтез J-цепи кодируется особым геном, расположенным в хромосоме, не содержащей генов иммуноглобулинов.

IgA – иммуноглобулины класса А

Иммуноглобулин А может иметь одну из трех форм: обычную, димерную или тримерную. В организме имеется два вида молекул IgA – сывороточные и секреторные. Сывороточные IgA составляют 10 – 15 % всех иммуноглобулинов. Секреторные IgA (IgAs), которые находятся в слюне, слизи, пищеварительных соках, секретах слизистой носа, в молозиве и обеспечивают местный иммунитет всех слизистых оболочек, состоят из двух Ig-мономеров, J-цепи и гликопротеина, или секреторного компонента (рис. 66).

У человека имеется два изотипа этого иммуноглобулина – IgA1 и IgA2, причем в сыворотке преобладает подкласс IgA1, а в экстраваскулярных секретах несколько больше содержится изотипа IgA2. Все α-цепи состоят из одного вариабельного домена, трех С-доменов и шарнирной области, домены Сα2 и Сα3 содержат по одной добавочной дисульфидной связи, которых нет у других классов иммуноглобулинов. Секреторный компонент вырабатывается эпителиальными клетками слизистых оболочек и присоединяется к молекуле IgA в момент прохождения последней через эпителиальные клетки. Секреторный компонент повышает устойчивость молекул IgAs к действию протеолитических ферментов. Иммуноглобулины А обладают следующими свойствами: 1) препятствуют связыванию антигенов со слизистыми оболочками; 2) осуществляют транспорт полимерных иммунных комплексов, содержащих IgA; 3) в процессе транспорта через эпителиальные клетки они нейтрализуют находящиеся в них вирусы. Значение иммуноглобулинов класса А в обеспечении местного иммунитета исключительно велико, так как общая площадь поверхности слизистой оболочки составляет несколько сот квадратных метров. Через нее происходит интенсивное экзогенное воздействие на иммунную систему. Но и сама слизистая активно участвует в формировании иммунитета. В ней содержится большое количество антителообразующих клеток. Лимфоциты слизистой оболочки синтезируют различные интерлейкины (IL-2, IL-4, IL-6), γ-интерферон. Клетки кишечного эпителия индуцируют пролиферацию супрессорных CD8-лимфоцитов, а респираторного – хелперных CD4-лимфоцитов.

Рис. 66. Схема строения секреторного IgA человека. Соотношение размеров цепей соответствует истинному:

J – J-цепь; CK – секреторный компонент (по: Д. Джеске, Дж. Капре, 1987)

Валентность антител

Под валентностью антител понимают количество способных реагировать с антигеном активных центров. В соответствии с указанными различиями молекулярной организации, иммуноглобулины разных классов бывают двухвалентными (IgG) или поливалентными (IgM). Являясь пентамерами, молекулы IgM имеют десять активных центров. Это свойство антител выявляется при взаимодействии их с антигенами: связываясь с аналогичными антигенными детерминантами, расположенными на разных, например бактериальных клетках, IgG и IgM вызывают их видимую агрегацию. Мономерные же молекулы IgA, хотя и имеют два активных центра, не осаждают антигены, так как их активные центры настолько сближены, что IgA не может выполнять роль связующего мостика.

Наряду с двухвалентными, или полными, антителами, при некоторых заболеваниях в организме человека накапливаются так называемые неполные, или моновалентные антитела. Соединяясь с антигеном, они не могут вызвать его агрегацию, так как связь между ними происходит только в одном из двух активных центров, а лишь блокируют его. Это не значит, что второй активный центр в таких антителах отсутствует. По неизвестным причинам он замаскирован, не проявляется. Присутствие неполных (блокирующих) антител выявляют с помощью антиглобулиновой реакции Кумбса (см. главу 42).

Особенности генетического контроля биосинтеза антител

Антитела могут быть получены к любому возможному антигену, общее количество которых превышает 10⁷. Какие же механизмы обеспечивают появление огромного разнообразия иммуноглобулинов с различной антительной специфичностью? Антитела – это белки, а синтез каждого белка запрограммирован соответствующим геном. Генотип человека составляет около 100 000 генов. Поэтому долгое время вопрос о том, как осуществляется генетический контроль синтеза антител, оставался неясным, так как господствовал принцип: один ген – один белок. В 1965 г. У. Дрейер и Дж. Беннетт высказали предположение о том, что синтез иммуноглобулинов контролирует один для каждого класса С-ген и множество V-генов, расположенных отдельно от С-гена. Эта гипотеза нашла подтверждение в 1977 г. Используя набор рестриктаз, С. Тонегава с сотрудниками установили, что в эмбриональных клетках мышей участки ДНК, кодирующие V– и С-домены легкой цепи λ, находятся на далеком расстоянии друг от друга, а в зрелых клетках – значительно ближе. Клонирование этих генов показало, что в них отсутствуют нуклеотиды для 13 аминокислот. Они были обнаружены на расстоянии в несколько тысяч нуклеотидных пар от остальной части V-гена и получили название J-сегмента. Последний располагается около С-гена. Было установлено, что ген, кодирующий λ-цепь, имеет следующую экзон-интронную структуру: L (область, кодирующая лидерный пептид, необходимый для секреции иммуноглобулинов из клетки) – интрон – V-ген – интрон – J-ген – интрон – С-ген. В ДНК людей обнаружены шесть С-генов для λ-цепи, перед каждым из них имеется свой J-ген. Позднее было показано, что синтез γ-цепи контролируется 300 вариантами V-гена и 4 вариантами J-гена. Рекомбинации этих генов позволяют получить 1200 (300 × 4) вариантов различающихся по своей специфичности L-цепей.

Организация генов Н-цепи также имеет особенности:

1. Существует 9 разных С-генов, кодирующих С-домены Н-цепей различных изотипов (γ1, γ2, γ3, γ4, α1, α2, μ, ε, δ).

2. V-гены тяжелой цепи состоят не из двух сегментов, а из трех: V-, D-, J-. D-сегмент (англ. diversity – разнообразие) кодирует от 1 до 9 аминокислотных остатков.

3. Любой из V-генов тяжелой цепи может соединяться с любым из С-генов.

4. Все С-гены, как и V-гены, имеют экзон-интронную структуру. Каждый домен кодируется отдельным экзоном, между последними расположены интроны.

5. В ходе иммунного ответа V-гены тяжелой цепи могут переключаться с С-гена одного класса на С-гены другого класса, что приводит к появлению антител одной и той же антительной специфичности, но принадлежащих к разным классам (IgM, IgG, IgA, IgE, IgD).

В общей сложности синтез Н-цепей иммуноглобулинов контролируют 200 вариантов V-генов, 20 вариантов D-генов, 4 варианта J-генов и 9 вариантов С-генов. Схематически полный ген Н-цепи иммуноглобулинов выглядит таким образом: L-ген – интрон – V-ген – интрон – D-ген – интрон – J-ген – интрон – С-ген.

Организация генов иммуноглобулинов в эмбриональном и соматическом геномах различна. В эмбриональном геноме зародышевые V-гены (как L-цепи, так и Н-цепи) отделены от участков С-генов, D– и J-сегментов многими тысячами пар нуклеотидов. В соматических клетках эти сегменты сближаются, хотя по-прежнему сохраняют экзон-интронную структуру. Сборка V-генов и сближение их с D-, J– и С-генами происходят с помощью особых сигнальных последовательностей, которые расположены на 3'-концах всех зародышевых V-генов и в инвертированном виде – на 5'-концах всех зародышевых J-генов. У D-сегментов сигнальные последовательности располагаются и на 5'-, и на 3'-концах.

Формирование полного гена L-цепи молекулы иммуноглобулина происходит следующим образом. Путем рекомбинации вначале лидерный сегмент с его интроном сливается с одним из V– и с одним из J-генов. Одновременно при этом происходит их сближение с С-геном. Образующийся блок из экзонов и интронов транскрибируется в единую мРНК. После этого все интроны из нее вырезаются и формируется с помощью механизма сплайсинга зрелая мРНК, представленная только генами V, J, C, которая и транслируется в единую цепь.

Благодаря избирательному соединению одного из V-генов с одним из J-генов подавляется выражение остальных V– и J-генов в данной лимфоидной клетке. Таким же образом происходит формирование гена и для Н-цепи, только в нем участвует и D-сегмент. Кроме того, в случае образования Н-цепи имеется дополнительная рекомбинация, с помощью которой происходит переключение синтеза тяжелой цепи одного класса на синтез тяжелой цепи другого класса. Обычно вначале синтезируются иммуноглобулины класса IgM, а затем происходит переключение на синтез иммуноглобулинов класса IgG или других классов.

Таким образом, существует три системы генов иммуноглобулинов: две – для L-цепи (одна – для λ, другая – для χ) и одна – для Н-цепи.

Общее число возможных рекомбинаций для Н-цепей иммуноглобулинов составляет:

Общее же число возможных рекомбинаций для всех иммуноглобулинов составляет:

Точки объединения зародышевых генов строго не фиксированы. Это увеличивает количество возможных вариантов полипептидных цепей, а в том случае, когда они участвуют в формировании активных центров, то и их разнообразия. Кроме того, в период созревания В-лимфоцитов в V-генах происходят точечные соматические мутации, которые окончательно подгоняют структуру активного центра антитела к структуре детерминанта антигена. Считается, что общее количество вариантов антител возрастает за счет неточности сплайсинга и соматических мутаций еще в 100 раз и составляет около 2 млрд:

Таким образом, приобретенный иммунитет может быть обеспечен к любому возбудителю, к любому возможному чужеродному антигену. Решающий вклад в обеспечение многообразия иммуноглобулинов (специфичности антител) вносят следующие факторы:

1) наличие множества зародышевых генов иммуноглобулинов;

2) внутригенные рекомбинации, обусловленные экзон-интронной структурой V-, D-, J-, C-генов;

3) ассоциация различных L-цепей с различными Н-цепями;

4) неточность сплайсинга;

5) соматические мутации V-генов в зрелых В-лимфоцитах.

Роль антител в формировании иммунитета

Благодаря своей способности специфически взаимодействовать с бактериальными клетками и продуктами их жизнедеятельности, в том числе с токсинами и ферментами, а также с другими микроорганизмами, антитела играют важную роль в формировании приобретенного постинфекционного, поствакцинального и пассивного иммунитета. Эта их роль заключается в том, что связываясь с токсинами, они нейтрализуют их действие и обеспечивают формирование антитоксического иммунитета. Связываясь с вирусами, особенно блокируя рецепторы, с помощью которых они адсорбируются на клетках, антитела создают иммунитет против вирусов. Образование комплекса антитело + антиген запускает классический путь активации системы комплемента со всеми его эффекторными последствиями (лизис бактерий, опсонизация, формирование очага воспаления, стимуляция системы макрофагов). Антитела, взаимодействуя с бактериями, опсонизируют их, т. е. делают их фагоцитоз более эффективным. В результате взаимодействия антител с растворимыми антигенами, выделяющимися в кровь, образуются так называемые циркулирующие иммунные комплексы, с помощью которых антигены выводятся из организма, в основном, желчью и мочой.

Следовательно, специфически распознавая антигены и связываясь с ними, антитела стимулируют активность всех систем иммунитета и тем самым способствуют освобождению организма от чужеродных агентов.

Разные классы иммуноглобулинов в неодинаковой степени участвуют в различных иммунологических реакциях.

Высокая нейтрализующая активность антител, принадлежащих к IgG, свидетельствует о важной роли их в антитоксическом иммунитете. Антитела IgM особенно активны в реакциях фагоцитоза с корпускулярными антигенами и поэтому играют существенную роль в антимикробном иммунитете. В реакциях нейтрализации вирусов особенно активны антитела IgA, следовательно, им принадлежит большая роль в противовирусном иммунитете. Кроме того, секреторные IgAs обусловливают местный иммунитет слизистых оболочек. Наконец, антитела IgE, обладающие гомоцитотропностью, опосредуют реакции гиперчувствительности немедленного типа.

Выработка антител по первичному и вторичному иммунному ответу

Различают два варианта выдачи иммунного ответа в форме биосинтеза антител: первичный ответ – после первой встречи организма с данным антигеном, и вторичный ответ – при повторном контакте его с одним и тем же антигеном спустя 2 – 3 недели. Внешне первичный и вторичный иммунный ответ различаются по следующим признакам (рис. 67): продолжительность латентного периода, скорость нарастания титра антител, общее количество синтезируемых антител, последовательность синтеза иммуноглобулинов различных классов. Клеточные механизмы первичного и вторичного иммунного ответа, как будет показано ниже, также отличаются.

Рис. 67. Выработка антител при первичном и вторичном иммунном ответе

Первичный иммунный ответ. 1) Биосинтез антител начинается не сразу после контакта с антигеном, а после некоторого латентного периода, продолжающегося 3 – 5 дней. В течение этого периода происходит процесс распознавания антигена и формирования клеток, которые способны синтезировать антитела к нему; 2) скорость синтеза антител относительно невелика; 3) титры синтезируемых антител не достигают максимальных значений; 4) первыми синтезируются антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса IgM, затем IgG. Позже всех появляются, да и то не во всех случаях, IgA и IgE.

Вторичный иммунный ответ. 1) Латентный период очень непродолжительный, в пределах нескольких часов; 2) кривая, характеризующая скорость накопления антител, идет значительно круче вверх, чем при первичном ответе, и имеет логарифмический характер; 3) титры антител достигают максимальных значений; 4) синтезируются сразу антитела, относящиеся к классу IgG.

Вторичный иммунный ответ обусловлен формированием клеток иммунной памяти.

Регуляция продукции антител

Существуют по крайней мере три системы регуляции продукции антител, или, в более широком плане, силы иммунного ответа. Одна из них действует на генетическом уровне, другая – на нейрогуморальном. Не исключено, что вторая подчинена первой. Давно было замечено, что введение одного и того же антигена индуцирует у разных индивидуумов данного вида появление различного количества антител: от нуля до высокого уровня. Исследование детей с наследственными иммунодефицитами позволило установить, что существуют разные генетические системы контроля иммунного ответа. Организм человека может быть неполноценным в отношении синтеза антител к определенному антигену или антител определенного класса иммуноглобулинов и в то же время выдавать нормальный иммунный ответ на другие антигены. Гены Ir, ответственные за силу иммунного ответа, тесно сцеплены с локусами главной системы гистосовместимости человека. Описано более 20 генов иммунного ответа.

Вместе с тем продукция антител регулируется и симпатико-адреналовой системой. Показано, что генерализованное возбуждение медиальных зон гипоталамуса ведет к резкому усилению продукции антител. Такой же эффект вызывает гормон роста, образуемый гипофизом. Наоборот, воздействие на симпатическую систему, ведущее к ослаблению адренергического звена регуляции, сопровождается сильным угнетением продукции антител вплоть до полного исчезновения их из сыворотки.

Третья система регуляции содержания антител связана с идиотип-антиидиотипическими отношениями.

Образование клеток иммунной памяти

Иммунная память – одна из форм иммунного ответа. Она означает способность организма человека или животного реагировать на повторное введение того антигена, которым он был иммунизирован ранее, быстрее и с большей силой. Иммунная память на клеточном уровне – это результат генерации особых антигенспецифических популяций T– и B-клеток памяти (T_п и B_п). Она проявляется как в отношении выработки антител, так и в отношении других форм иммунного ответа и может сохраняться долгое время.

Клетки памяти представляют собой ту часть Т– и В-антигенстимулированных лимфоцитов, которые после 2 – 3 делений переходят в покоящееся состояние и длительное время рециркулируют в организме. Таким образом, они служат своеобразным резервом иммунокомпетентных клеток, способных при повторной встрече с соответствующим антигеном быстро превращаться в клетки-эффекторы иммунного ответа. В-лимфоциты в этом случае быстро трансформируются в антителообразующие клетки, и выработка антител происходит по вторичному типу. В свою очередь антигенстимулированные Т-лимфоциты, циркулируя в организме, готовы в любой момент распознать антиген, который их сенсибилизировал, и немедленно включиться в иммунный ответ.

Следовательно, возникновение и поддержание популяции клеток иммунной памяти – одно из главных условий длительного сохранения приобретенного иммунитета. Состояние иммунной памяти обусловлено не столько присутствием долгоживущих клеток памяти, сколько постоянной стимуляцией их образования антигенами, которые длительно сохраняются в организме. Антигены могут долгое время сохраняться на поверхности фолликулярных дендритных клеток и в различных других клетках вне лимфоидной системы, постоянно воздействуя на иммунокомпетентные клетки.

Предполагается, что процесс дифференциации зрелых В-лимфоцитов в клетки памяти происходит на ранних стадиях иммунного ответа в зародышевых центрах, формирующихся в фолликулах лимфоидной ткани. Он зависит от сигнала, который получает митогенный рецептор В-клетки (мембранный белок CD40) от Т-хелпера. Этот сигнал и «разрешает» В-лимфоциту пойти по пути генерации клеток памяти. Сигнал В-лимфоциту передает мембранный рецептор Т-хелпера – гликопротеин gp39, который служит лигандом, т. е. связывающей молекулой, для белка CD40. Следовательно, формирование клеток памяти требует кооперативного участия В-клеток, Т-хелперов и фолликулярных дендритных клеток.

Антигензависимые неспецифические иммуноглобулины

У неиммунизированных людей и животных в сыворотке крови содержится около 2,5 – 7,0 % иммуноглобулинов, значительную часть которых составляют так называемые неспецифические иммуноглобулины (НИГ), т. е. иммуноглобулины с неустановленной антительной специфичностью. Поскольку их синтез также индуцируется данным антигеном, они получили название антигензависимых НИГ. Существует тесный параллелизм между образованием специфических и неспецифических иммуноглобулинов. Установлено, что антитела (специфические иммуноглобулины) и НИГ синтезируются клетками разных субпопуляций B-лимфоцитов. Количество НИГ при первичном иммунном ответе может превышать количество специфических антител в 10–100 раз. Синтез НИГ может быть индуцирован и в покоящихся B-клетках, но только при условии прямого контакта T– и B-клеток за счет антигенспецифического взаимодействия. У B-лимфоцитов есть маркер Ly-1 (СД5). По этому маркеру различают B-1a-лимфоциты (СД5⁺) и B-1b-лимфоциты (СД5^–). Синтез антигенспецифических антител осуществляют лимфоциты B-2 («обычные» лимфоциты).

СД5 – типичный мембраносвязанный белок-рецептор. Он есть у большинства тимоцитов, всех зрелых Т-лимфоцитов и других клеток. Лиганды СД5 имеют разные клетки: лимфоидного, миелоидного и эпителиального происхождения, поэтому СД5⁺ B– и T-клетки взаимодействуют не только друг с другом, но и с другими клеточными популяциями. В отличие от B-2-лимфоцитов клетки B-1 используют ограниченный набор Ig-генов, поэтому они обладают специфическим антительным рецептором, главным образом IgM-изотипа, а их переключения на IgG-изотип практически не происходит, вследствие чего клетки B-1 продуцируют только IgM антитела, т. е. НИГ. Считается, что НИГ выполняют функции первой линии защиты от микробных и вирусных патогенов. Однако активация B-1a– и B-1b-клеток под действием микробных антигенов может быть и вредной. Установлено, что СД5⁺ B-клетки играют существенную роль в образовании аутоантител. Количество СД5⁺ B-клеток заметно увеличивается при ряде аутоиммунных заболеваний.

Моноклональные антитела

Моноклональные антитела – антитела, синтезируемые и секретируемые одним клоном антителообразующих клеток, т. е. клеток, генетически идентичных, происходящих из одного и того же зрелого В-лимфоцита. Поэтому все свойства моноклональных антител: класс иммуноглобулина, структура полипептидных цепей и активных центров, т. е. антительная специфичность, – идентичны. Они распознают только один антиген и взаимодействуют только с ним. В связи с этим значительно повышается и специфичность всех иммунологических реакций, протекающих с участием моноклональных антител. Образование в организме моноклональных антител было обнаружено давно, в частности при плазмоцитомах – при развитии лимфоидных опухолей. В этом случае в организме больного происходит размножение какого-то одного клона лимфоцитов. Синтезируемые ими миелоидные иммуноглобулины представляют собой моноклональные антитела, обладая одной и той же антительной специфичностью. Вместе с тем плазмоцитомные клетки способны, подобно другим раковым клеткам, бесконечно размножаться in vitro.

Искусственное получение клеток-продуцентов моноклональных антител оказалось возможным после того, как в 1975 г. Г. Кёлер и К. Мильштейн разработали методику получения клеточных гибридов – гибридоmм. Они осуществили слияние лимфоцитов селезенки мыши, иммунизированной бараньими эритроцитами, с культивируемыми клетками миеломы и установили, что некоторые из полученных гибридоmм секретируют антитела к бараньим эритроцитам. Для получения гибридmом были использованы такие штаммы миеломных клеток, которые не содержат фермента гипоксантинфосфорибозилтрансферазы и поэтому гибнут в селективной питательной среде – ГАТ (содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин); лимфоциты в такой среде не погибают. Для слияния лимфоцитов с миеломными клетками был использован полиэтиленгликоль, так как под его влиянием сливаются преимущественно размножающиеся или активированные с помощью антигена В-лимфоциты. Возникающие при слиянии клеток гибридомы наследуют от иммунных В-лимфоцитов способность синтезировать иммуноглобулины только одной антительной специфичности и способность размножаться в селективной среде с ГАТ, а от миеломной клетки – способность к бесконечному размножению.

Процесс получения гибридmом довольно сложен и включает в себя следующие основные стадии:

1. Получение линии миеломных клеток. Чаще всего с этой целью применяют мышиные или крысиные клеточные линии.

2. Получение иммунных В-лимфоцитов (антителообразующих клеток) из селезенки иммунизированного соответствующим антигеном животного.

3. Создание таких условий в культурах смешанных клеток, при которых хотя бы некоторые клетки той и другой популяции могли осуществить слияние. Частота слияния относительно невелика: одна гибридома образуется примерно на 10⁴ клеток.

4. Выделение гибридmом и отбор из них интересующего клона.

5. Накопление клеток полученного клона для его практического использования.

Образующиеся на всех стадиях клетки консервируют в жидком азоте, чтобы в любой момент можно было возвратиться на соответствующую стадию и сохранить нужные клоны. Отбор клеток интересующего клона, т. е. продуцирующих антитела заданной специфичности, – наиболее важная стадия гибридомной технологии, так как новообразованные гибридомы нередко являются нестабильными в отношении синтеза антител. Обнаруженные клоны антителообразующих гибридоmм должны быть немедленно реклонированы. Это связано с тем, что после слияния многие гибридные клетки начинают выбрасывать «лишние» хромосомы, пока число их не окажется равным диплоидному набору, поэтому существует опасность утраты той хромосомы, которая несет гены иммуноглобулинов. Путем клонирования полученных гибридоmм возможно разделить моноклональные антитела, специфичные в отношении одних и тех же или различных эпитопов одного антигена, т. е. получить набор моноклональных антител против различных, фактически любых, эпитопов определенной молекулы, или иммуногена. Одно из преимуществ гибридоmм заключается в том, что с их помощью можно получить неограниченное количество антител, которые сохраняют свою высочайшую специфичность и чувствительность. Моноклональные антитела используют для исследования структуры и функций разных частей молекул, а также различных типов клеток, например деталей строения рецепторов Т– и В-лимфоцитов.

Гибридомы можно создавать не только на основе В-лимфоцитов с целью получения моноклональных антител, но и на основе Т-лимфоцитов для получения клонов гибридmом, избирательно синтезирующих те или иные лимфокины. Этим термином обозначают не относящиеся к иммуноглобулинам белки и полипептиды, синтезируемые и секретируемые активированными Т-лимфоцитами. Идентифицированные лимфокины называют интерлейкинами.

Действие антител проявляется немедленно и характеризуется специфичностью. Так, например, если в крови уже имеются антитоксины, то введенный токсин нейтрализуется сразу, как только с ним взаимодействует антитоксин. Соответственно введение иммунной сыворотки или γ-глобулина сразу же создает пассивный иммунитет против возбудителя или его токсина. Нейтрализация антителами возбудителей или их токсинов и обеспечивает состояние иммунитета к ним. Однако не во всех случаях антитела, образование которых индуцирует антиген, обусловливают невосприимчивость к нему. Иногда повторное введение некоторых антигенов, например сыворотки, приводит не к развитию состояния невосприимчивости, а, наоборот, вызывает повышение чувствительности к ней, которое проявляется в виде тяжелых реакций.

С. Рише и Г. Портье в 1902 г. высказали предположение, что такое повышение чувствительности к сыворотке обусловлено наличием в ней чужеродного белка. Своими опытами они показали, что первичное введение собакам экстрактов из актиний не вызывает у них каких-либо токсических проявлений. Однако повторное введение, сделанное через 2 – 9 нед., сразу же вызывало резкое ухудшение состояния собак. У них наблюдались слабость, нарушение дыхания, а некоторые собаки погибали. Смерть наступала даже в том случае, когда повторная доза была во много раз меньше первоначальной. С. Рише назвал эту реакцию анафилаксией (греч. ana – обратно, phylaxis – защита), т. е. состоянием беззащитности против данного яда. Сходные результаты были получены Г. П. Сахаровым в 1905 г. в опытах с повторным введением чужеродного сывороточного белка морским свинкам. Морские свинки, сенсибилизированные первичным введением лошадиной сыворотки, на ее повторное введение также отвечали резко повышенной чувствительностью, крайняя степень проявления которой получила название анафилактического шока. Особенностью этой формы повышенной чувствительности является немедленность ее проявления на повторное введение антигена.

В 1890 г. Р. Кох обнаружил другой тип реакций повышенной чувствительности. Он показал, что при подкожном введении больному туберкулезом туберкулина (антигенный препарат, представляющий собой фильтрат автоклавированной бульонной культуры возбудителя туберкулеза) через 6 – 12 ч на месте введения развивается туберкулиновая реакция: краснота, уплотнение, иногда припухлость. Максимального развития реакция достигает через 24 – 48 ч.

Таким образом, различают два типа повышенной чувствительности: гиперчувствительность немедленного и замедленного типов. Поскольку эти реакции на повторное введение антигена отличаются от обычных реакций иммунитета, они получили название аллергических (греч. allos – другой, ergo – реакция, действие).

Гиперчувствительность немедленного типа

К реакциям гиперчувствительности немедленного типа (ГЧН) относятся: сывороточная анафилаксия, лекарственная анафилаксия, сывороточная болезнь, сенная лихорадка, бронхиальная астма, крапивница и другие аллергические реакции, в том числе к таким аллергенам, как пыльца некоторых растений, красители, шерсть и т. п. В их основе лежат общие механизмы, которые лучше всего изучены при анафилаксии.

Реакции анафилаксии, как и другие реакции гиперчувствительности немедленного типа, являются иммунологически специфичными и проявляются в отношении того антигена, к которому организм сенсибилизирован. Для возникновения состояния сенсибилизации достаточно введения очень малых доз антигена (аллергена). В частности, первичная сенсибилизирующая доза лошадиной сыворотки для морской свинки составляет 0,000001 мл. Состояние повышенной чувствительности развивается через 7 – 14 дней после введения антигена и сохраняется месяцами и годами. Для его выявления вводят внутривенно вторую, разрешающую дозу антигена. Если разрешающую дозу ввести не внутривенно, а внутрикожно, то развивается местная анафилаксия (феномен Артюса). Она характеризуется появлением через 30 – 60 мин на месте введения отека и развитием гиперемии. В последующем воспалительный очаг уплотняется, подвергается некрозу и рубцеванию.

Реакция анафилаксии характеризуется следующими особенностями: иммунологической специфичностью, немедленностью проявления (анафилактический шок развивается через несколько минут после введения разрешающей дозы) и опосредованностью антителами. Доказательством ведущей роли антител в реакциях гиперчувствительности немедленного типа (ГЧН) является возможность переноса состояния повышенной чувствительности от сенсибилизированного донора с помощью его сыворотки или чистой фракции антител несенсибилизированному реципиенту. Такой пассивный перенос анафилаксии с помощью антител приводит к развитию у реципиента состояния повышенной чувствительности, которая может быть выявлена введением ему разрешающей дозы антигена. Другим доказательством роли антител в ГЧН является реакция Праустница – Кюстнера: если сыворотку человека, сенсибилизированного каким-то антигеном, ввести внутрикожно здоровому нормальному реципиенту, а затем ввести аллерген в это же место, то наступит характерная местная реакция ГЧН.

В развитии анафилаксии можно выделить следующие три стадии: 1) иммунологическую, 2) патохимическую и 3) патофизиологическую. Иммунологическая стадия, которая определяет специфичность анафилаксии, характеризуется взаимодействием антигена с антителом, фиксированным на клетках сенсибилизированного организма. Для патохимической стадии характерна активация протеолитических ферментов, в результате действия которых из клеток высвобождаются биологически активные вещества. В настоящее время известно более 30 таких веществ, участвующих в механизме развития анафилаксии, однако основная роль принадлежит гистамину, серотонину, брадикинину и лейкотриенам. Лейкотриены A, B, C, D, E – продукты липоксигеназного превращения арахидоновой кислоты – освобождаются тучными клетками, базофилами и тромбоцитами. Патофизиологическая стадия развивается в результате действия биологически активных веществ на различные системы органов, в особенности на гладкую мускулатуру. Наблюдающееся в результате такого воздействия сокращение гладких мышц определяет клиническую картину анафилактического шока у животных. В частности, у морских свинок поражается гладкая мускулатура бронхов, что ведет к развитию бронхиального спазма. У собак наблюдается спазм гладкой мускулатуры кишечника, у кроликов – спазм легочных артерий, у человека страдает сердечно-сосудистая система. К наиболее характерным симптомам анафилактического шока относятся: гипотония, учащение мочеиспускания и дефекации, отек, лейкопения, тромбоцитопения, снижение титра комплемента, понижение свертываемости крови и температуры тела.

Механизм анафилаксии

Основную роль в механизме анафилаксии и других реакций гиперчувствительности немедленного типа играет процесс взаимодействия с антигеном антител, фиксированных на клетках, которые в результате этого взаимодействия высвобождают биологически активные вещества. Клетками, способными высвобождать медиаторы данного типа повышенной чувствительности (гистамин, брадикинин и т. п.), являются мастоциты и базофилы. Мастоциты находятся в соединительной ткани почти всех органов. Свойством фиксироваться на тучных клетках и базофилах обладают антитела, относящиеся к классу IgE. Ранее, пока природа этих антител не была еще установлена, они получили название реагинов. Особенностью антител IgE является отсутствие у них способности фиксировать комплемент и проникать через плаценту. Полагают, что помимо участия в реакциях ГЧН, антителам IgE принадлежит определенная роль в формировании местного иммунитета.

Цитофильные свойства этих иммуноглобулинов связаны с наличием особых рецепторов, которые располагаются в области Fc-компонента молекулы антитела. Иногда это свойство (цитофильность) называют гомоцитотропностью, т. е. сродством к клеткам собственного вида, или гетероцитотропностью, когда это сродство проявляется по отношению к клеткам другого вида животного. У человека и у некоторых животных антитела, относящиеся к классу IgE, обладают гомоцитотропностью, а гетероцитотропностью – иммуноглобулины IgG-1, IgG-3, IgG-4.

В самом общем виде механизм анафилаксии может быть описан следующим образом. Введение сенсибилизирующей дозы антигена индуцирует образование специфических антител, в том числе относящихся к классу IgE. Благодаря своей цитофильности последние фиксируются на поверхности тучных клеток и базофилов. Этот процесс и лежит в основе сенсибилизации организма к данному антигену. Попадая повторно в организм, он распознается антителами, фиксированными на клетках, и быстро вступает во взаимодействие с ними. Следствием этого является активация протеаз клеток, в результате которой высвобождаются медиаторы, опосредующие патофизиологическую основу анафилактического шока.

Таким образом, одним из необходимых условий развития анафилаксии является наличие доступа антигена к антителам, фиксированным на клетках. Если в крови циркулирует достаточное количество антител, обладающих такой же специфичностью, но относящихся к другим классам иммуноглобулинов (IgG, IgM), они распознают и блокируют его активные центры. Такой нейтрализованный антиген уже не может взаимодействовать с антителами IgE, фиксированными на клетках, поскольку его детерминантные группы блокированы. В случае, если специфичных к данному антигену и свободно циркулирующих в крови антител мало, антиген беспрепятственно достигает клеток, на которых располагаются антитела IgE. Следовательно, для предотвращения реакции ГЧН необходимо индуцировать образование антител, которые бы препятствовали доступу соответствующего антигена к антителам, фиксированным на клетках, т. е. антител классов IgG и IgM.

Развитие анафилактического шока можно предупредить с помощью различных лекарственных препаратов, например атропина, димедрола, эфирного наркоза, а также других веществ с различным механизмом действия (сапонин, желчно-кислотные соли и т. п.). Вместе с тем установлено, что если животное благополучно перенесло анафилактический шок, оно утрачивает на некоторое время (2 – 3 нед.) чувствительность к данному антигену. Такое же состояние десенсибилизации может быть достигнуто путем введения сенсибилизированному животному небольших разрешающих доз специфического антигена. В связи с этим А. М. Безредка предложил для предупреждения сывороточного анафилактического шока перед введением большой дозы сыворотки вводить сначала небольшую ее часть (0,5 – 1,0 мл) подкожно или несколько более мелких, но постепенно возрастающих доз внутривенно с интервалом 15 – 30 мин.

Реакции гиперчувствительности замедленного типа

Этот тип гиперчувствительности возникает при многих инфекционных болезнях, например при туберкулезе, бруцеллезе, дизентерии, токсоплазмозе, некоторых гельминтозах, микозах и т. д., и выявляется с помощью соответствующих кожных реакций, которые служат специфическими диагностическими пробами. Состояние гиперчувствительности замедленного типа могут индуцировать различные лекарственные препараты, красители, антисептики и другие аллергены. К аллергенам органической и неорганической природы, имеющим низкую молекулярную массу, но обладающим способностью соединяться с белками кожи и слизистых оболочек (т. е. являющимся гаптенами), нередко возникает так называемая контактная аллергия. Сенсибилизация формируется в результате длительного контакта с такими веществами и проявляется в местных изменениях на коже и слизистых оболочках. Наиболее типичным примером повышенной чувствительности замедленного типа является аллергическая реакция кожи больных туберкулезом людей и животных на туберкулин. К реакциям гиперчувствительности замедленного типа относится также трансплантационный иммунитет.

Основные особенности гиперчувствительности замедленного типа. Гиперчувствительность замедленная (ГЧЗ), как и повышенная чувствительность немедленного типа, индуцируется веществами антигенной природы и отличается высокой иммунологической специфичностью, т. е. она проявляется только в отношении того антигена, который индуцировал ее развитие. В связи с этим кожные аллергические пробы, выявляющие эти состояния, имеют большое диагностическое значение. Основные отличия гиперчувствительности замедленного типа от повышенной чувствительности немедленного типа следующие.

Во-первых, местные и общие реакции, выявляющие гиперчувствительность замедленного типа, развиваются спустя значительно больший срок после введения антигена, чем в случае гиперчувствительности немедленного типа. В частности, кожные реакции в этом случае появляются через 6 – 8 ч и достигают максимального развития через 1 – 2 суток. Интенсивность ГЧЗ определяют по диаметру уплотненного участка ткани на поверхности кожи, лишенной волос. Таким образом, для реакции повышенной чувствительности замедленного типа характерно отсутствие эффекта немедленности.

Во-вторых, гистологическая картина местных проявлений гиперчувствительности замедленного действия отличается от таковой при повышенной чувствительности немедленного типа тем, что в очаге реакции преобладают лимфоциты и моноциты. В развитии кожной реакции, выявляющей гиперчувствительность немедленного типа, преобладающую роль играют полиморфно-ядерные лейкоциты.

В-третьих, гиперчувствительность замедленного типа не может быть передана пассивно от сенсибилизированного организма с помощью его сыворотки интактному (несенсибилизированному) организму, т. е. этот тип повышенной чувствительности не связан с антителами.

Главное отличие реакций гиперчувствительности замедленного типа от реакций гиперчувствительности немедленного типа заключается в том, что они опосредуются не антителами, а сенсибилизированными клетками – Т-лимфоцитами, т. е. лимфоцитами, которые прошли иммунологическое «обучение» в тимусе. Т-лимфоциты несут на своей поверхности различные специфические рецепторы, с помощью которых распознают самые различные чужеродные вещества, в том числе трансплантационные антигены, и способны с ними взаимодействовать. Все типы реакций гиперчувствительности замедленного действия характеризуются общностью иммунологических механизмов, в которых главными действующими агентами являются лимфоциты и продуцируемые ими гуморальные факторы. Опосредуемость этих реакций лимфоцитами подтверждается многими феноменами среди которых в первую очередь можно выделить следующие три.

1. Состояние повышенной чувствительности замедленного типа можно передать от донора другому организму, но только путем введения последнему от сенсибилизированного организма его лимфоцитов, а не антител. В отличие от пассивного, такой тип иммунного состояния, передаваемого не сывороткой, а лимфоцитами, получил название адоптивного (англ. adopt – присваивать), т. е. присвоенного. Например, если от сенсибилизированного туберкулином животного передать внутривенно или внутрибрюшинно лимфоидные клетки здоровому животному, то оно будет отвечать на введение туберкулина положительными кожными реакциями гиперчувствительности замедленного типа.

2. Реакции гиперчувствительности замедленного типа можно подавить или ослабить, если перед введением разрешающей дозы аллергена ввести антилимфоцитарную сыворотку.

3. С реакцией ГЧЗ хорошо коррелирует способность сенсибилизированных Т-лимфоцитов синтезировать различные медиаторы – лимфокины, в том числе фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (ФИМ). Он образуется при стимуляции сенсибилизированных Т-лимфоцитов in vitro соответствующим антигеном. Добавление питательной среды, содержащей ФИМ, к клеткам перитонеального экссудата морской свинки в стеклянных вертикальных капиллярах будет подавлять или ограничивать выход лейкоцитов из капилляров. Несенсибилизированные Т-лимфоциты этим свойством не обладают. Со способностью к реакциям коррелирует и такой признак сенсибилизированных Т-лимфоцитов, как стимуляция их пролиферации in vitro с помощью соответствующего антигена. Т-лимфоциты, участвующие в реакциях гиперчувствительности замедленного типа, обозначают как Т_ГЧЗ, они имеют обычно фенотип Lyt-1⁺2^—, т. е. обладают специфическими рецепторами, с помощью которых осуществляют свои функции. Популяции таких Т_ГЧЗ-клеток можно лишить иммунологической компетентности, если обработать их антителами против этих рецепторов. Таким образом, можно считать окончательно установленным, что реакция ГЧЗ является одной из форм иммунного ответа, опосредуемого сенсибилизированными Т-лимфоцитами (Т_ГЧЗ) и выявляемого в виде характерного воспаления в месте введения (обычно в коже) антигена, который индуцировал ее развитие. Для проявления своей активности Т_ГЧЗ-клетки также нуждаются в представлении им антигенов с помощью молекул МНС класса I или класса II. Реакции ГЧЗ (т. е. сенсибилизацию клеток Т_ГЧЗ) могут индуцировать различные белковые антигены – агенты, вызывающие контактную аллергию, а также антигены бактерий, вирусов, грибов и простейших. Установлено, что клетки, сходные с клетками Т_ГЧЗ, имеющими фактор Lyt-1⁺, распознают антигены опухолей и играют важную роль в противоопухолевом иммунитете.

Трансплантационный иммунитет

Другие киллерные клетки

Помимо Т-цитотоксических лимфоцитов и клеток NK, способноcтью оказывать литическое действие на клетки-мишени обладают и другие эффекторные клетки. Общим их свойством является наличие у них мембранного рецептора для Fc-фрагмента антител класса IgG. К таким клеткам-эффекторам, проявляющим цитотоксическую активность по отношению к клеткам-мишеням, обработанным антителами, относятся полиморфно-ядерные лейкоциты, макрофаги, клетки эмбриональной печени, а также популяция лимфоидных клеток, которая не имеет характерных для Ви Т-лимфоцитов маркеров. Эти лимфоциты получили название «нулевых клеток». Популяция «нулевых клеток» состоит как из цитотоксических, так и нецитотоксических клеток. Нулевые клетки, обладающие цитотоксичностью лишь в присутствии антител класса IgG, получили название К-клеток (англ. killer – убийца).

Зависимый от антител К-клеточный лизис, как и цитотоксическая активность Т-лимфоцитов и NK-клеток, требует непосредственного контакта К-клетки с клеткой-мишенью. Роль антител в К-клеточном лизисе достаточно сложна: в этот процесс вовлекаются как Fc-фрагмент, так и домен, несущий активный центр. Антитела выполняют роль мостика между К-клеткой и клеткой-мишенью.

Механизм литического действия К-клеток, по-видимому, сходен с механизмом лизиса, вызываемого Т-цитотоксическими лимфоцитами и NK-клетками. Хотя популяция К-клеток фенотипически сходна с популяцией NK-клеток, функционально они существенно различаются: NK-клетки лизируют клетки-мишени в отсутствие антител, а К-клеткам для проявления литической активности необходимо присутствие антител класса IgG. Имеются данные о том, что, подобно NK-клеткам, К-клетки также играют важную роль в подавлении роста опухолевых клеток.

Иммунологическая толерантность

Идиотип-антиидиотипические отношения

Как уже отмечалось, в молекуле иммуноглобулина содержится три типа антигенных детерминантов: изотипы, аллотипы и идиотипы.

Идиотипами называют антигенные детерминанты, определяемые структурой активных центров антител, т. е. структурой вариабельных областей L– и Н-цепей. Собственно, под идиотипом понимают набор идиотопов, свойственный антителам, синтезируемым данным клоном В-клеток. В свою очередь, идиотоп – один из собственных антигенных детерминантов активного центра молекул антител, продуцируемых одним или небольшим числом близких клонов В-клеток. Идиотипические детерминанты обнаруживают и типируют с помощью антиидиотипических антител.

В 1974 г. Н. Ерне высказал идею о том, что иммунная система представляет собой сеть взаимодействующих идиотипов и антиидиотипов. Одно из положений этой теории заключается в том, что для каждого антитела с его идиотипом (АТ₁) существует комплементарное антитело, способное связываться с этим идиотипом (АТ₂), т. е. выступающее как антиидиотип. Однако такое антитело имеет также и свой идиотип, определяемый структурой его активного центра. Так как у неиммунизированных животных содержание антител и клонов клеток, их синтезирующих, по-видимому, постоянно, то, по мнению Н. Ерне, взаимодействие антител-антиидиотипов с мембранными иммуноглобулиновыми рецепторами лимфоцитов, которые имеют структуру идиотипа, будет подавлять (супрессировать) образование антител идиотипов. Иначе говоря, антиидиотипы подавляют синтез идиотипов. Наоборот, действие антител идиотипов на лимфоциты, несущие иммуноглобулиновые рецепторы типа антиидиотипов, будет стимулировать размножение этих клеток и синтез антиидиотипов. Таким образом, одним из механизмов регуляции функционирования иммунной системы (содержания антител) является механизм сетевого сбалансированного взаимодействия между идиотипами (идиотипами антител) и антиидиотипами (иммуноглобулиновыми лимфоцитарными рецепторами, активные центры которых определяют специфичность антиидиотипов). Как было установлено позднее, антитела могут возникать и против антиидиотипов (АТ₃). Они сходны с исходными идиотипами (АТ₁), а антитела против анти-антиидиотипов (АТ₄) сходны с АТ₂. В значительной степени благодаря этому взаимодействию в организме поддерживается оптимальный в данный момент уровень антител. В идиотип-антиидиотипической регуляции принимают участие и Т-лимфоциты.

Идиотипические детерминанты обнаружены в антигенсвязывающих рецепторах В– и Т-клеток. Это свидетельствует о том, что такие участки могут играть важную роль в осуществлении лимфоцитами своих функций, а иммунная система действительно представляет собой сеть вариабельных участков, поскольку идиотипические детерминанты В– и Т-лимфоцитов ассоциированы с их мембранными рецепторами. Равновесие между клонами В– и Т-лимфоцитов, основанное на идиотипических связях, играет существенную роль в физиологии иммунной системы, а его нарушение может стать причиной аутоиммунных заболеваний.

Иммунитет, как и любая другая функция организма, исполняется своим особым органом. Однако, в отличие от всех остальных, этот орган не является анатомически единой обособленной структурой, а состоит из совокупности расселенных по всему организму и свободно передвигающихся по кровеносной и лимфатической системам клеток. Эта его особенность связана с тем, что функции иммунологического надзора должны осуществляться непрерывно во всем организме, во всех его органах и тканях.

Органом иммунитета является лимфоидная ткань, а его основными исполнителями – макрофаги (а также другие антигенпредставляющие клетки), различные популяции и субпопуляции Т– и В-лимфоцитов. Возникнув из общей исходной, так называемой стволовой, клетки и пройдя соответствующую дифференцировку в центральных органах иммунной системы, Т– и В-лимфоциты приобретают иммунокомпетентность, выходят в кровь и, непрерывно циркулируя по организму, выполняют роль его эффективных защитников.

Различают центральные и периферические органы иммунной системы.

Центральные органы иммунитета

Периферические отделы иммунной системы

К ним относятся: селезенка, лимфатические узлы, лимфоидные ткани желудочно-кишечного тракта (пейеровы бляшки и солитарные фолликулы), а также кровь и лимфа, в которые поступают и непрерывно в них циркулируют все иммунокомпетентные клетки. В селезенке содержится больше всего плазматических клеток, возникающих в результате дифференцировки из В-лимфоцитов и являющихся основными продуцентами антител.

Основную роль в реализации иммунных функций играют следующие клетки: 1) макрофаги, а также другие антигенпредставляющие, или вспомогательные, или А-клетки (англ. accessory – вспомогательный); 2) популяции В-лимфоцитов; 3) популяции Т-лимфоцитов; 4) популяции лимфоцитов, обладающих естественными цитотоксическими свойствами – способностью разрушать опухолевые клетки, вирусинфицированные клетки, клетки трансплантата и т. п.: NK-клетки, Pit-клетки, нулевые клетки.

По морфологическим свойствам Т– и В-лимфоциты не отличаются друг от друга. Однако они существенным образом различаются по вкладу в реакции иммунитета, по многим другим свойствам, в том числе структуре и функции рецепторов и по антигенной специфичности (табл. 14).

Таблица 14

Характеристика Т– и В-лимфоцитов

Т-лимфоциты

Самый ответственный момент в процессе иммунного ответа – это распознавание химического маркера, свойственного «чужому» агенту и отличающегося от «своего». Эту роль выполняют макрофаги, антитела, Т– и В-лимфоциты. Антитела распознают антиген с помощью своих активных центров, а макрофаги, Т– и В-лимфоциты – благодаря имеющимся на их мембранах особым рецепторам.

Экспериментальное обоснование предположения о наличии у клеток лимфоидной системы специфических рецепторов было получено в 60-е гг. ХХ в. после обнаружения двух важных феноменов: цитопатического действия лимфоцитов и розеткообразования (иммуного прилипания).

Способность сенсибилизированных лимфоцитов распознавать трансплантационный антиген и активно прикрепляться к клеткам-мишеням послужила прямым указанием на наличие у лимфоцитов рецепторов, подобных по структурной специфичности антителам.

Феномен розеткообразования состоит в том, что если к культуре нормальных или иммунных лимфоцитов добавить какой-либо антиген, например чужеродные эритроциты, то последние, прикрепляясь к лимфоцитам, образуют структуру типа розетки. Это явление высоко специфично: удаление лимфоцитов, образовавших розетки с эритроцитами данного вида животных, лишает популяцию лимфоцитов способности образовывать розетки из этих клеток.

Этот феномен не только свидетельствует о наличии у лимфоцитов особых рецепторов, но и говорит о том, что популяция лимфоидных клеток представлена клонами лимфоцитов, различающимися по специфичности этих рецепторов.

Первоначально Т-лимфоциты по своим функциям были разделены на три субкласса:

1) Т-хелперы, или Т-помощники (англ. help – помогать);

2) Т-киллеры (англ. kill – убивать), или Т-цитотоксические лимфоциты;

3) Т-супрессоры (англ. suppress – подавлять).

Т-хелперы необходимы для превращения В-лимфоцитов в антителообразующие клетки и клетки памяти. Т-киллеры разрушают клетки трансплантата, опухолевые клетки и клетки, инфицированные вирусными, бактериальными и другими антигенами. Т-супрессоры подавляют функции определенных эффекторных Т– и В-клеток и обеспечивают иммунологическую толерантность.

Особенность Т-лимфоцитов состоит в том, что их рецепторы, в отличие от антител и рецепторов В-лимфоцитов, не распознают свободно циркулирующих антигенов. Они распознают только те чужеродные вещества, точнее их пептидные фрагменты, которые представляются им клетками организма через посредство антигенов МНС класса I или класса II. Разные Т-лимфоциты распознают разные собственные антигены (белки МНС). Т-цитотоксические лимфоциты распознают клетки, несущие антигены МНС класса I и чужеродные антигены, представляемые ими. Основное назначение Т-цитотоксических лимфоцитов – обеспечение противовирусного, противоопухолевого и трансплантационного иммунитета. Т-киллеры с помощью своих специфических рецепторов распознают чужеродные антигены, ассоциированные на мембранах клеток с их антигеном МНС класса I, они атакуют такие клетки и уничтожают их.

T-хелперы распознают клетки, имеющие антигены МНС класса II (макрофаги, B-лимфоциты и некоторые другие), и представляемые ими чужеродные антигены. Белки МНС класса II связывают чужеродный антиген в макрофагах в ходе процессинга, выносят его на поверхность мембраны макрофага, и в таком виде этот антиген представляется T-хелперам. Последние также распознают его с помощью своих рецепторов и при участии своих белков МНС класса II. В свою очередь, B-лимфоциты также представляют чужеродные антигены Т-хелперам, используя собственные белки МНС класса II.

Таким образом, T-хелперы осуществляют регуляцию иммунного ответа, стимулируя В-лимфоциты, а также другие T-клетки, специализированные к данному антигену.

В настоящее время Т-лимфоциты подразделяют на 7 основных субклассов, объединенных в следующие три группы (табл. 15).

1. Т-помощники, или активаторы: индукторы Т-хелперов, индукторы Т-супрессоров, Т-хелперы 1, Т-хелперы 2.

2. Т-эффекторы – Т-цитотоксические лимфоциты. 3. Т-регуляторы: Т-супрессоры, Т-контрсупрессоры.

Кроме того, существуют различные варианты Т-клеток иммунной памяти.

Т-лимфоциты различаются по своим рецепторам. Каждый из субклассов выполняет специфические функции. Для активации Т-клеток требуется контакт их рецептора с комплексом чужеродного антигена с собственным белком МНС класса I или класса II. Через 16 – 20 ч после установления контакта возникают индукторы Т-хелперов. Последние, реагируя на представляемый А-клеткой процессированный антиген, быстро секретируют медиаторы, которые способствуют образованию молекул МНС класса II на поверхности макрофагов и продукции ими IL-1. Индукторы Т-хелперов отличаются от эффекторных Т-хелперов тем, что они имеют особый рецептор CD29, который может быть заблокирован моноклональными антителами, не влияющими на активность Т-хелперов. Только после исполнения функции индукторов данный антиген связывается с белком МНС класса II и возникает комплекс, который узнается рецепторами Т-хелпера. В результате этого на мембране Т-хелпера образуются рецепторы к IL-1. Присоединение к нему интерлейкина-1 приводит ко второму этапу активирования Т-хелпера: он начинает синтезировать и секретировать различные варианты лимфокинов. Существуют две категории Т-хелперов: Т-хелперы 1 (T_h1) и Т-хелперы 2 (T_h2), которые имеют одинаковые рецепторы CD4 и 4В4, но различаются по другим, а именно: Т-хелперы 1 имеют рецепторы CD45 и CD44, а Т-хелперы 2 – CD28. Их функции различны: Т-хелперы 1 секретируют IL-2, IL-3, фактор некроза опухолей, γ-интерферон и другие цитокины, которые способствуют созреванию Т-цитотоксических лимфоцитов после их взаимодействия с комплексом чужеродный антиген + молекула МНС класса I. Таким образом, Т-хелперы 1 обеспечивают дифференцировку и пролиферацию эффекторных Т-киллеров, способных распознавать и уничтожать как клетки аллотрансплантата, так и свои собственные, если на их поверхности содержатся антигены вирусов, других патогенов или опухолей. Кроме того, Т-хелперы 1 активируют Т-хелперы 2 и способствуют цитотоксической функции макрофагов.

Таблица 15

Субклассы Т-лимфоцитов, их функции и специфические рецепторы

Т-хелперы 2 секретируют IL-4, IL-5, IL-6 и вводят их в цитоплазму В-лимфоцитов путем прямого контакта своих рецепторов с определенными рецепторами на мембране В-лимфоцитов. Таким образом, Т-хелперы 2 вызывают пролиферацию и дифференциацию В-лимфоцитов в антителообразующие клетки и тормозят функцию Т-хелперов 1. Т-хелперы 1 и Т-хелперы 2 различаются по чувствительности к IL-2 и IL-4; кроме того, Т-хелперы 1 устойчивы к радиоактивному облучению, а Т-хелперы 2 – чувствительны.

Активированные Т-супрессоры играют важную роль в регуляции иммунитета. Они способны непосредственно контактировать с рецепторами Т-хелпера, а также синтезировать и секретировать свои медиаторы. Благодаря этому Т-супрессоры могут подавлять функции Т-хелперов. Последние обладают высокой чувствительностью к Т-супрессорам и их медиаторам. Взаимодействуя с мембраной Т-хелпера, Т-супрессоры угнетают секрецию ими интерлейкинов, синтез рецепторов к IL-1, IL-2 и другие иммунобиологические функции Т-хелперов, в результате чего подавляется пролиферация и дифференциация эффекторных Т-клеток, а также формирование антителообразующих клеток против данного антигена. Иначе говоря, Т-супрессоры подавляют временно или постоянно образование клонов иммунокомпетентных Т– и В-клеток против определенного антигена. Особо важную роль Т-супрессоры выполняют в эмбриональном периоде и в течение первой недели жизни новорожденного: они способствуют возникновению толерантности к собственным белкам и подавляют действие проникающих в организм новорожденного Т-цитотоксических лимфоцитов матери на аллоантигены самогmо развивающегося ребенка. Функция Т-супрессоров через неделю после рождения блокируется возникающей к этому времени особой популяцией Т-клеток – Т-контрсупрессорами, которые продуцируют собственный лимфокин. Этот лимфокин взаимодействует с Т-хелперами, они приобретают резистентность к Т-супрессорам и их лимфокинам. Т-контрсупрессоры отличаются от Т-супрессоров по своим специфическим рецепторам, в частности, они содержат отсутствующий у Т-супрессоров рецептор к лектину Vicia villosa. Этот рецептор способствует выполнению функций Т-контрсупрессорами.

Т-лимфоциты распознают чужеродные антигены, предсталяемые им молекулами МНС класса I или класса II, с помощью особого Т-клеточного рецептора (ТКР). В результате взаимодействия этих структур образуется тримолекулярный комплекс: молекула МНС + антиген + ТКР (см. рис. 63, в). Биосинтез ТКР, как и антител, кодируется комплексом генов: V, D, J, C, однако они отличаются от генов Ig, это самостоятельное семейство генов. Число возможных вариантов их объединения составляет 10¹⁶, что обеспечивает большое разнообразие антигенсвязывающих центров ТКР. Все субпопуляции Т-клеток используют ТКР непосредственно для распознавания антигена.

Структура ТКР во многом напоминает структуру молекулы антитела. ТКР состоит из двух цепей – α и β (редко встречается вариант γ/δ). Каждая цепь содержит V– и С-домены, обладающие высокой степенью гомологии с V– и С-доменами Ig. За С-доменами, около мембраны, располагается шарнирная область – место образования дисульфидной связи между цепями. Каждая цепь заякорена в мембране своим гидрофобным участком. Антигенсвязывающий центр ТКР формируется тремя гипервариабельными участками каждой цепи и имеет форму щели, структура которой соответствует пространственной структуре представляемого антигена.

Каждый Т-лимфоцит несет ТКР, распознающий свой антиген только в комплексе с молекулой МНС (рис. 68А). Последняя имеет два участка связывания: гистотоп для ТКР и дезотоп – для пептида. Связь с пептидом осуществляется с помощью вариабельных аминокислотных остатков, обращенных внутрь антигенсвязывающего центра молекулы МНС.

Передача сигнала к ядру Т-клетки происходит по пути, общему для различных сигналов (факторы роста, деления, дифференцировки, антигены и др.). Трансмембранные рецепторы, воспринимающие эти сигналы, обладают (или приобретают ее, например, в случае присоединения к ТКР антигена) протеинтирозинкиназной активностью и регулируют так называемые Ras-зависимые сигнальные пути, в которых ключевую роль играет продукт протоонкогена ras – белок Ras. От него расходятся многие пути. Те трансмембранные белки-рецепторы, которые лишены протеинкиназной активности, приобретают ее, образуя после активации лигандом прочный комплекс с цитоплазматическими протеинтирозинкиназами Src-семейства. Именно через эти протеинкиназы цитокины осуществляют регуляторные функции, стимулируя Ras-зависимые и Ras-независимые сигнальные пути. Конечное звено всех сигнальных путей, регулирующих рост, деление и дифференцировку клеток, – образование фактора транскрипции и связывание его со специфическим цис-регуляторным элементом гена-мишени. Факторами транскрипции служат фосфорилированные белки – продукты протоонкогенов c-myc, c-fos, c-jun, c-myb и генов-супрессоров клетки. Цис-регуляторные элементы – это сравнительно короткие олигонуклеотиды, богатые гуанином и цитозином. Они образуют вилки («палиндромы»). Взаимодействие их с промоторами генов активирует или подавляет транскрипцию. Сигнальные белки узнают партнеров с помощьью особых некаталитических доменов SH2 (100 – 150 аминокислотных остатков) или SH3 (50 – 80 аминокислотных остатков), названных так из-за расположения рядом с каталитическим доменом Src-киназы SH1. За короткое время SH2– и SH3-домены были обнаружены не только в цитоплазматических протеинтирозинкиназах, но и во многих других сигнальных белках (липидкиназах, фосфолипазах, факторах транскрипции и т. д.). Каждый SH2-домен узнает своего партнера по определенной последовательности 3 – 5 аминокислот, расположенных сразу же после фосфотирозина, а SH3-домен – по участкам, богатым пролином. Такая специфичность взаимодействия позволяет связать звенья одного сигнального пути в единую цепь и обеспечить безошибочное проведение сигнала к месту назначения. В некоторых сигнальных белках обнаружены домены с избирательным сродством к мембранным фосфолипидам. Они названы плекстриновыми доменами (PH). Мишенью для сигнала, воспринятого ТКР и переданного в ядро, служит ген, кодирующий синтез ИЛ-2. Активация этого гена приводит к синтезу и секреции ИЛ-2, который стимулирует пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов.

Рис. 68. Взаимодействие антигенов (А) и суперантигенов (В) с Т-лимфоцитами (по: Д. Бернс-Пайзеру, 1992):

Обычные антигены (слева) вначале поглощаются какой-либо из клеток, представляющих антигены (а), подвергаются в ней процессингу (б), и их антигенный пептид представляется в комплексе с молекулой МНС класса II Т-лимфоциту, который с помощью своих молекул МНС класса II распознает его и связывается с ним (в). Обе цепи рецептора (α и β) контактируют с антигеном (в рамке). Суперантигены (справа) прямо связываются с наружной стороной молекул МНС (а и б), а затем с Т-клеточным рецептором (в), присоединяясь к вариабельной (V_β) части β-цепи (в рамке). Связывание с V_β обусловливает мощное воздействие суперантигенов на Т-лимфоциты

Существует полная взаимосвязь между фенотипом Т-лимфоцитов (CD4/CD8) и молекулами МНС, которые определяют Т-клеточный ответ: все без исключения Т-киллеры (CD8⁺) несут молекулы МНС класса I, а все Т-хелперы (CD4⁺) – молекулы МНС класса II.

Предполагается, что гены Ir, открытые Бенасеррафом в 1967 г., каким-то образом определяют силу иммунного ответа на конкретный антиген через тримолекулярный комплекс.

Особенности взаимодействия суперантигенов с Т-лимфоцитами

Суперантигены отличаются от обычных антигенов очень большой силой иммунного ответа. Предполагается, что необычная сила ответа на суперантиген обусловлена по крайней мере двумя обстоятельствами: 1) суперантиген связывается с молекулой MHC без предварительного процессинга и 2) суперантиген присоединяется к наружному участку молекулы MHC. Поэтому он и распознается не внутренней поверхностью антигенсвязывающего центра ТКР (как обычный антиген), а той частью вариабельного участка b-цепи, которая находится с наружной стороны цепи (см. рис. 68Б). Обычный антиген распознается только Т-специфическим лимфоцитом, вызывает его пролиферацию и адекватный иммунный ответ (рис. 69). Суперантиген может распознаваться и связываться разными Т-лимфоцитами, у которых β-цепь ТКР содержит определенные типы вариабельных доменов (у человека таких типов около 30). Связываясь с ними, суперантиген оказывает сильное воздействие на Т-лимфоциты. Результат этого – суперпродукция ИЛ-2, отравляющего организм и вызывающего СТШ (рис. 70). Свойствами суперантигенов обладают некоторые бактериальные экзотоксины, а также различные компоненты самой бактериальной клетки. Наличие суперантигенов у бактерий влияет на клиническую картину вызываемых ими заболеваний.

Рис. 69. Иммунный ответ на обычные антигены (по: Д. Бернс-Пайзер, 1992):

1. С данным антигеном связываются только те клетки, которые имеют специфичный к нему рецептор (≈ 0,01 % Т-хелперных лимфоцитов).

2. Связавшие антиген клетки секретируют интерлейкин-2.

3. Интерлейкин-2 вызывает пролиферацию антиген-специфических Т-лимфоцитов. Иммунная система распознает и разрушает зараженные любым патогеном клетки, не причиняя вреда нормальным клеткам

Рис. 70. Иммунный ответ на суперантигены (по: Д. Бернс-Пайзер, 1992):

1. С суперантигеном связывается около 20 % Т-лимфоцитов, несущих на своей поверхности в области V_β рецепторы для различных антигенных пептидов.

2. Связавшие суперантигены Т-лимфоциты секретируют интерлейкин-2, что приводит к аномально высокой концентрации его.

3. Т-лимфоциты размножаются, образуется огромное множество таких клеток. Следствием суперпродукции интерлейкина-2 могут быть лихорадка и другие симптомы интоксикации, а образование избыточного количества антиген-специфических Т-лимфоцитов может стать причиной аутоиммунных реакций (активация и размножение немногочисленных Т-лимфоцитов, реагирующих на «свои» антигены, приводят к атаке нормальных тканей) или привести к подавлению иммунной системы, так как Т-лимфоциты, стимулированные суперантигеном, могут после активации погибнуть

Как уже отмечено выше, B-лимфоциты помимо антигенов Ly, общих с T-лимфоцитами, имеют свойственные только им антигены Lyb. B-лимфоциты подразделяют на Lyb5⁺, т. е. имеющие этот антиген, и Lyb5^– , т. е. лишенные его. Разные антигены – ТЗ, ТН-1 и ТН-2 (см. с. 259) – активируют различные субпопуляции B-лимфоцитов. Так, ТЗ– и ТН-1-антигены активируют как Lyb5⁺, так и Lyb5^–-B-лимфоциты. В свою очередь, TH-2-антигены активируют только Lyb5⁺-В-лимфоциты. B-лим₊фоциты подразделяют на следующие _-шесть основных популяций: 1) клетки Bla (CD5 ), или просто Bla; 2) клетки Blb (CD5 ), или Blb. Клетки Bla и Blb объединяют в одну группу B-1-клеток, потому что они первыми появляются в онтогенезе; 3) клетки B-2, которые затем дифференцируются в АОК; 4) MZ-B, или B-клетки маргинальной зоны (от лат. margo – край); 5) B-супрессоры и 6) B-киллеры. Клетки Bla, Blb и MZ-B продуцируют только IgM, т. е. неспецифические иммуноглобулины. Все они осуществляют функции 1-й линии защиты организма от инфекций, т. е. опосредуют видовой иммунитет. Лимфоциты B-2 играют решающую роль в формировании специфического приобретенного, или адаптивного иммунитета. B-2 лимфоциты рециркулируют между кровью и лимфой (MZ-B-лимфоциты – не циркулирующие клетки) и в лимфатических фолликулах селезенки и лимфоузлов встречаются с антигенами, связанными с дендритными фолликулярными клетками. Дендритные клетки, как и все макрофаги, обладают способностью осуществлять процессинг и представление антигена. Здесь образуются зародышевые центры, в которых и происходит превращение B-2-лимфоцитов в антителообразующие клетки и формирование клеток иммунной памяти. B-супрессоры выполняют такие же функции, как и T-супрессоры. B-киллеры взаимодействуют с Fc-фрагментами IgG, фиксированных на клетках трансплантата, и разрушают их.

Мембраны B-лимфоцитов несут большое количество рецепторов (более 40 типов) с разнообразными свойствами. В частности, они имеют рецепторы к Fc-компоненту иммуноглобулина, к C3-компоненту комплемента. Благодаря этим рецепторам B-клетки легко выявить с помощью метода розеткообразования или методом бляшек. Суть последнего заключается в том, что если эритроциты барана использовать в качестве антигена для иммунизации животных, то в их лимфоидной ткани будут накапливаться B-лимфоциты, вырабатывающие соответствующие антитела. Добавление таких клеток в среду, содержащую эритроциты, приведет к тому, что комплексы эритроцит + антитело + комплемент будут связываться с лимфоцитом и лизироваться вблизи него, образуя пятно (бляшку). Химическая природа B-лимфоцитов рецепторов была выяснена в 1969 г. Р. Кумбсом, который установил, что они являются иммуноглобулинами.

В-лимфоциты несут на своей поверхности большое количество таких рецепторов до 150 000 на один лимфоцит. При этом все рецепторы данного лимфоцита обладают одной и той же антительной специфичностью, т. е. один лимфоцит может реагировать только с одним антигенным детерминантом. Вместе с тем установлено, что В-лимфоциты раньше всех начинают синтезировать иммуноглобулины класса IgM. Зрелые лимфоциты могут нести рецепторы, относящиеся более чем к одному классу. Например, IgM + IgD, IgM + IgG и т. п. Однако во всех случаях такие иммуноглобулины обладают только одной антительной специфичностью.

В-лимфоциты представлены громадным количеством клонов (вероятно, более чем 10⁸). Клон – совокупность генетически идентичных клеток. Клетки данного клона несут рецепторы одной и той же антительной специфичности, поэтому каждый клон отличается от других по антительной специфичности своих рецепторов. Такие клоны формируются из исходных клеток-предшественников В-лимфоцитов.

В ходе своего созревания (от эмбриональной клетки до рождения), а также после рождения В-лимфоциты подвергаются дифференцировке, биологический смысл которой состоит в создании клона клеток, синтезирующих и секретирующих антитела, специфически взаимодействующие с данным антигеном.

Процесс созревания В-лимфоцитов включает в себя две стадии:

1. Антигеннезависимую, которая протекает в эмбриональном периоде.

2. Антигензависимую, которая протекает после рождения и наступает только после встречи с соответствующим антигеном.

Антигеннезависимая стадия дифференцировки

Она начинается с раннего предшественника В-лимфоцита (ранний предшественник В-лимфоцита, в свою очередь, возникает из исходной полипотентной кроветворной клетки, он же является одновременно и предшественником Т-лимфоцитов) и заканчивается образованием зрелых В-лимфоцитов, которые несут на своей мембране иммуноглобулиновый рецептор одной антительной специфичности.

В ходе антигеннезависимой дифференцировки В-лимфоцита происходит последовательное формирование генов вначале для Н-цепи, затем для L-цепи, сборка полного гена иммуноглобулина М, образование вначале цитоплазматического IgM и, наконец, мембранных иммуноглобулиновых рецепторов IgM и IgD.

В формировании полного гена Н-цепи принимают участие следующие гены, расположенные в определенном локусе хромосомы на значительном расстоянии друг от друга: V (200 вариантов), D (20 вариантов), J (4 – 6 вариантов), С (9 вариантов). Вначале происходит выбор одного из генов J– и одного из D-сегмента, затем соединение одного из V-генов с D-J-сегментом. Образующийся при этом тандем V-D-J сближается с геном Сμ. В результате этого происходит выбор одного из множества возможных вариантов генов V, D, J, т. е. такого, который будет контролировать структуру активного центра данного антитела. Образовавшийся ген вариабельной части Н-цепи ассоциирует с геном Сμ, и возникает полный ген Н-цепи μ-типа. Его транскрипция приводит к образованию цитоплазматической Н-цепи типа Сμ. Наличие этой цепи в цитоплазме является характерным признаком пре-В-лимфоцита. Он является пролиферирующей клеткой, поэтому происходит накопление клона таких клеток, которые имеют более широкий спектр специфичности, чем зрелые В-лимфоциты. Широкая специализация зрелых В-лимфоцитов будет зависеть от ассоциации Н– и L-цепей. Следующая стадия – превращение пре-В-лимфоцита в незрелый В-лимфоцит – характеризуется сборкой гена для L-цепи, формированием полного гена иммуноглобулина IgM и синтезом мембранной (рецепторной) формы иммуноглобулина М. Для образования рецепторной формы иммуноглобулина надо, чтобы Н-цепь включила гидрофобный «якорь». Он представляет собой пептид из 41 аминокислотного остатка, контролируемый фрагментом μ-гена, отделенным интроном от его последнего экзона. Сборка гена для L-цепи происходит по такому же типу, как и генов Н-цепи. Регуляция образования полных генов Н-цепи и L-цепи осуществляется сплайсингом ядерных пре-мРНК этих генов.

Конечная стадия антигеннезависимой дифференцировки – образование зрелого В-лимфоцита. Он характеризуется наличием двух мембранных рецепторов, обладающих одной антительной специфичностью: IgM и IgD. Синтез IgD также контролируется на уровне сплайсинга, при этом происходит переключение тандема V × D × J × Cμ на V × D × J × Cδ – класспереключающая рекомбинация. Формированием рецепторного IgD завершается процесс антигеннезависимой дифференцировки предшественника В-лимфоцита в зрелый В-лимфоцит.

Зрелый В-лимфоцит имеет два рецептора (IgM и IgD) с одинаковыми активными центрами. Таким образом возникают клоны лимфоцитов, каждый из которых обладает своей антительной специфичностью и способен распознать только «свой» антиген. Зрелый В-лимфоцит – покоящаяся клетка, т. е. он находится в фазе цикла G₀. Однако он способен к дальнейшей пролиферации, дифференцировке и превращению в антителообразующую клетку и в клетку памяти. Все стадии антигеннезависимой дифференцировки В-лимфоцита происходят в тесном контакте с клетками окружающих тканей. Созревание В-лимфоцитов в эмбриональном периоде происходит в печени. После рождения исходные стволовые клетки перемещаются в костный мозг, здесь и происходит дальнейшее образование зрелых В-лимфоцитов с высокой скоростью – 10⁸ клеток в сутки.

Зрелые В-лимфоциты покидают костный мозг и заселяют селезенку, лимфатические узлы и другие скопления лимфатических клеток, где их дифференцировка «замораживается» до встречи с соответствующим антигеном, т. е. они уже полностью созрели для реализации своих функций, для этого им нужна только встреча с антигеном.

Антигензависимая дифференцировка В-клеток

Превращение зрелых В-лимфоцитов в антителообразующие клетки и клетки иммунной памяти происходит после встречи лимфоцита с антигеном. Антигензависимая дифференцировка складывается из трех основных событий: 1) активация В-клеток, 2) их пролиферация, 3) дифференцировка.

Биологический смысл активации В-лимфоцитов заключается в том, что они, вопервых, переходят из покоящегося состояния в начальную стадию клеточного цикла G₁, и, во-вторых, в том, что в результате активации они приобретают способность вступать во взаимодействие с другими клетками (Т-лимфоцитами) и воспринимать те сигналы, которые они им передают.

Для само́й активации необходимы по крайней мере два сигнала: превый – для перевода клетки из фазы покоя (G₀) в G₁-фазу клеточного цикла, а второй – для вступления ее в S-фазу. Роль первого сигнала выполняют различные антигены или митогены. Он воспринимается Ig-рецептором. В качестве второго сигнала выступают различные лимфокины, в том числе интерлейкины-1, -2, -4, -6. В результате их воздействия происходит активация генома клетки, что и обусловливает пролиферацию и дифференциацию В-лимфоцитов в антителообразующие клетки (АОК). Механизм передачи сигнала от Ig-рецептора геному В-клетки во многом совпадает с таковым у Т-лимфоцитов.

Активация В-клеток может осуществляться разными путями, что зависит как от участия в ней других клеток (макрофагов, Т-хелперов), так и от свойств самих антигенов. Их природа может определять интенсивность и длительность сигнала, подаваемого в клетку рецептором В-лимфоцита. Если он недостаточен, требуется помощь Т-хелперов. Например, бактериальные полисахариды могут прямо активировать В-клетки и индуцировать выдачу сильного ответа. Такие антигены получили название Т-независимых. Напротив, вирусные и растворимые антигены вызывают слабый ответ В-лимфоцитов, и для их активации требуется помощь Т-хелперов. Такие антигены называют Т-зависимыми (ТЗ). Комплекс антигена с антителом является более слабым активатором В-лимфоцитов, чем сам антиген. Поэтому, когда антитела нейтрализуют большинство молекул антигена, происходит постепенное торможение образования антител. Т-независимые антигены, в свою очередь, делят на два типа: Т-независимые антигены 1 (ТН-1) и Т-независимые антигены 2 (ТН-2). Различие между ними состоит в том, что ТН1-антигены вызывают иммунный ответ как Lyb5⁺-В-лимфоцитов, так и Lyb5^–, в то время как ТН2-антигены способны индуцировать иммунный ответ только Lyb5⁺-В-лимфоцитов при участии макрофагов.

Известны следующие пути активации В-лимфоцитов:

1) Т-зависимым антигеном с помощью белков МНС класса II;

2) Т-независимым (т. е. без участия Т-лимфоцита) антигеном, который в своем составе имеет митогенный компонент;

3) Т-независимым антигеном, не содержащим митогенного компонента;

4) поликлональным активатором (липополисахаридом);

5) антииммуноглобулинами μ.

Основным выступает механизм активации с помощью Т-лимфоцитов.

Процесс антигензависимой дифференцировки В-лимфоцитов находится под контролем интерлейкинов. Все они полифункциональны и их действие не ограничивается только регуляцией иммунного ответа. Сам процесс антигензависимой дифференцировки протекает так: В-лимфоцит с помощью иммуноглобулиновых рецепторов распознает и связывает антиген. Это стимулирует его переход из покоящегося состояния (G₀) в фазу G₁. В-клетка увеличивается, на ее мембране образуются новые рецепторы: один – к фактору роста, другой – к фактору дифференцировки, третий – к фактору, замещающему Т-клетки.

В-лимфоциты в ряде случаев под действием антигена могут дифференцироваться в АОК без пролиферации, а под воздействием особого фактора созревания В-клеток. Одновременно с В-лимфоцитом антиген по представлению макрофага распознается Т-лимфоцитом-хелпером, который также активизируется и начинает синтезировать и секретировать факторы роста и дифференцировки. Последние взаимодействуют с рецепторами В-клетки и переводят ее в следующую стадию клеточного цикла (S-фазу) и в фазу дифференцировки. Факторы пролиферации нужны в течение первого и всех последующих циклов деления В-лимфоцитов, а факторы дифференцировки, очевидно, только на последних этапах ее.

Активированная В-клетка претерпевает 8 – 10 делений и одновременно дифференцируется в антителообразующую клетку (плазмоцит). В процессе дифференцировки ядро В-лимфоцита уплотняется, а объем цитоплазмы увеличивается. В ней развивается сеть мембран эндоплазматического ретикулума, и образуется большое количество связанных с мембранами рибосом. Такая клетка синтезирует и секретирует антитела одной антительной специфичности. 90 – 96 % всего производимого ею белка представляет антитело с одинаковым активным центром против антигена, который вызвал антигензависимую дифференцировку данного В-лимфоцита. Так возникает клон антителообразующих клеток.

Такой путь активации и дифференцировки проходит популяция В-лимфоцитов, имеющих антиген Lyb5, т. е. примерно 50 % всей популяции В-клеток. Клетки, лишенные Lyb5-антигена (Lyb5^–), нуждаются для активации в прямом контакте с активированными Т-хелперами, которые выделяют в этом случае антигенспецифический фактор дифференцировки. Такие В-лимфоциты тоже превращаются в антителообразующие клетки.

Антигены, вызывающие агрегацию иммуноглобулиновых рецепторов на мембране В-лимфоцитов, например липополисахарид, полианионы, антитела к μ-цепи; и антигены, несущие повторяющиеся детерминанты в своей молекуле, способны активировать В-клетки без участия Т-лимфоцитов, но эти механизмы играют незначительную роль в иммунном ответе.

Происхождение и дифференцировка клеток иммунной системы

Не все индуцированные антигеном В-лимфоциты подвергаются дифференцировке до конца. Часть из них после нескольких циклов деления перестает размножаться и образует субклон клеток памяти (из одной В-клетки образуется около 1000 клеток памяти, таким же образом образуются клетки памяти и из Т-лимфоцитов). Клетки памяти определяют продолжительность приобретенного иммунитета. При повторном контакте с данным антигеном они быстро превращаются в клетки-эффекторы. При этом В-клетки памяти обеспечивают синтез антител в более короткие сроки, в большем количестве и с более высоким сродством антител другого класса иммуноглобулинов – IgG вместо IgM. Эта перестройка происходит благодаря рекомбинации генов Н-цепи: тандем генов V × D × J переносится с Сμ-гена к одному из СН-генов – γ, α, ε. Ее вызывает сигнал, получаемый СD40-рецептором В-клеток памяти, когда они выходят из зародышевого центра в пул памяти, от gp39-рецептора Т-хелперов. Установлено, что мутации в гене, кодирующем gp39, являются причиной редкого тяжелого первичного иммунодефицита – гипер-IgM-синдрома. Отсутствие у Т-хелперов молекул gp39 в этих случаях приводит к утрате ими способности связываться с CD40, что ведет к неправильному ответу на Т-зависимый антиген – гиперпродукции IgM.

В ходе антигензависимой дифференцировки В-лимфоцитов используется и механизм соматических мутаций в V-генах. Они происходят с частотой в 10 000 раз большей частоты спонтанных мутаций и ограничиваются определенной стадией дифференцировки, а именно – периодом перехода от продукции IgM к продукции IgG. Благодаря этим мутациям обеспечивается максимальная подгонка структуры активного центра антитела к детерминанту антигена.

Таким образом, наиболее важными событиями дифференцировки В-лимфоцитов являются: 1) сборка гена иммуноглобулина из его фрагментов, содержащихся в ДНК эмбриональных клеток; 2) формирование пула клеток памяти; 3) возникновение новых вариантов генов Ig в результате дополнительных класс-переключающих рекомбинаций; 4) вспышка соматических мутаций на строго определенной стадии дифференцировки. В результате этих событий происходит образование множества генетически стабильных клонов антителообразующих клеток (вероятно, не менее чем 10⁸). Общая схема происхождения и дифференцировки Т– и В-лимфоцитов и макрофагов из исходных стволовых клеток представлена на рис. 71.

В соответствии с этой схемой, исходная костно-мозговая клетка (HSC) генерирует два типа предшественников: лимфоидную стволовую клетку (LSC), от которой происходят клетки-предшественники Т-лимфоцитов (PTC), клетки-предшественники В-лимфоцитов (PBC); и клетку, являющуюся предшественником клеток красной крови, от которой, в свою очередь, происходит предшественник лейкоцитов (CFUc) и берет начало система мононуклеарных макрофагов. Предшественники Т-лимфоцитов под влиянием тимуса превращаются в Т-лимфоциты и их субклассы. Пути дифференцировки В-лимфоцитов описаны выше.

В целом система В-лимфоцитов обеспечивает синтез антител, отвечает за иммунитет против большинства бактериальных и вирусных инфекций, анафилаксию и другие реакции гиперчувствительности немедленного типа, некоторые аутоиммунные болезни, за формирование клеток иммунной памяти и иммунологическую толерантность.

Система T-лимфоцитов играет регуляторную роль по отношению к B-лимфоцитам, отвечает за все реакции гиперчувствительности замедленного типа, иммунитет против вирусных и некоторых бактериальных инфекций (туберкулез, бруцеллез, туляремия и др.), осуществляет иммунологический надзор, отвечает за противоопухолевый иммунитет, иммунологическую толерантность, некоторые виды иммунопатологии.

Рис. 71. Схема происхождения и дифференцировки клеток-эффекторов иммунной системы (ВОЗ, 1978).

HSC – костно-мозговая стволовая кроветворная клетка; LSC – лимфоидная стволовая клетка; PTC – предшественник Т-клеток; PBC – предшественник В-клеток; T_E – Т-эффекторы; T_H – Т-хелперы; T_S – Т-супрессоры; CFU_c – кроветворный предшественник макрофагов; PC – плазматическая клетка; EC – эпителиальная клетка; THF – тимусный гуморальный фактор

Вместе с тем T– и B-клетки являются двумя частями единой иммунной системы организма. Поэтому деление иммунитета на гуморальный и клеточный носит весьма условный характер, так как антитела синтезируются В-клетками, а Т-лимфоциты и другие клетки осуществляют свою иммунокомпетентность через синтезируемые ими гуморальные факторы (цитокины, лимфокины, интерлейкины и др.).

Координированное взаимодействие макрофагов, Т– и В-лимфоцитов при встрече с антигеном обеспечивает выдачу адекватного иммунного ответа.

В связи с тем что иммунная система играет важнейшую роль в обеспечении структурной и функциональной целостности организма, ее собственное состояние в каждый данный момент, т. е. иммунологический статус организма, представляет исключительный интерес для клинической медицины. Способности к выздоровлению от многих, особенно инфекционных, болезней являются функцией иммунного статуса организма. Любые нарушения иммунной системы, несомненно, делают организм более восприимчивым к возбудителям инфекционных болезней, в том числе к условно– и слабопатогенным; увеличивают вероятность возникновения опухолей, аутоиммунных и других патологических процессов. В свою очередь, нарушение самmой иммунной системы, ее дефициты могут быть обусловлены расстройствами на самых разных ее уровнях и в различных ее подсистемах. Обнаружение уязвимого звена иммунной системы в этом случае становится решающим моментом для поиска путей коррекции иммунодефицитов. Все это диктует необходимость разработки методов оценки общего состояния иммунной системы и критериев, с помощью которых можно было бы проверить, как функционируют отдельные ее звенья, и обнаружить пострадавшие. Под иммунным статусом организма следует понимать эффективность и согласованность работы каждой из систем иммунитета, т. е. систем макрофагов, комплемента, интерферонов, В– и Т-лимфоцитов, киллерных клеток, главной системы гистосовместимости, клеток иммунной памяти, антителопродуцирующих клеток и центральных органов иммунитета. Для оценки общего иммунного статуса необходимо отобрать наиболее простые, но вместе с тем и наиболее достоверные показатели, которые позволяли бы судить одновременно о суммарной эффективности работы всех систем иммунитета в целом. Для выявления же уязвимого звена иммунной системы требуются наборы более тонких дифференциальных показателей, специфичных для каждой данной системы. Следовательно, изучение иммунного статуса организма целесообразно проводить не менее чем в два приема: вначале выявить общее ее состояние, а затем определить, какое звено иммунной системы функционирует слабо или не работает совсем.

По мнению Ю. И. Зимина, Е. В. Васильевой и В. В. Сура (1988), для оценки общего состояния иммунной системы можно использовать определение числа Ти В-лимфоцитов в крови; их митогенного ответа на один или несколько поликлональных митогенов растительного происхождения – фитогемагглютинин (ФГА), конканавалин А (Кон А) и экстракт лаконоса (PWM); продукцию фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов (ФИМ); а также уровень иммуноглобулинов IgA, IgM и IgG в крови (табл. 16).

Таблица 16

Общая оценка иммунного статуса

В случае отклонений, выявленных на этом уровне исследований, или при наличии других симптомов иммунологической недостаточности эти же авторы рекомендуют производить дополнительные иммунологические исследования с целью выявления эффективности функционирования отдельных звеньев системы иммунитета, в частности определение фенотипа лимфоцитов, количества Т-супрессоров, Т-хелперов, киллерных клеток, реактивности на антиген, содержание компонентов комплемента, IgE, IgD, секреторных IgA, свободных κ– и λ-цепей иммуноглобулинов и т. п. Большой интерес представляет предложение А. Н. Чередеева и Л. В. Ковальчук (1997) использовать для оценки иммунного статуса организма тесты по патогенетическому принципу, т. е. оценивать с помощью набора специальных маркеров состояние иммунокомпетентных клеток по их способности осуществлять свои главные функции. Этих функций пять: 1) распознавание, 2) активация, 3) пролиферация, 4) дифференциация и 5) регуляция.

Возрастные особености иммунитета

Особенности иммунитета у детей. Во время внутриутробного развития у плода формируются центральные органы иммунитета, возникают различные иммунокомпетентные клетки, системы интерферонов, комплемента, макрофагов, главная система гистосовместимости, которые и обеспечивают как в процессе эмбриогенеза, так и в постнатальном периоде иммунную защиту организма.

Развивающийся плод содержит аллоантигены, но они не отторгаются во время беременности потому, что иммунная система матери проявляет к его антигенам толерантность. Она зависит от того, что, во-первых, клетки трофобласта плаценты содержат мало антигенов гистосовместимости. Во-вторых, плацента, в силу ее морфологических и функциональных особенностей, обладает способностью избирательно пропускать вещества из крови матери к плоду и в обратном направлении (плацентарный барьер).

В-третьих, женский организм, плацента и плод синтезируют ряд белковых (α-фетопротеин, уромодулин и др.) и небелковых факторов (эстрогены, прогестерон, простагландины Е1 и Е2), которые подавляют реакции отторжения. Но особенно важную роль в сохранении плода играют Т-лимфоциты, появляющиеся у него на 12-й неделе жизни. В частности, Т-супрессоры обеспечивают формирование иммунологической толерантности к собственным белкам плода, а также подавляют действие проникающих в него Т-цитотоксических лимфоцитов матери на аллоантигены самогmо развивающегося плода. Супрессорная активность иммунной системы ребенка в отношении лимфоцитов матери сохраняется на протяжении первого года жизни, но она регулируется после 1-й недели с помощью особой субпопуляции лимфоцитов – Т-контрсупрессоров.

Примерно на 7 – 8-й неделе развития плода у него в крови появляется система комплемента. В течение эмбрионального периода происходит также созревание В-лимфоцитов. В результате антигеннезависимой стадии дифференцировки, протекающей в печени плода, из клеток-предшественников В-лимфоцитов возникает большое количество различных клонов зрелых В-лимфоцитов. Клетки каждого клона несут на своих мембранах IgM и IgD, обладающие только одной антительной специфичностью. Именно в процессе образования зрелого В-лимфоцита происходит формирование генов иммуноглобулина путем выбора соответствующих V-, J-, D– и С-генов, которые и определяют антительную специфичность каждого клона В-лимфоцитов. Зрелые В-лимфоциты появляются у плода между 8-й и 10-й неделями его развития. В случае контакта плода с антигенами в его крови появляются антитела класса IgM. Содержание же антител IgG у плода к 17-й неделе развития составляет около 0,1 г/л. В самые последние недели беременности у плода содержание IgG существенно возрастает, но не за счет синтеза плодом, а вследствие активного транспорта антител IgG от матери через плаценту. Эти антитела, наряду с антителами, передаваемыми через молозиво и грудное молоко матери, и формируют пассивный иммунитет, защищающий ребенка в первые 3 – 6 мес. от различных инфекционных заболеваний.

Реакции клеточного иммунитета против некоторых возбудителей обеспечиваются путем передачи плоду трансфер-фактора от матери через плаценту. Иммуноглобулины других классов через плаценту не проходят. Секреторные IgA появляются у плода в ограниченном количестве к 3 – 4-му мес. его жизни.

Здоровый ребенок рождается, имея сформировавшиеся центральные органы иммунитета и различные иммунокомпетентные клетки, но его иммунные системы функционируют в первые месяцы жизни недостаточно активно.

У новорожденных в крови содержание компонентов системы комплемента С1, С2, С3, С4 примерно в 2 раза ниже, чем у взрослых, ослаблены процессы активации системы комплемента, особенно по альтернативному пути. Все это определяет низкую опсоническую активность крови у них. Продукция интерлейкинов и интерферонов у новорожденных также ниже, чем у взрослых. Вследствие этого противовирусный иммунитет у них ослаблен. Новорожденные и дети первых месяцев жизни особенно восприимчивы к респираторно-синцитиальному вирусу и вирусу энцефаломиокардита. Фагоцитоз у новорожденных часто оказывается незавершенным, слабее проявляются миграция и хемотаксис фагоцитов, понижена продукция фактора, тормозящего миграцию макрофагов. У новорожденных детей реакция бласттрансформации проявляется слабо, низка активность Т-цитотоксических лимфоцитов и NK-клеток. Кожные пробы при постановке ГЧЗ отрицательны.

В период жизни между 2-м и 6-м месяцами у ребенка собственный синтез IgG протекает слабо. Первичный иммунный ответ проявляется синтезом антител класса IgM. К концу первого года жизни содержание IgG составляет примерно 50 – 60 %, а IgA – лишь около 30 % содержания этих антител соответственно у взрослых. Секреторные иммуноглобулины класса IgA появляются в секретах после 3-го мес. жизни. В течение первых четырех лет их концентрация в некоторых секретах в 4 – 5 раз ниже, чем у взрослых, поэтому местный иммунитет в это время понижен. Из-за недостатка секреторных IgA в кишечнике дети часто страдают пищевой аллергией.

Лимфоидные органы ребенка раннего возраста отвечают на патогены выраженной гиперплазией, сохраняющейся долгое время после инфекции. Лимфаденопатия наблюдается при любом воспалительном процессе, а в лимфатических узлах возбудители могут сохраняться долгое время.

В процессе развития ребенка наблюдаются определенные критические периоды, когда на антигенное воздействие иммунная система дает неадекватный или даже парадоксальный ответ. Он может быть очень слабым, недостаточным для защиты, или, наоборот, чрезмерным, гиперергическим (аллергическим).

Первый из этих периодов наблюдается у новорожденных (в первые 29 дней жизни). Он проявляется в том, что на 5 – 7-е сут. происходит первое изменение лейкоцитарной формулы крови: нейтрофилез сменяется относительным и абсолютным лимфоцитозом. Гуморальный иммунитет обеспечивается в основном материнскими антителами. Фагоцитоз имеет незавершенный характер, хемотаксис и миграция фагоцитов ограничены, отмечается низкая активность системы комплемента и слабая опсонизация микробов. Из-за низкой активности иммунной системы ребенок очень восприимчив не только к патогенным, но и ко многим условно-патогенным возбудителям и некоторым вирусам. Именно в этот период у детей часто происходит генерализация гнойно-воспалительных заболеваний, сопровождающаяся септическим состоянием.

Второй критический период приходится на 3 – 6-й месяцы жизни. Он характеризуется ослаблением пассивного гуморального иммунитета в связи с исчезновением материнских антител. Сохраняется выраженный лимфоцитоз в крови. На проникновение большинства антигенов наблюдается первичный иммунный ответ с преобладающим синтезом антител IgM, клетки иммунной памяти не образуются. Такой тип иммунного ответа наблюдается и при вакцинации против столбняка, дифтерии, коклюша, кори, полиомиелита. Лишь после 2 – 3 повторных введений антигена происходит вторичный иммунный ответ с преобладающим синтезом IgG и появлением клеток иммунной памяти. У детей по-прежнему высокая чувствительность к респираторно-синцитиальному вирусу, аденовирусам, вирусам парагриппа, сохраняется недостаточность местного иммунитета (повторные острые респираторные вирусные инфекции). В этот период выявляются наследственные иммунодефициты.

Третий критический период – второй год жизни, когда контакты ребенка с внешним миром расширяются. В это время происходит переключение синтеза антител с класса IgM на класс IgG, вначале появляются антитела IgG1 и IgG3, позднее – IgG2 и IgG4. Однако сохраняется слабая активность местного иммунитета. Дети по-прежнему восприимчивы к вирусным заболеваниям. Они особенно склонны к повторным вирусным и бактериальным заболеваниям дыхательного тракта. Нередко проявляются незначительные аномалии иммунной системы, иммунопатологические диатезы, иммунокомплексные болезни.

Четвертый критический период падает на 4 – 6-й годы жизни. В этот период происходит второй перекрест в содержании форменных элементов крови. Концентрация антител IgG и IgM достигает величин этих показателей у взрослых, но уровень IgA в крови остается еще низким, повышается содержание IgE. Системы местного иммунитета еще не достигают окончательного развития. В этот период выявляются поздние иммунодефициты, наблюдаются различные хронические заболевания.

Пятый критический период приходится на подростковый возраст: у мальчиков – с 14 – 15 лет, у девочек – с 12 – 13 лет. В результате секреции половых гормонов (андрогенов) происходит подавление клеточного и стимуляция гуморального иммунитета. Снижается содержание в крови IgE. Наблюдается новый подъем частоты аутоиммунных, воспалительных и лимфопролиферативных заболеваний.

В указанные критические периоды формирования иммунной системы особенно часто выявляются наследственные изменения силы иммунного ответа, а также иммунопатологические состояния. Особенно тяжелые состояния у детей выявляются при таких иммунодефицитах, как агаммаглобулинемия, недоразвитие вилочковой железы, но они наблюдаются относительно редко.

Особенности иммунитета в пожилом и старческом возрасте. По мере старения организма главная функция иммунной системы – обеспечение генетического гомеостаза – постепенно ослабевает.

Распознавание чужеродных и аутоантигенов становится менее точным, эффективность иммунных реакций снижается. Все это приводит к появлению характерных для этого периода иммунопатологических синдромов: иммунного дефицита, усиления аутоиммунности, повышения уровня ЦИК, более частого возникновения доброкачественных моноклональных гаммапатий (гипериммуноглобулинемий). Следствием иммунного дефицита является снижение эффекта от иммунизации, падение титров антител в крови ниже защитного уровня, ослабление клеточных иммунных реакций и т. п.

Хотя при старении нарушаются функции различных звеньев иммунной системы, более всего страдает система Т-лимфоцитов. Это проявляется в снижении общего числа зрелых Т-лимфоцитов в крови, в ослаблении их иммунного ответа на поликлональные митогены (фитогемагглютинин, конканавалин А). Снижается клеточный и гуморальный ответ на Т-зависимые антигены, уменьшается количество Т-хелперов, выработка интерлейкина-2, антител классов IgG и IgA; понижается фагоцитарная активность макрофагов и нейтрофилов, страдают и другие функции. В значительной степени эти изменения в иммунитете при старении обусловлены возрастной инволюцией тимуса, в результате которой уменьшается выработка тимических гормонов, а следовательно, и созревание Т-лимфоцитов. Важнейшим следствием изменения функций иммунной системы в этом периоде является повышение чувствительности к инфекциям. Они протекают более тяжело, нередко принимают затяжное течение с переходом в хронические формы. В этом возрасте чаще наблюдаются внутрибольничные заражения, в том числе условно-патогенной микрофлорой. Нередко возникают осложнения в виде пневмоний, циститов, пиелоциститов и т. п. Снижение иммунитета благоприятствует развитию опухолевых заболеваний.

Профилактика нарушений иммунитета в этом возрасте заключается в коррекции питания, углеводного, жирового обмена и в проведении общеукрепляющих мероприятий. Применение иммуномодуляторов должно проводиться в каждом случае с учетом иммунного статуса.

Генетическая регуляция механизмов естественного иммунитета (резистентности) и инфекционного процесса

Один и тот же возбудитель вызывает инфекционный процесс различной тяжести у разных индивидуумов – от легкой (иногда латентной) формы болезни до тяжело протекающего заболевания. Это зависит не только от степени вирулентности возбудителя и его заражающей дозы, но и, в значительной мере, от возраста и интенсивности защитных реакций организма. Как известно, на один и тот же антиген у разных людей иммунный ответ может проявляться по сильному или слабому типу, что зависит от функции Ir-генов. Точно так же, по-видимому, защитные механизмы естественного иммунитета в отношении одного и того же возбудителя у разных людей проявляются по сильному или слабому типу, что также зависит от функции определенных генов.

Все процессы жизнедеятельности в конечном счете регулируются генетической системой, которая, воспринимая поступающие в клетки органов химические сигналы, отвечает на них изменением работы соответствующих генов, контролирующих эти процессы.

В настоящее время можно считать установленным, что развитие инфекционного процесса контролируется на всех его стадиях двумя категориями генов. Одна их них – система Ir-генов – определяет интенсивность гуморального и (или) клеточно-опосредованного иммунного ответа к данному возбудителю. Другая – контролирует степень естественного иммунитета (резистентности) к возбудителю.

Так, изучение механизмов развития инфекционного процесса у мышей, обусловленного Salmonella typhimurium, позволило идентифицировать ряд генов резистентности, в том числе Ity, Lps, xid и др.

Ген Ity (англ. immunity to typhimurium) регулирует способность организма животного подавлять размножение S. typhimurium в клетках СМФ (РЭС). Этот ген представлен двумя аллелями; доминантным является аллель резистентности Ity^r (англ. resistant), рецессивным – Ity^s (англ. susceptible).

Локус Ity оказался аналогичным гену Lsh, контролирующему размножение Leishmania donovani в клетках СМФ, и гену BCG, который контролирует размножение Mycobacterium bovis (BCG) во внутренних органах мыши. Следовательно, единый ген Ity/Lsh/BCG оказался универсальным геном, определяющим естественный иммунитет животного к разным видам микроорганизмов.

Ген Lps контролирует устойчивость животного к действию эндотоксина (ЛПС). Дефект этого гена приводит к снижению активности макрофагов у мышей. Макрофаги теряют способность активироваться не только ЛПС, но и таким сильным активатором этих клеток, как BCG. У них снижается продукция монокинов и других медиаторов. Вместе с тем у мышей обнаружен еще один локус, отличный от Lps, который также определяет чувствительность мышей к S. typhimurium. Все указанные гены проявляют свое действие в первой, начальной стадии инфекции S. typhimurium. Их эффект связан с активацией ранних механизмов иммунной защиты. В период же формирования иммунитета против возбудителя начинают действовать другие гены.

Ген xid связан с Х-хромосомой, дефектный аллель xid-гена определяет недостаточность гуморального иммунитета (англ. X-linked immunodeficiency).

У мышей с таким показателем нарушается дифференцировка клеток Lyb5^– в Lyb5⁺, в результате чего резко понижается образование антител IgM и IgG, необходимых для обеспечения гуморального иммунитета на поздней стадии инфекции. Однако нарушения функции Т-лимфоцитов и макрофагов не отмечено.

Ген nu влияет на активность Т-лимфоцитов на поздней стадии инфекции и, возможно, на переход болезни из острой формы в хроническую. Однако функции nu-гена, как и генов главной системы гистосовместимости мышей (H-2 генов), оказывающих влияние на течение инфекционного процесса, изучены слабо.

Ген поздней чувствительности мышей к сальмонеллезной инфекции определяет чувствительность их на поздней стадии инфекции: мыши погибают при внутрибрюшинном заражении на 4 – 5-й неделе заболевания, поэтому был обозначен как ген i/p (англ. intraperitoneally). Однако мыши погибают и при других способах заражения, поэтому ген получил новое обозначение Ity-2. Его хромосомная локализация пока не определена, а рецессивный характер наследования признака чувствительности не сцеплен с Х-хромосомой. Возможно, этот ген аналогичен Ir-гену.

При инфекционных процессах нередко наблюдается супрессия иммунного ответа хозяина на возбудителя. Она обусловлена активацией различных типов супрессорных клеток, в том числе Т-супрессоров и макрофагов. В результате иммуносупрессии снижается пролиферация Т– и В-лимфоцитов, синтез ИЛ-1, ИЛ-2, простагландинов, страдает функция представления антигенов иммунокомпетентным клеткам и т. п.

Индукция супрессии на антигены подавляется клетками Т-контрсупрессорами. Выраженность супрессии иммунного ответа, возможно, связана с генами Ity и Lps.

Изучение системы генов восприимчивости мышей к S. typhimurium показало, что эти гены контролируют все иммунологические реакции животного против возбудителя. Защита от возбудителя в месте его проникновения через слизистые оболочки, кроме секреторных IgA, контролируется геном Lps, подавление его размножения в системе мононуклеарных фагоцитов в ранней стадии – геном Ity. На поздних стадиях инфекции важную роль в механизмах защиты играют гены xid, nu, Ity-2 и другие категории генов, контролирующих иммунологические реакции организма.

Вряд ли можно сомневаться в том, что аналогичные гены, определяющие предрасположенность к различным заболеваниям или контролирующие их развитие по сильному или слабому типу, имеются и у человека. В частности, давно установлено, что у людей с разной системой изоантигенов эритроцитов существует неодинаковая генетическая предрасположенность к тем или иным инфекционным заболеваниям. Например, лица с группой крови А более устойчивы к брюшному тифу, но у них чаще формируется хроническое бактерионосительство S. typhi. У лиц, имеющих группу крови 0, такое бактерионосительство наблюдается наиболее редко. Тяжелые гнойно-септические заболевания, в том числе стафилококковой природы, чаще бывают у лиц, имеющих группу крови А и АВ, и реже у людей с группой крови 0 и В.

Установлена также определенная генетическая предрасположенность к тем или иным заболеваниям у людей с определенным фенотипом главной системы гистосовместимости (HLA). Например, опасность заболеть анкилозирующим спондилитом у лиц с фенотипом HLA-B27 составляет 90 %. Люди с этим фенотипом чаще болеют инфекционным иерсиниозным артритом и болезнью Рейтера. Лица с фенотипами HLA-A2, HLA-B5, HLA-B12 значительно чаще по сравнению с другими людьми болеют ревматизмом, гломерулонефритом и рожистым воспалением. Лица с фенотипом HLA-Bw15 в 6 раз, а с фенотипом HLA-B12 в 3 раза более подвержены опасности заболеть менингококковыми инфекциями, чем лица с фенотипом HLA-A1.

Механизмы, определяющие такую зависимость между предрасположенностью людей к различным заболеваниям, генами главной системы гистосовместимости и антигенами эритроцитов крови, сейчас интенсивно изучаются.

В свете этих новых данных открываются и новые пути фенотипической коррекции генетического контроля иммунного статуса организма.

Под болезнями иммунной системы понимают такие ее нарушения, которые препятствуют распознаванию и уничтожению всего чужеродного, что возникает в организме (мутантные клетки) или проникает в него (бактерии, вирусы и другие чужеродные антигены). Иммунодефицитные заболевания характеризуются снижением или полным отсутствием иммунного ответа в результате нарушения какого-то звена (звеньев) иммунной системы:

1. Дефицит функции тимуса.

2. Дефицит В-клеток. Дефекты стволовых костно-мозговых клеток. Дефицит антител.

3. Нарушение функции Т-клеток. Дефицит Т-клеток.

4. Одновременный дефицит Т– и В-клеток.

5. Дефицит макрофагов и других А-клеток.

6. Дефицит системы комплемента.

7. Дефицит системы интерферонов.

8. Те или иные аллельные факторы главной системы гистосовместимости.

9. Дефицит системы интерлейкинов.

Различают первичные и вторичные иммунодефицитные заболевания. Первичные иммунодефициты возникают в результате генетических нарушений, наступающих в стволовых клетках костного мозга или в системах Т– или В-лимфоцитов, или в обеих этих системах, или в других лимфоидных клетках (гранулоцитах), т. е. они являются генетически детерминированными болезнями иммунной системы. Вторичные иммунодефициты обусловлены поражением первоначально нормальной иммунной системы.

Первичные иммунодефициты

Вторичные (приобретенные) иммунодефициты

Возникают на фоне изначально нормальной иммунной системы как следствие недостаточности питания, развития злокачественных опухолей, инфекционных заболеваний, воздействия ионизирующей радиации, цитотоксических препаратов, суперантигенов, аутоиммунных заболеваний и других патологических состояний, например серповидно-клеточной анемии, уремии и т. п.

Вторичные иммунодефициты, в отличие от первичных, проходят при излечении основного заболевания. Отмечено, что у больных с иммунодефицитами относительно часто обнаруживают аутоантитела и аутоиммунные болезни.

К наиболее тяжелым формам вторичного иммунодефицита относятся ВИЧинфекция, злокачественные процессы (рак). При всех формах первичной иммунологической недостаточности у человека повышена частота злокачественных процессов, которые обычно захватывают клетки лимфоретикулярной системы. Опухоли иммунной системы подразделяют на В-клеточные злокачественные новообразования (лимфосаркома, хронический лимфолейкоз), Т-клеточные новообразования (грибовидный микоз, острые формы лимфолейкоза); заболевания, которые протекают с усиленной пролиферацией «нулевых» лимфоцитов. Возникнув как следствие какого-то дефекта иммунной системы, злокачественные опухоли сами становятся причиной развития вторичного тяжелого иммунодефицита. Поэтому проблема рака – это во многом проблема иммунодефицита, первичного и приобретенного.

Аутоиммунные болезни

В ряде случаев организм иммунологически реагирует на некоторые собственные антигены (аутоантигены), к которым появляются аутоантитела. Если взаимодействия между аутоантигенами и аутоантителами приводят к повреждению тканей, их определяют как реакции повышенной чувствительности. Если же эти повреждения приводят к выраженным клиническим проявлениям, такие болезни относят к категории аутоиммунных. Аутоиммунные реакции могут быть опосредованы, как и другие реакции иммунитета, антителами или Т-клетками. Аутоиммунная болезнь – это патология, при которой аутоантитела или сенсибилизированные лимфоциты атакуют собственные ткани организма.

Аутоантигены возникают в результате изменений ткани, вызванных различными факторами (соматические мутации, воздействие патогенов, химических веществ и т. п.). Существуют нормальные, скрытые, или секвестированные, антигены (антигены спермы, хрусталика глаза, тиреоглобулин). Если эти антигены из-за травмы или инфекционного процесса выходят из своих тканей и поступают в кровь, к ним возникают аутоантитела. В свою очередь, соматические мутации В– и Т-клеток могут приводить к возникновению клонов этих клеток, способных синтезировать антитела к собственным антигенам или атаковать и разрушать клетки некоторых тканей. Аутоиммунные болезни могут возникать и вследствие утраты иммунологической толерантности к некоторым собственным антигенам (недостаточность супрессорных клеток). Это может быть результатом прямого воздействия химических веществ, медикаментов или патогенов на лимфоидную ткань либо унаследованной иммунологической недостаточностью. Аутоиммунные болезни часто встречаются у людей с первичным иммунодефицитом. Иммунодефицит и аутоиммунные явления нередко сочетаются у стареющих людей.

Таким образом, аутоиммунные болезни возникают в результате взаимодействия нормальных антител с аутоантигеном либо измененных антител (или клеток) – с нормальным антигеном. Частое сочетание у больных нескольких аутоиммунных явлений и наследуемый характер аутоиммунитета дают основание полагать, что в его основе лежит нарушение какого-то центрального механизма, контролирующего аутотолерантность.

Различают аутоиммунные болезни генерализованные (системная красная волчанка, прогрессирующий системный склероз, ревматоидный артрит и др.) и органо– и тканеспецифические (миастения, тиреоидит и др.). Генерализованные аутоиммунные болезни возникают вследствие образования антител к антигенам, общим для нескольких органов и тканей человека. Типичным примером такой аутоиммунной болезни является системная красная волчанка. Она характеризуется многообразием аутоиммунных явлений, обусловленным тем, что мишенью для образующихся при этой болезни комплексов антиген + антитело + комплемент являются компоненты ядра и цитоплазмы, общие для многих типов клеток. Эти комплексы вызывают осложнения главным образом благодаря их отложению в стенке малых кровеносных сосудов. Болезнь проявляется в развитии васкулитов во многих системах органов, включая кровеносную систему, кожу, суставы и почки, в результате чего развиваются гемолитическая анемия, лейкопения, тромбоцитопеническая пурпура, геморрагический синдром, гломеруло-нефрит и почечная недостаточность. В основе болезни лежит появление аутоантител к различным клеточным антигенам, в том числе к ДНК. Образование многочисленных аутоантител сочетается с гипергаммаглобулинемией и сопровождается снижением уровня комплемента. В патогенезе болезни играют роль генетические, иммунологические и вирусные факторы.

Для диагностики системной красной волчанки используют два основных метода.

1. Обнаружение клеток красной волчанки – гранулоцитов, поглощающих комплексы антиген + антитело и поэтому имеющих характерную морфологию: в центре образуется большая аморфная масса, а многодольчатое ядро окружает ее и сдвинуто на периферию.

2. Обнаружение антител против белка или ядерного материала гранулоцитов с помощью флуоресцирующих противоядерных антител.

Для лечения используют цитоксан (подавляет образование антител) и стероиды (наряду с угнетением образования антител подавляют воспаление). Ткане– и органоспецифические аутоиммунные болезни характеризуются аутоиммунным ответом на антиген, присутствующий только в определенном типе клеток.

Частота появления аутоантител с возрастом увеличивается, и соответственно увеличивается число заболеваний, при которых действует аутоиммунный фактор. Этому фактору приписывают ведущую роль в этиологии и патогенезе многих заболеваний, в частности при тиреоидите (болезнь Хашимото), гемолитической анемии, язвенном колите, аллергическом энцефаломиелите, тромбоцитопенической пурпуре, прогрессирующем системном склерозе, некоторых болезнях печени, хроническом мембранозном гломерулонефрите, склеродермии, миастении гравис, синдроме Гудпасчера (наследственный легочно-почечный синдром) и других болезнях.

Решение вопроса об аутоиммунной природе заболеваний основывается на следующих критериях: наличие в крови аутоантител, сенсибилизированных лимфоцитов, аутоантигенов; возможность пассивной передачи сенсибилизации к соответствующему антигену с помощью сыворотки или лимфоцитов; экспериментальное воспроизведение сенсибилизации к данному антигену и сходство клинической картины естественного и экспериментального иммунного процессов. Органоспецифические аутоиммунные заболевания поддаются лечению так же трудно, как и генерализованные. Это определяется природой нарушенных функций специфического органа.

Основной принцип лечения аутоиммунных заболеваний – использование иммуносупрессивных препаратов.

Иммунопрофилактика

Иммунотерапия

В широком смысле слова под иммунотерапией следует понимать такой метод лечения, при котором осуществляется воздействие на иммунную систему: ее стимуляция, восстановление или исправление иммунных структур (коррекция иммунодефектов), временное замещение или подавление иммунного ответа и т. п. В более узком понимании, иммунотерапия – специфические методы лечения инфекционных заболеваний с помощью иммунных сывороток (серотерапия) или вакцин (вакцинотерапия), или аллергенов (десенсибилизация).

Серотерапия – метод лечения инфекционных болезней, основанный на введении больному иммунных сывороток или препаратов иммуноглобулина, содержащих специфические антитела к возбудителю болезни или его токсинам. Серотерапия наиболее эффективна при тех заболеваниях, патогенез которых определяется экзотоксином, продуцируемым возбудителем (дифтерия, столбняк, ботулизм, газовая гангрена). Своевременное введение антител приводит к нейтрализации токсина и прекращению его действия.

Вакцинотерапия. Вакцины могут быть использованы не только для профилактики, но и для лечения инфекционных болезней. Вакцинотерапия основана на введении больному вакцины (анатоксина) или отдельных микробных антигенов с целью стимуляции иммунитета и (или) десенсибилизации организма к данному микроорганизму или его антигенам. Вакцинотерапию используют обычно при хронических, рецидивирующих инфекциях или при тех заболеваниях, при которых естественноприобретенный иммунитет развивается медленно и непрочен. Для вакцинотерапии применяют либо стандартные лечебные вакцины, либо вакцину, изготовленную из штамма, выделенного от данного больного (аутовакцину).

Десенсибилизация. Различают два типа десенсибилизации:

1) временное подавление эффекторного звена при повторном введении антигена;

2) гиперсенсибилизация – способ лечения ГЧЗ путем многократного введения в возрастающих дозах (или однократно в форме депонированного препарата) аллергена для стимуляции синтеза антител, относящихся к классам IgG и IgM, которые конкурируют с антителами IgE за аллергены и подавляют дальнейший синтез IgE.

Взаимодействие антигена с антителом проявляется в форме различных иммунологических, или серологических (лат. serum – сыворотка), реакций. В связи с их высокой чувствительностью и специфичностью они нашли широкое диагностическое применение.

Серологические реакции применяют с одинаковым успехом для двух целей. Вопервых, по известному антигену (диагностикуму) определяют в исследуемой сыворотке наличие и количественное содержание специфических к данному антигену антител. Последнее устанавливают путем титрования сыворотки. Титром иммунной сыворотки называют то ее максимальное разведение, которое еще дает положительную реакцию. Во-вторых, с помощью известного антитела, т. е. диагностической иммунной сыворотки, определяют наличие в исследуемом материале специфического микробного антигена или осуществляют серологическую идентификацию выделенного возбудителя.

С диагностической целью используют следующие серологические реакции:

1. Реакция агглютинации в ее различных вариантах.

2. Реакция преципитации и ее различные модификации.

3. Реакции иммунофлуоресценции (РИФ) в прямом и непрямом вариантах.

4. Реакции, протекающие с участием комплемента.

5. Реакции, протекающие с участием фагоцитов.

6. Реакции иммуносорбентного анализа твердой фазы.

7. Реакции нейтрализации биологической активности возбудителя или токсинов.

Реакция агглютинации

Варианты ускоренных реакций агглютинации. Реакция пассивной гемагглютинации и ее варианты

Классическая реакция агглютинации предусматривает использование корпускулярных антигенов. Однако в ней могут участвовать и растворимые антигены. Чтобы это стало возможным, такие антигены адсорбируют на иммунологически инертных частицах. В качестве носителя можно использовать частицы латекса или бентонита, однако в настоящее время наиболее часто применяют эритроциты животных или человека, улучшая их адсорбирующие свойства обработкой растворами танина, формалина или бензидина. Эритроциты, адсорбировавшие на себе антиген, называются сенсибилизированными данным антигеном, а иммунная реакция, в которой они участвуют, – реакцией непрямой, или пассивной, гемагглютинации (РНГА, или РПГА), так как эритроциты участвуют в ней пассивно.

РПГА ставят в специальных полистироловых пластинках с луночками, имеющими полусферическое дно. При использовании ее для серологической диагностики в этих луночках готовят двукратные разведения в физиологическом растворе исследуемой сыворотки и затем добавляют к ней в качестве диагностикума взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Учет результатов проводят через 2 ч инкубации при температуре 37 °C по четырехкрестной системе. При положительной реакции агглютинировавшиеся эритроциты оседают на дно луночки и равномерно покрывают его в виде перевернутого зонтика. При отрицательной реакции эритроциты тоже оседают, жидкость становится прозрачной, осадок выглядит как маленький диск в центре луночки. Титром сыворотки в РПГА считается последнее ее разведение, которое еще дает ярко выраженную гемагглютинацию без значительных признаков наличия диска.

РПГА может применяться также в качестве ускоренного метода бактериологической диагностики для обнаружения непосредственно в исследуемом материале неизвестных бактерий, вирусов, токсинов, например возбудителей чумы, стафилококковых энтеротоксинов и др. При таком варианте постановки РПГА в роли известного компонента реакции используют эритроциты, адсорбировавшие антитела известной специфичности – антительный эритроцитарный диагностикум. Если исследуемый материал содержит достаточное количество известного антигена, РПГА будет положительна.

Вариантами использования РПГА являются: реакция нейтрализации антигена (РНАг), реакция нейтрализации антител (РНАт), реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). Для этих реакций используют антигенные и антительные эритроцитарные диагностикумы. Можно использовать одновременно две взаимно контролирующие однонаправленные реакции, например РПГА с антигенным диагностикумом и РНАг с антительным эритроцитарным диагностикумом.

Реакция нейтрализации антител (РНАт) заключается в том, что суспензию, содержащую искомый антиген, смешивают со специфической иммунной сывороткой, содержащей известные антитела, в соответствующих объемах и инкубируют при температуре 37 °C в течение двух часов. После этого добавляют антигенный эритроцитарный диагностикум. Смесь встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Результаты учитывают через 3 – 4 ч и окончательно – через 18 – 24 ч. Если в исследуемом материале имеется антиген, он свяжет антитела (нейтрализует их), и поэтому гемагглютинации не произойдет.

По такому же принципу ставят реакцию нейтрализации антигена (РНАг). Только в этом случае в исследуемом материале обнаруживают антитела. Специфический антиген, добавленный к такому исследуемому материалу, будет связываться с антителами, содержащимися в нем, т. е. произойдет нейтрализация антигена антителами, и поэтому гемагглютинации при добавлении антительного эритроцитарного диагностикума не произойдет.

Реакция коагглютинации. Является одним из вариантов пассивной, т. е. опосредованной клетками-носителями антител, ускоренной реакции агглютинации на стекле. В основу этой реакции положено уникальное свойство золотистого стафилококка, имеющего в составе своей клеточной стенки белок А, связываться с Fc-фрагментами IgG и IgM. При этом активные центры антител остаются свободными и могут взаимодействовать со специфическими детерминантами антигенов. На предметное стекло наносят каплю 2 %-ной взвеси стафилококков, сенсибилизированных соответствующими антителами, и добавляют каплю взвеси исследуемых бактерий. При соответствии антигена антителам через 30 – 60 с происходит четкая агглютинация нагруженных антителами стафилококков.

Реакция латекс-агглютинации (ЛАГ). Носителем антител в этой диагностической системе являются мелкие стандартные частички латекса. Реакцию выполняют микрометодом в лунках на стекле. Основным условием успешной постановки ЛАГ является строгое соблюдение количественных соотношений компонентов системы: к 50 мкл исследуемого материала добавляют 10 мкл латекс-препарата, сенсибилизированного антителами. Специфичность ЛАГ контролируют с помощью трех контрольных тестов, содержащихся в коммерческих тест-системах: заведомо положительная реакция, заведомо отрицательная реакция и контроль качества латекс-суспензии по ЛАГ-несенсибилизированным (не несущим антител) латексам с исследуемым материалом. В нашей стране в качестве носителей специфических антител используют полистироловые монодисперсные латексы с разным диаметром частиц (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 мкм). ЛАГ используют для быстрого обнаружения микроорганизмов или их антигенов в исследуемом материале.

Иммуномагнитное обнаружение антигенов. Один из вариантов ускоренной реакции агглютинации на стекле связан с применением супермагнитных полимерных частиц, покрытых специфическими антителами. Одна такая частица связывает до 10⁷– 10⁸ клеток микроорганизмов, благодаря чему чувствительность данного метода достигает 5 КОЕ/мл. Иммуномагнитное обнаружение микроорганизмов можно применять в комплексе с ЦПР.

Реакция агрегат-гемагглютинации (РАГА). Позволяет быстро обнаружить в крови больных как свободно циркулирующие антигены (антигенемия), так и антигены, связанные с антителами, – циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК). Для РАГА используют эритроциты, сенсибилизированные соответствующими антителами. Добавление сыворотки крови больного, в которой содержатся антигены, к сенсибилизированным эритроцитам, на которых фиксированы антитела, приводит к склеиванию (агглютинации) эритроцитов и иммунных комплексов.

Антиглобулиновая проба Кумбса (реакция Р. Кумбса). При помощи реакций прямой и пассивной агглютинации определяют полные (двухвалентные) антитела. Неполные (моновалентные, блокирующие) антитела не выявляются этими методами, так как, соединяясь с антигеном, блокируют его, но не могут вызвать агрегации антигена в крупные конгломераты. Неполными (блокирующими) называют антитела, у которых функционирует только один активный центр; второй активный центр по неизвестной причине не срабатывает. Для выявления неполных антител используют специальную реакцию Кумбса (рис. 72). В реакции участвуют: сыворотка больного, в которой определяют неполные антитела, корпускулярный антиген-диагностикум, антиглобулиновая сыворотка, содержащая антитела к человеческому глобулину. Реакция протекает в два этапа.

1. Взаимодействие антигена с неполными антителами. Видимых проявлений при этом нет. Первый этап заканчивают отмывкой антигена от остатков сыворотки больного.

2. Взаимодействие антиглобулиновой сыворотки, полученной в результате иммунизации животного человеческим глобулином, с неполными антителами, адсорбированными на антигене. В силу того что антиглобулиновые антитела двухвалентны, они связывают два одновалентных антитела отдельных комплексов АГ + неполное антитело, что приводит к их склеиванию и появлению видимого осадка.

Рис. 72. Антиглобулиновая проба Кумбса для выявления неполных (моновалентных) антител:

а – антиген; б – неполное антитело; в – антитело против моновалентного антитела (антиглобулин). 1. Соединение неполных антител с антигенами (агглютинации не происходит). 2. Добавление антиглобулиновой сыворотки приводит к агглютинации антигенов, блокированных неполными антителами

Антиглобулиновую пробу Кумбса применяют, например, при серологической диагностике бруцеллеза, при анализе групп крови, в диагностике аутоиммунных заболеваний и др.

Реакция преципитации и ее варианты

Реакции агглютинации и преципитации очень близки по своей сути. Различия между ними зависят главным образом от величины частиц антигена. Преципитацией называют процесс, когда происходит агрегация антител с растворимыми антигенами; если же антиген представлен корпускулами, специфическая агрегация таких антигенов описывается как агглютинация.

Появление преципитата при реакции антиген – антитело определяется не только возникновением решетки, образуемой ее участниками, но и особой ролью Fc-фрагмента иммуноглобулина, изменение конформации которого приводит к утрате этим комплексом растворимости в солевых растворах. В связи с этим в реакции преципитации используют неразведенную или слабо разведенную сыворотку.

Рис. 73. Схема определения токсигенности Corynebacterium diphtheriae

Объяснение см. в разделе «Микробиология дифтерии»

Для постановки реакции преципитации необходимы: антитела – испытуемая сыворотка больного или иммунная диагностическая сыворотка (при идентификации выделенных микробов); антиген – экстрагированный гаптен или полный гаптен соответствующих микроорганизмов; физиологический раствор как источник электролитов. Существует множество модификаций этой реакции, которые подразделяют на две группы: преципитация в жидкой среде (реакция флоккуляции и реакция кольцепреципитации) и преципитация в геле.

Реакция флоккуляции представляет собой преципитацию, при которой растворы антигенов и антител смешивают в пробирке. Учет реакции производят с помощью измерения на фотоэлектроколориметре мутности получаемой системы, что позволяет определить концентрацию исследуемого антигена.

Значительно чаще применяется качественная реакция кольцепреципитации. Для ее постановки в тонкие преципитационные пробирки наливают сначала неразведенную преципитирующую сыворотку и сверху на нее наслаивают, не допуская перемешивания, раствор антигена. В случае гомологичности антител и антигена на границе между этими растворами быстро, через 3 – 10 мин, появляется кольцо преципитата. В отличие от реакции агглютинации, титр преципитирующей сыворотки определяют с помощью разведения не сыворотки, а антигена.

Реакция преципитации в геле является одним из наиболее эффективных методов анализа растворимых антигенов. Она позволяет выявить число индивидуальных антигенов в исследуемой жидкости и провести анализ их антигенного родства. В 1946 г. Дж. Оудин предложил метод простой диффузии, по которому один из компонентов реакции преципитации, обычно сыворотка, находится в геле, а другой – антиген – наслаивается на первый в виде раствора. Антиген, диффундируя в гель, образует в нем с антителами белые линии преципитации, хорошо видимые при боковом освещении. В 1948 г. Ё. Оухтерлоню разработал еще более простой и удобный метод встречной двумерной диффузии, позволяющий проводить прямое сравнение различных антигенов и сывороток. Этот метод также является весьма ценным при исследовании перекрестных реакций (рис. 73).

Для постановки реакции по Оухтерлоню используют 1 %-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе, который разливают в чашки Петри слоем 0,5 см. После застывания в пластинке агара вырезают луночки диаметром 5 – 6 мм – одна в центре чашки, 4 – 5 – по окружности на расстоянии 1 – 2 см от центральной. В центральную луночку наливают диагностическую преципитирующую сыворотку, а в периферические – раствор гомологичного и сравниваемых с ним антигенов. Учет результатов проводят через 24, 48 и 72 ч инкубации при комнатной температуре. Антитела и антигены диффундируют навстречу друг другу, и в участках, где создаются их эквивалентные концентрации, образуются дугообразные полосы преципитации. Если полосы преципитации, идущие от двух соседних луночек, сливаются, это указывает на наличие нескольких антигенных компонентов в исследуемой жидкости. Реакцию встречной диффузии по Оухтерлоню часто применяют для определения токсигенности бактерий, например дифтерийных (см. рис. 73).

Дальнейшим развитием метода преципитации в геле является иммуноэлектрофорез. Этим термином обозначают метод, объединяющий электрофоретическое разделение смеси антигенов и встречную диффузию по Оухтерлоню на одной и той же пластинке агарового геля. Преципитирующую сыворотку при этом наливают в канавку, вырезанную в геле параллельно направлению электрофоретического разделения. Образующиеся в результате реакции линии преципитации имеют вид дуг, вытянутых в направлении электрофоретического движения фракций антигенов. Иммуноэлектрофорез позволяет определять состав сложных смесей растворимых антигенов, содержащих до 30 компонентов, и является поэтому ценным диагностическим методом.

Реакция иммунофлуоресценции

Молекулы иммуноглобулинов способны необратимо связываться (метиться) с некоторыми химическими веществами без потери своей антительной специфичности и свойства связываться с антигеном. Для такого мечения можно использовать красители, флуоресцирующие при облучении их коротковолновым светом (ультрафиолетовым, фиолетовым, синим), например изотиоционат флуоресцеина, дающий зеленовато-желтое окрашивание, или другие флуорохромы. Использование для обнаружения антигенов меченных флуорохромами антител, т. е. реакцию иммунофлуоресценции (РИФ), предложил в 1950 г. А. Кунс. С помощью РИФ можно быстро обнаруживать даже ничтожные количества антигенов, в том числе бактериальных и вирусных, по эффекту флуоресценции комплекса антиген + антитело в люминесцентном микроскопе.

Метод иммунофлуоресценции используют в двух вариантах. Один из них получил название прямого метода РИФ, и в этом случае метят антитела, которые непосредственно участвуют в реакции с исследуемым антигеном. Второй вариант известен под названием непрямого метода РИФ. В этом случае с исследуемым антигеном вначале взаимодействуют специфические к нему антитела, а уже с ними взаимодействуют антивидовые антитела (антитела против иммуноглобулинов диагностической сыворотки), меченные флуорохромом (рис. 74). Преимуществом непрямого метода РИФ является то, что при его использовании отпадает необходимость иметь большой набор различных специфических флуоресцирующих антител, так как он основан на использовании антиглобулиновых антител. В качестве последних обычно используют сыворотку козы или барана, иммунизированных сывороткой кролика (коммерческие диагностические иммунные сыворотки чаще всего готовят путем иммунизации кроликов). Непрямой метод иммунофлуоресценции применяют не только для ускоренного обнаружения антигенов (возбудителя), но и для обнаружения антител в сыворотке крови больных. Например, для серологической диагностики токсоплазмоза токсоплазмы фиксируют на предметном стекле и обрабатывают сывороткой исследуемого больного. После ее отмывки мазок повторно обрабатывают сывороткой, содержащей меченные флуорохромом антитела против человеческого глобулина. Если в крови больного есть антитела, т. е. человек болен, в люминесцентный микроскоп будут видны светящиеся токсоплазмы.

Рис. 74. Схема прямого (а) и непрямого (б) методов иммунофлуоресценции

Серологические реакции, протекающие с участием комплемента

Реакция бактериолиза. Используется для серологической диагностики холеры. Феномен бактериолиза легко удается наблюдать in vitro. Исследуемую сыворотку наносят в последовательном двукратном разведении каплями на поверхность питательной среды, на которую предварительно засевают культуру вибриона. Чашку с посевами инкубируют при температуре 37 °C в течение 18 – 20 ч. Под влиянием имеющихся в сыворотке антител и комплемента холерные вибрионы разрушаются (лизируются), и в местах нанесения капель образуются стерильные пятна. Антитела, разрушающие или умерщвляющие вибрионы, называют вибриоцидными. Титром вибриоцидных антител считается максимальное разведение сыворотки, при котором она еще вызывает отчетливый лизис бактерий.

Реакция иммобилизации трепонем. Применяется для диагностики сифилиса. Живые трепонемы в присутствии имеющихся в исследуемой сыворотке специфических антител и комплемента теряют свою подвижность.

Реакция гемагглютинации иммунного прилипания. В основе этой реакции лежит способность комплекса антиген + антитело в присутствии комплемента адсорбироваться на эритроцитах, вызывая их склеивание. Применяется для серологической диагностики гепатита А. Характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, но требует использования высокоочищенного антигена и специального подбора доноров эритроцитов.

Реакция гемолиза. Литическое действие иммунной сыворотки в присутствии комплемента особенно четко проявляется в отношении эритроцитов. Если кролика иммунизировать эритроцитами другого вида животных (барана), кроличья сыворотка приобретает специфическую гемолитическую активность, т. е. способность вызывать гемолиз эритроцитов, использованных для иммунизации. Этот эффект абсолютно зависим от комплемента. Инактивация последнего путем прогревания сыворотки при температуре 56 °C приводит к утрате ею гемолитической активности. Таким образом, наличие или отсутствие активного комплемента в гемолитической сыворотке очень четко выявляется по результатам ее взаимодействия с гомологичными эритроцитами: при наличии комплемента – гемолиз, образование «лаковой крови»; при его отсутствии – гемагглютинация, эритроциты выпадают на дно пробирки, образуя осадок в виде зонтика, жидкость бесцветна.

Реакция связывания комплемента

Уникальная способность комплемента специфически связываться с различными по своей природе комплексами антиген + антитело нашла широкое применение в реакции связывания комплемента (РСК). Особое преимущество РСК состоит в том, что природа антигена, участвующего в ней (корпускулярный или растворимый), не имеет значения, так как комплемент связывается с Fc-фрагментом любого антитела, относящегося к IgG и IgM, независимо от его антительной специфичности. Кроме того, РСК очень чувствительна: она позволяет обнаружить количество антител в 10 раз меньшее, чем, например, в реакции преципитации. РСК была предложена в 1901 г. Ж. Борде и О. Жангу. В ее основе лежат два свойства комплемента:

1) способность связываться с комплексом антиген + антитело;

2) лизирование эритроцитов, использованных для получения гемолитической сыворотки.

РСК ставят в два этапа, и в ней соответственно участвуют две системы – опытная, или диагностическая, и индикаторная. Диагностическая система состоит из исследуемой (или диагностической) сыворотки, которую перед постановкой реакции прогревают при 56 °C в течение 30 мин для инактивации имеющегося в ней комплемента, и антигена. К этой системе добавляют стандартный комплемент. Его источником служит свежая или высушенная сыворотка морской свинки. Смесь инкубируют при 37 °C в течение одного часа. Если в исследуемой сыворотке имеются антитела, произойдет их взаимодействие с добавленным антигеном, и образующиеся комплексы антиген + антитело свяжут добавленный комплемент. Если же в сыворотке антитела отсутствуют, образования комплекса антиген + антитело не произойдет, и комплемент останется свободным. Никаких видимых проявлений связывания комплемента на этой стадии реакции обычно нет. Поэтому для выяснения вопроса, произошло или нет связывание комплемента, добавляют вторую, индикаторную систему (инактивированная гемолитическая сыворотка + эритроциты барана), и смесь всех компонентов РСК вновь инкубируют при 37 °C в течение 30 – 60 мин, после чего оценивают результаты реакции. В случае, если комплемент связался на первой стадии, в диагностической системе, т. е. в сыворотке больного имеются антитела, и произошло связывание комплемента комплексом антитело + + антиген, лизиса эритроцитов не будет – РСК положительна: жидкость бесцветна, на дне пробирки осадок эритроцитов. Если же в сыворотке специфические антитела отсутствуют и связывания комплемента в диагностической системе не произойдет, т. е. РСК отрицательна, то неизрасходованный в диагностической системе комплемент связывается с комплексом эритроциты + антитела индикаторной системы и произойдет гемолиз: в пробирке «лаковая кровь», осадка эритроцитов нет. Интенсивность РСК оценивают по четырехкрестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов. Реакция сопровождается соответствующими контролями: контроль сыворотки (без антигена) и контроль антигена (без сыворотки), так как некоторые сыворотки и некоторые антигены обладают антикомплементарным действием. Перед постановкой РСК все компоненты, участвующие в ней, за исключением исследуемой сыворотки или антигена, подвергаются тщательному титрованию. Особенно важно ввести в реакцию точную дозу комплемента, так как его нехватка или избыток могут привести к ложным результатам. Титром комплемента является то его минимальное количество, которое в присутствии рабочей дозы гемолитической сыворотки обеспечивает полное растворение эритроцитов. Для постановки основного опыта берут дозу комплемента, увеличенную на 20 – 25 % по сравнению с установленным титром. Титром гемолитической сыворотки является то ее максимальное разведение, которое, будучи смешано с равным объемом 10 % раствора комплемента, полностью гемолизирует соответствующую дозу эритроцитов в течение 1 ч при температуре 37 °C. В основной опыт берут сыворотку, разведенную до ¹/₃ своего титра.

Непрямая реакция гемолиза используется как ускоренный метод обнаружения специфических антител. В качестве носителя антигенов используют эритроциты. При наличии в сыворотке больного специфических антител сенсибилизированные эритроциты в присутствии комплемента лизируются.

Серологические реакции, протекающие с участием фагоцитов

Определение опсонического индекса. Антитела, стимулирующие фагоцитарную активность лейкоцитов, получили название опсонинов (греч. opsoniazo – снабжать пищей, питать), или бактериотропинов. Различают термолабильные и термостабильные опсонины, или бактериотропины. К последним относятся антитела классов IgG1, IgG3, IgM. На первом этапе опсонизации антитела прикрепляются к детерминантным группам бактерий, а затем антитела с помощью Fc-фрагментов присоединяются к Fc-рецепторам макрофагов, способствуя поглощению ими бактерий (патогенов). Опсоническая активность антител резко возрастает в присутствии термолабильных опсонинов, в том числе молекул C3b, образующихся при активации системы комплемента. Молекулы C3b, осаждаясь на поверхности бактериальных клеток, способствуют прикреплению макрофагов в этих участках (эффект «иммунного прилипания»). Таким образом, опсонины и комплемент способствуют более эффективному прикреплению чужеродных частиц к макрофагам, поглощению и перевариванию их последними, а также, очевидно, процессингу и представлению антигенов. Для количественной оценки фагоцитарной активности, обусловленной опсонинами, используют определение опсонического индекса, опсоно-фагоцитарного индекса и титра опсонинов.

Под опсоническим индексом понимают отношение фагоцитарного числа исследуемой крови к фагоцитарному числу нормальной крови. Для определения фагоцитарного числа оба образца крови смешивают со стандартным количеством соответствующих живых или убитых бактерий. После 30 мин инкубации при температуре 37 °C из каждого образца крови готовят препараты-мазки, фиксируют по способу Никифорова и окрашивают метиленовым синим. Затем под микроскопом подсчитывают общее количество бактерий, фагоцитированных, например, 50 фагоцитами, и находят фагоцитарное число. Опсонический индекс является показателем того, насколько активно стимулируется фагоцитоз опсонинами и системой комплемента.

Опсоно-фагоцитарная реакция – способ оценки активности действия опсо-

нинов сыворотки на эффективность фагоцитоза бактерий или других корпускулярных антигенов, обработанных этой сывороткой. Для определения опсоно-фагоцитарного индекса, как и при определении опсонического, готовят и окрашивают мазок из смеси исследуемой крови с бактериями. Под микроскопом в нем просматривается 25 фагоцитов, и каждый из них в зависимости от числа поглощенных ими бактерий относят к определенной группе. Конкретный пример такого подсчета представлен в табл. 17. Интенсивность фагоцитоза характеризуют цифровым показателем, представляющим собой сумму произведений, полученных путем умножения количества фагоцитов на число соответствующих им плюсов. Максимально возможный показатель равен 75 (25 × 3 = 75). Условно считают, что показатель, равный 10 – 24, соответствует слабо положительной опсоно-фагоцитарной реакции, 25 – 49 – положительной, а 50 – 75 – резко положительной. У людей, не имевших контакта с данным возбудителем, опсоно-фагоцитарный индекс обычно невелик (1 – 5).

Таблица 17

Оценка опсоно-фагоцитарной реакции (пример)

Существуют различные варианты этой реакции, но из-за громоздкости их используют относительно редко, например для диагностики бруцеллеза и некоторых других болезней.

Титр опсонинов характеризует количественно силу опсонической активности по отношению к данному возбудителю. Активность опсонинов проверяют в опытах с использованием фагоцитов здоровых людей.

Реакции иммуносорбентного анализа твердой фазы

В основе методов иммуносорбентного анализа твердой фазы лежит сорбция антител (для обнаружения неизвестного антигена) или антигенов (для обнаружения специфических антител) и специфических антител, меченных ферментом (иммуноферментный метод – ИФМ) или изотопом (радиоиммунный метод – РИМ). Чувствительность этих методов значительно превышает чувствительность традиционных иммунологических реакций, поэтому они приобрели самое широкое распространение. Эти методы могут быть использованы для диагностики практически любого инфекционного заболевания. С их помощью можно определить как антигены любого возбудителя, так и антитела к ним. Методика постановки этих реакций включает три последовательных этапа.

Обнаружение антигена с помощью ИФМ и РИМ

Первый этап – адсорбция специфических антител твердой фазой, в качестве которой обычно используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых микротитраторных панелей. Антитела нековалентно связываются со стенками лунок, у них сохраняются свободными активные центры, и поэтому они способны специфически реагировать с соответствующим антигеном.

Второй этап – связывание антигена из суспензии исследуемого материала за счет реакции антитело + антиген, происходящей на границе твердая фаза – жидкость. После этого луночки промывают раствором, содержащим слабый неионный детергент, для удаления из системы других, неспецифически связанных с антителами компонентов.

Третий этап – обработка твердой фазы с фиксированными на ней комплексами антитело + антиген специфическими антителами против данного антигена, но меченными либо ферментом, либо изотопом. Такие меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется из системы промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом материале искомого антигена на поверхности твердой фазы формируется комплекс: антитело + антиген + меченое антитело. Результаты реакции учитывают в зависимости от характера метки. Для иммуноферментного метода антитела метят ферментом, чаще всего пероксидазой или щелочной фосфатазой. Субстратом для пероксидазы служит H₂O₂ в смеси с ортофенилендиамином, используемая в виде раствора в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0). Добавление в опытную луночку раствора субстрата приводит к тому, что он подвергается действию пероксидазы, фиксированной на антителах; образующиеся продукты реакции имеют желтую окраску, интенсивность которой может быть определена путем фотометрирования.

Радиоиммунный метод (РИМ) предусматривает использование антител, меченных изотопом, поэтому результаты реакции оценивают путем определения радиоактивности исследуемых образцов. При положительной реакции уровень радиоактивности опытных образцов более чем в 2 раза превышает уровень радиоактивности контрольных, заведомо отрицательных образцов (рис. 75, а).

Рис. 75. Схема использования иммуноферментного и радиоиммунного методов для обнаружения антигенов (а) и антител (б):

1. Поверхность твердой фазы. 2. Специфические антитела. 3. Антиген (исследуемый материал). 4. Cпецифические к данному антигену антитела, меченные ферментом (5) или изотопом (6). 7. Субстрат для фермента. 8. Специфический антиген. 9. Исследуемая сыворотка (антитела). 10. Антивидовая сыворотка, содержащая антитела к человеческому иммуноглобулину, меченные ферментом (11) или изотопом (12). 13. Субстрат для фермента

Обнаружение специфических антител с помощью ИФМ и РИМ

Для обнаружения антител реакции также ставят в три этапа.

Первый этап – адсорбция специфических антигенов на стенках луночек. Обычно планшеты в коммерческих тест-системах уже имеют сенсибилизированные луночки, т. е. на их дне и стенках антигены уже адсорбированы.

Второй этап – добавление в луночки образцов исследуемой сыворотки для обнаружения в ней специфических антител к данному антигену. Если они имеются, то вступают во взаимодействие с антигеном и образуют комплекс антиген + + антитело.

Третий этап – после отмывания луночек в них добавляют специфические антиглобулиновые антитела (антивидовые, т. е. антитела против человеческих иммуноглобулинов), но меченные ферментом (ИФМ) либо изотопом (РИМ). Результаты реакции оценивают, как указано выше (рис. 75, б). В качестве контроля используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные.

Предложены различные варианты иммуноферментного метода. Большое значение имеет вариант ИФМ, позволяющий осуществлять «захват» антител, относящихся к IgM. Этот метод позволяет более точно производить серологическую диагностику, так как основан на обнаружении специфических иммуноглобулинов IgM, которые появляются в первую очередь при встрече с возбудителем.

Реакции нейтрализации

Этот тип иммунологических реакций основан на способности антител специфически подавлять (нейтрализовать) биологическую активность возбудителя или его токсинов в различных тест-системах – организме животных, в куриных эмбрионах, культурах клеток – или каким-то иным способом. Это зависит от природы возбудителя и цели исследования. Например, для оценки эффективности иммунизации против дифтерии и столбняка определяют уровни антитоксинов в сыворотке крови привитых по их способности нейтрализовать биологическое действие определенной дозы токсина (реакция Шика). Однако реакции нейтрализации применяют и с диагностическими целями. Особенно широкое применение они получили в вирусологической практике как для серологической диагностики вирусных заболеваний, так и для идентификации вирусов. С этой целью используют реакции нейтрализации роста вирусов в культуре ткани, подавления бляшкообразования, гемадсорбции, торможения гемагглютинации (РТГА) и др.

Таблица 18

Активность антител, относящихся к различным классам иммуноглобулинов, в иммунологических реакциях

До тех пор, пока не была выяснена химическая природа антител, полагали, что каждая реакция иммунной сыворотки опосредуется особым видом антител, которые получили соответственно название агглютининов, преципитинов, опсонинов, антитоксинов и т. п. Хотя эти названия сохранились, они имеют чисто феноменологическое значение, т. е. отражают конечный результат взаимодействия антитела с антигеном. В настоящее время уже ясно, что нет специальных антител – агглютининов, преципитинов и т. д., а есть 5 классов иммуноглобулинов. Специфичность антител, относящихся к любому классу иммуноглобулинов, определяется структурой активного центра, причем антитела данной специфичности могут относиться к разным классам. Конечный исход взаимодействия антигена с антителами зависит от природы антигена (корпускулярный – агглютинация, растворимый – преципитация); от участия системы комплемента (бактериолиз, бактерицидное действие); макрофагов; от того, к какому классу иммуноглобулинов относится данное антитело; от свойств его Fc-фрагмента. Разные классы иммуноглобулинов в неодинаковой степени участвуют в различных иммунологических реакциях (табл. 18).

Например, в реакциях агглютинации наиболее активны антитела, относящиеся к IgM и IgG, в реакции связывания комплемента участвуют главным образом антитела IgG и IgM, в реакции лизиса с участием лизоцима и комплемента – только IgA.

Открытие вирусов

Приоритет открытия вирусов принадлежит выдающемуся русскому ученому Д. И. Ивановскому. Еще будучи студентом Петербургского университета, в 1887 г. по предложению своих учителей А. Н. Бекетова и А. С. Фаминцына Д. И. Ивановский вместе со студентом В. В. Половцевым приступил к изучению мозаичной болезни табака, наносившей большой вред сельскому хозяйству. Ими было установлено, что описанная в Голландии А. Мейером мозаичная болезнь табака представляет собой не одно, а два совершенно различных заболевания одного и того же растения, одно из которых – рябуха (ее возбудитель – грибок), а другое – собственно мозаичная болезнь табака неизвестного происхождения. Изучение природы этого заболевания Д. И. Ивановский проводил самостоятельно, оно и привело его к открытию первого вируса. Капелькой сока, взятого от больного растения, Д. И. Ивановский заражал здоровое растение и вызывал его заболевание. Это убедило его в том, что инфекционное начало находится в соке. Однако при микроскопии сока он не обнаружил в нем никаких бактерий, а посевы сока на питательные среды не давали никакого роста. Тогда Д. И. Ивановский решил профильтровать такой странный сок через фарфоровые фильтры, через которые бактерии не проходят. Однако профильтрованный сок вызывал мозаичную болезнь у здоровых растений спустя 15 дней после заражения. Еще более любопытным был тот факт, что профильтрованный сок, нагретый до 60 – 70 °C, утрачивал инфекционные свойства. К тому же, при последовательном заражении соком больных растений болезнь проявлялась всегда, т. е. заразное начало не разбавлялось, а будучи введенным в растение, в нем размножалось, значит, являлось живым существом, которое Д. И. Ивановский назвал фильтрующимся вирусом. Результаты своих работ он опубликовал в журнале «Сельское хозяйство и лесоводство» в статье «О двух болезнях табака» и доложил на заседании Российской Академии наук 12 февраля 1892 г. Эта дата и является официальным днем рождения новой науки – вирусологии, а Д. И. Ивановский – ее основоположник.

Только спустя 6 лет (в 1898 г.) опыты Д. И. Ивановского повторил и воспроизвел его результаты М. Бейеринк. Поэтому попытки некоторых иностранных авторов приписать первооткрытие вирусов М. Бейеринку совершенно несостоятельны. Да и сам М. Бейеринк признал приоритет Д. И. Ивановского. Отвечая на замечания, сделанные ему Д. И. Ивановским, М. Бейеринк писал: «Я подтверждаю, что, как я теперь вижу, приоритет опыта с фильтрованием через свечу принадлежит господину Д. И. Ивановскому».

Очень скоро после работ Д. И. Ивановского было установлено, что вирусы широко распространены в природе и вызывают заболевания не только у растений, но и у животных и человека. Открытия вирусов следовали одно за другим: 1897 г. – вирус ящура; 1901 г. – вирус желтой лихорадки; 1903 г. – вирус бешенства; 1908 г. – вирус оспы человека; 1909 г. – вирус полиомиелита. Эти открытия не прекращаются и в наше время: 1970 г. – вирус гепатита В; 1973 г. – вирус гепатита А; 1977 г. – вирус дельта-гепатита; 1983 г. – вирус иммунодефицита человека.

Основные свойства вирусов

Основные свойства вирусов, по которым они отличаются от всех остальных живых существ (кроме плазмид – см. с. 127 – 128), следующие:

1. Ультрамикроскопические размеры.

2. Вирусы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа – или ДНК, или РНК. Все другие организмы содержат нуклеиновые кислоты обоих типов, а гено́м у них представлен только ДНК.

3. Вирусы не способны к росту и бинарному делению.

4. Вирусы размножаются путем воспроизводства себя из собственной геномной нуклеиновой кислоты. Размножение всех прочих организмов включает стадии бинарного деления клеток.

5. У вирусов отсутствуют собственные системы мобилизации энергии.

6. У вирусов нет собственных белоксинтезирующих систем.

7. В связи с отсутствием собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами. Средой обитания вирусов являются бактерии, клетки растений, животных и человека.

С учетом перечисленных особенностей вирусам можно дать следующее определение: вирусы – особое царство ультрамикроскопических размеров организмов, обладающих только одним типом нуклеиновых кислот, лишенных собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии и являющихся поэтому абсолютными внутриклеточными паразитами (А. И. Коротяев).

Существует и другой взгляд на природу вирусов: «…вирусы можно рассматривать как генетические элементы, одетые в защитную оболочку и способные переходить из одной клетки в другую» (Альберт Б. [и др.], 1986). Однако эти же авторы там же называют репродукцию вируса в клетке его жизненным циклом.

Молекулярно-генетическая организация вирусов

Основой таксономии вирусов является вирион, который представляет собой конечную фазу развития вируса. Вирион состоит из геномной нуклеиновой кислоты, окруженной одной или двумя оболочками. По строению вирусы можно разделить на четыре типа, которые различаются по характеру упаковки морфологических субъединиц:

1) вирусы со спиральной симметрией;

2) изометрические вирусы с кубической симметрией;

3) вирусы с бинарной симметрией, например фаги: у них головка имеет кубический тип симметрии, а хвостик – спиральный;

4) более сложно организованные вирусы, имеющие вторую оболочку.

Оболочка, в которую упакована геномная нуклеиновая кислота, называется капсидом (греч. capsa – ящик). Наиболее просто организованные вирусы представляют собой нуклеокапсиды: они состоят только из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки, построенной из идентичных пептидных молекул. Поскольку число аминокислотных остатков в белковой молекуле всегда меньше числа нуклеотидов в гене (код триплетный), то для того, чтобы упаковать геномную нуклеиновую кислоту, требуется большое число одинаковых белковых молекул. А многократное повторение белок-белковых взаимодействий возможно лишь при условии симметричного расположения субъединиц. Существует всего два способа упаковки одинаковых белковых молекул в капсид, при которых он обладал бы стабильностью. Полимер будет стабильным, если он соответствует наименьшему уровню свободной энергии. Процесс образования такого полимера родствен процессу кристаллизации, он протекает по типу самосборки. Один из вариантов такой самосборки происходит с использованием спиральной симметрии, другой – кубической симметрии.

При спиральной симметрии (ее имеют нитевидные вирусы) белковые субъединицы располагаются по спирали, а между ними, также по спирали, уложена геномная нуклеиновая кислота. Лучше всего этот тип молекулярной организации вириона изучен у вируса мозаичной болезни табака. Он представляет собой нуклеопротеид, имеющий длину 300 нм и диаметр 18 нм. Молекулярная масса вириона 40 МД. Капсид вириона состоит из 2130 белковых молекул, винтообразно уложенных вокруг РНК, содержащей около 6000 нуклеотидов (рис. 76, а). Каждая белковая молекула имеет м. м. 18 240 Д и состоит из 158 аминокислотных остатков. С каждой белковой субъединицей связано три нуклеотида. Белковая спираль состоит из 130 витков, на каждый из которых приходится 16 ¹/₃ субъединиц. Период идентичности (3 оборота спирали) равен 6,9 нм.

При спиральной симметрии белковый чехол лучше защищает геномную нуклеиновую кислоту, но при этом требуется большее количество белка, чем при кубической симметрии. Большинство вирусов с замкнутым чехлом обладает кубической симметрией. В ее основе лежат различные комбинации равносторонних треугольников, образующихся из сочетания шаровидных белковых субъединиц. Сочетаясь определенным образом друг с другом, они могут формировать замкнутую сферическую поверхность. Из различных сочетаний равносторонних треугольников, которые образуют общую вершину и общую ось симметрии, могут возникать различные варианты многогранников: тетраэдры, октаэдры и икосаэдры. Икосаэдры имеют 20 граней (каждая представляет равносторонний треугольник), 12 вершин и пятикратную тройную и двойную оси вращательной симметрии (рис. 76, б). Икосаэдры – самая эффективная и экономичная симметрия для формирования замкнутого чехла, так как в этом случае при его сборке используются строительные белки минимального размера и обеспечивается наибольший внутренний объем вириона. Видимо, поэтому сферические вирусы животных чаще всего имеют форму икосаэдра.

Рис. 76. Типы вирусных симметрий:

а – спиральная симметрия (вирус мозаичной болезни табака); б – один из возможных вариантов кубической симметрии

Основные различия между спиральными и сферическими вирусами, по мнению Д. Каспара, таковы.

Упаковка по типу икосаэдра позволяет осуществлять переход от структурных единиц (белковых субъединиц) к морфологическим – капсомерам (греч. meros – часть). Например, 60 молекул субъединиц могут быть представлены в виде 30 молекул димеров или 20 молекул тримеров, морфологически такие олигомеры будут отличаться друг от друга. Число капсомеров для вирусов данного вида является постоянным, оно имеет диагностическое значение. Например, вирион аденовирусов имеет 252 капсомера, причем группы из 9 капсомеров располагаются на поверхности 20 граней (180 капсомеров), а группы из 6 капсомеров образуют 12 вершин (72 капсомера). Число капсомеров у парвовирусов – 32, у паповавирусов – 72. Молекулярная организация всех простых вирусов сводится к использованию спиральной и кубической симметрии.

Более сложно устроены вирусы, у которых имеется вторая оболочка. Вначале она получила название «пеплоса» (накидка греческих солдат). Позднее ее стали называть суперкапсидом. Он представляет собой обычную биологическую мембрану, состоящую из двух слоев липидов, имеющих клеточное происхождение, и заключенных в них гликозилированных суперкапсидных вирусных белков, которые выступают над наружной поверхностью вириона в виде своеобразных шипов (рис. 85, 91). Суперкапсидные вирусные белки, образующие шипы, обладают жизненно важными для вируса функциями: они распознают клеточные рецепторы и связываются с ними, обеспечивают слияние вирусной мембраны с мембраной клетки и ее лизосом, способствуют распространению вируса в организме за счет слияния клеток, многие из них обладают свойствами протективных антигенов и т. д. Многие сложные вирусы, такие как ортомиксовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы и др., устроены таким образом, что их нуклеокапсид, имеющий палочковидную спиральную структуру, свернутую определенным образом, окружен суперкапсидной липопротеиновой оболочкой, придающей вириону сферическую форму (см. рис. 85). Вирионы рабдовирусов содержат спиральный нуклеокапсид, образующий цилиндрическую структуру, покрытую липидсодержащим суперкапсидом, который придает вириону пулевидную форму (рис. 78, 8). У других вирусов, например у тогавирусов, нуклеокапсид имеет форму икосаэдра, который окружен суперкапсидной оболочкой, придающей вириону шаровидную форму. Вирион ретровирусов имеет икосаэдрический капсид, внутри которого располагается спиральный нуклеокапсид, а сам вирион покрыт липидсодержащей оболочкой, придающей ему сферическую форму (см. рис. 91).

Рис. 77. Форма и относительные размеры вирионов некоторых семейств ДНК-содержащих вирусов животных:

1 – Poxviridae; 2 – Herpesviridae; 3 – Adenoviridae; 4 – Papovaviridae; 5 – Parvoviridae

Рис. 78. Форма и относительные размеры вирионов некоторых семейств РНК-содержащих вирусов животных:

1 – Paramyxoviridae; 2 – Orthomyxoviridae; 3 – Coronaviridae; 4 – Arenaviridae; 5 – Retroviridae; 6 — Reoviridae; 7 — Picornaviridae; 8 — Rhabdoviridae; 9 — Orbiviridae; 10 — Togaviridae; 11 — Bunyaviridae

Наиболее сложное строение имеют самые крупные вирусы, относящиеся к семейству поксвирусов. Их вирионы имеют форму параллелепипеда (или овоидную), размером 300 – 450 × 170 – 260 нм. Вирионы покрыты внешней оболочкой, под которой располагаются сложное образование из тубулярных структур и внутреннее ядро, состоящее из ДНК-содержащей сердцевины и одного или двух боковых телец. Вирион содержит более 30 структурных белков и несколько ферментов. Таким образом, структура вириона у каждого семейства вирусов имеет отличительные особенности. Форма и относительные размеры ДНК– и РНК-содержащих вирусов представлены на рис. 77 и 78.

Вироиды и прионы

В природе помимо вирусов обнаружены другие очень мелкие загадочные инфекционные агенты с необычными свойствами. К ним относятся вироиды и прионы.

Вироиды. Название «вироид» было предложено в 1971 г. Т. Динером. Оно свидетельствует о том, что симптомы заболеваний, которые вызывают эти агенты у различных растений, похожи на симптомы заболеваний, вызываемых у них вирусами. Однако вироиды отличаются от вирусов по крайней мере по следующим четырем признакам.

1. Вироиды, в отличие от вирусов, не имеют белковой оболочки и состоят только из инфекционной молекулы РНК. Они не обладают антигенными свойствами и поэтому не могут быть обнаружены серологическими методами.

2. Вироиды имеют очень малые размеры: длина молекулы РНК вироидов равна 1 ⋅ 10^– 6 мм, она состоит из 300 – 400 нуклеотидов. Вироиды – самые маленькие способные к размножению единицы, известные в природе.

3. Молекулы вироидов представляют собой одноцепочечные кольцевые РНК. Такую кольцевую структуру имеет еще только один вирус – вирус дельта-гепатита.

4. Молекулы РНК вироидов не кодируют собственных белков, поэтому их размножение может происходить либо аутокаталитически, либо с участием клетки-хозяина.

С 1971 г. обнаружено более 10 различных вироидов, отличающихся по первичной структуре, кругу поражаемых хозяев, по симптомам вызываемых ими заболеваний. Все известные вироиды построены по одному плану: 300 – 400 нуклеотидов образуют кольцо, которое удерживается парами оснований и образует двухцепочечную палочковидную структуру с перемежающимися короткими одно– и двухцепочечными участками.

Поскольку вироиды не имеют собственных генов и белков, их нельзя считать живыми существами. Поэтому вопрос о природе, происхождении вироидов и о том, каким способом они распространяются, остается открытым. Существует предположение, что вироиды образуются из нормальных клеточных РНК, однако убедительных подтверждений этому не было представлено.

Прионы. Название«прионы» предложил открывший их в 1982 г. С. Прузинер. Прионы – низкомолекулярные, не содержащие нуклеиновых кислот белки, которые вызывают так называемые трансмиссивные губкообразные энцефалопатии. Последние выделены в особую группу медленных летальных прионных инфекций, для которых характерны очень длительный инкубационный период, медленно прогрессирующее течение, дегенеративные изменения в ЦНС, отсутствие признаков воспаления и выраженного иммунного ответа и летальный исход.

Синтез прионов контролирует ген prnP, который несет у человека 20-я хромосома. Установлено 18 различный мутаций этого гена, которые связаны с различными прионовыми болезнями.

Прионы состоят из особого белка, который существует в виде двух изомеров. Один из них – нормальный клеточный прионовый протеин – изоформа PrP^C. Он состоит из 254 аминокислотных остатков и имеет м. м. 33 – 35 кД. PrP^C растворим в детергентах, чувствителен к действию протеинкиназы К. Он, как полагают, участвует в регуляции суточных циклов многих гормонов. У здоровых животных содержание его составляет 1 мкг/г ткани мозга (больше всего его в нейронах).

Другой изомер прионового протеина PrP^Sc – аномальный, имеет такую же м. м. Он отличается от PrP^C вторичной структурой, устойчив к протеолизу, не растворяется детергентами, способен к самоагрегации / олигомеризации. Конверсия PrP^C в PrP^Sc присходит очень медленно, но ускоряется в присутствии экзогенного приона. Прионы PrP^Sc – возбудители прионных медленных инфекций.

Содержание PrP^Sc в ткани мозга больных животных в 10 раз больше, чем у здоровых.

Известны 12 нозологических единиц прионных болезней, из них 6 наблюдаются у животных (скрепи у овец, губкообразные энцефалопатии крупного рогатого скота, экзотических копытных и кошачьих, хроническое истощение у лосей и трансмиссивная энцефалопатия норок). Шесть болезней прионной этиологии описаны у человека.

Ку́ру (папуасское curu – дрожать, трястись) впервые описано в 1957 г. К. Гайдушеком у папуасов-каннибалов в Новой Гвинее. Характеризуется прогрессирующей мозжечковой атаксией, общим дрожанием, адинамией, а также психическими изменениями (эйфория, беспричинный смех и т. п.).

Болезнь Крейтцфельда – Якоба (БКЯ – дегенерация кортикостриоспинальная) встречается повсеместно. Характеризуется прогрессирующей деменцией с симптомами поражения пирамидальных и экстрапирамидальных нервных путей. В 1996 г. началась эпизоотия губкообразной энцефалопатии коров («бешенство» коров) в Англии, а затем в ряде других стран Западной Европы. Она связана с нарушением природных схем питания животных: они стали получать в виде добавок к пище вещества, полученные из костей и мясных отходов овец и коров. Заражение мясом таких животных стало причиной заболевания людей БКЯ. В Англии описана новая форма БКЯ (она обозначена как VCJD). Она отличается от БКЯ тем, что ею болеют лица моложе 40 лет, а также более длительным течением и развитием нейропатологических изменений, не наблюдаемых при классическом течении болезни.

Летальная семейная бессонница – потеря сна, гиперреактивность симпатической системы, прогрессирующее ослабление автономных и эндокринных циклических временн́ых ритмов; наблюдается у лиц среднего возраста (около 45 лет).

Синдром Герстманна – Штрейслера (СГШ) – медленная инфекция. Зарегистрирована в Великобритании, США, Японии и других странах мира. Характеризуется дегенеративными поражениями ЦНС, которые проявляются в формировании губкообразного состояния, образовании амилоидных бляшек во всем мозге. Болезнь выражается в развитии медленно прогрессирующей атаксии и деменции.

Патогенез не изучен. Заболевание тянется длительно и заканчивается смертью.

Амиотрофический лейкоспонгиоз – медленная инфекция человека, характеризующаяся прогрессирующим развитием атрофических парезов мышц конечностей и туловища, нарушением дыхания и заканчивается смертью.

Синдром Альперса – медленная прионная инфекция. Наблюдается главным образом в детстве, характеризуется симптомами, свидетельствующими о поражении ЦНС.

Для прионовых болезней человека характеры 4 классических нейропатологических признака: спонгиозные изменения (множество овальных вакуолей диаметром 1 – 50 мк в сером веществе мозга), потеря нейронов, астроцитоз и формирование амилоидных бляшек.

Предполагается, что прионы играют роль в этиологии шизофрении, миопатии и некоторых других заболеваний человека. Природа прионов остается неясной. С вирусами их объединяют малые размеры (они способны проходить через бактериальные фильтры) и неспособность размножаться на искусственных питательных средах; специфический круг поражаемых хозяев; длительная персистенция в культуре клеток, полученной из тканей зараженного хозяина, а также в организме больного человека и животного. Вместе с тем они существенным образом отличаются от вирусов: во-первых, у них отсутствует собственный геном, следовательно, они не могут рассматриваться, в отличие от вирусов, как живые существа; во-вторых, они не индуцируют никакого иммунного ответа. В-третьих, прионы обладают значительно более высокой резистентностью, чем обычные вирусы, к действию высокой температуры (выдерживают кипячение в течение 1 ч), УФ-излучению, ионизирующей радиации и к различным дезинфектантам; нечувствительны к интерферонам и не индуцируют их синтеза.

По мнению С. Прузинера, есть два пути передачи аномального приона PrP^Sc: наследственный (мутации в гене prnP) и трансмиссивный, или инфекционный (алиментарный и нозокомиальный). Прионовые болезни в том и другом случае наблюдаются в виде спорадических или групповых заболеваний.

К. Гайдушек в 1976 г. за открытие инфекционной природы прионных болезней и С. Б. Прузинер в 1997 г. за открытие прионов и разработку прионной теории были удостоены Нобелевских премий.

Поскольку вирусы не растут на искусственных питательных средах, а размножаются только внутриклеточно, нужно было найти простые и общедоступные методы их культивирования. Крупным достижением было предложение Р. Гудпасчура в 1932 г. использовать для культивирования вирусов куриные эмбрионы, в клетках которых успешно размножаются многие вирусы. Однако окончательное решение проблемы их культивирования оказалось возможным лишь после того, как были разработаны основные способы культивирования клеток вне организма.

Хотя способность клеток расти вне организма была установлена еще в 1907 г., потребовалось много лет для разработки доступных методов культивирования клеток, а в них – вирусов. Вначале был использован метод переживающих тканей. Он заключался в том, что в колбу, содержащую питательную среду, вносили кусочек ткани. Клетки некоторых тканей в таких условиях могут переживать (но не размножаться) до 30 дней, а в них могут размножаться вирусы. Однако этот способ давал очень небольшой выход вирусов. Необходимо было разработать условия, при которых клетки ткани могли бы свободно размножаться. К началу второй половины ХХ в. эпидемии полиомиелита приняли настолько широкий и опасный характер, что требовалось принять немедленные меры для создания вакцины, которую можно было бы использовать для массового применения. Но для этого нужно было найти метод, позволяющий быстро выращивать вирусы в большом количестве. Это и явилось одним из обстоятельств, стимулировавших разработку методов культивирования вирусов. Для получения культур клеток, которые можно было бы использовать для выращивания вирусов, необходимо было решить четыре главных проблемы:

1) получить в необходимом количестве свободные (т. е. изолированные друг от друга) клетки;

2) создать такие питательные среды и условия, в которых клетки могли бы активно размножаться;

3) обеспечить условия, при которых в культурах клеток не могли бы размножаться бактерии;

4) определить методы, с помощью которых можно было бы распознавать рост вируса в культуре клеток и идентифицировать его.

Все эти проблемы были решены. Для выделения изолированных, но жизнеспособных клеток из разрушенных тканей использовали обработку их слабым раствором трипсина, разрушающего межклеточные мостики. Для культивирования клеток были предложены различные среды, содержащие все необходимые для размножения клеток питательные вещества (аминокислоты, основания, витамины и др.), минеральные соли, имеющие оптимальную рН и т. д. К питательным средам добавляли индикатор, по изменению цвета которого можно было судить о метаболизме клеток и их размножении. Было установлено, что в качестве основы, на которой клетки размножаются и образуют монослой, может быть использовано хорошо обработанное стекло пробирок и колб. Для подавления возможного роста бактерий вируссодержащий материал перед посевом его в культуры клеток обрабатывают антибиотиками. Решающее значение имели опыты, проведенные в 1949 г. Дж. Эндерсом, Т. Веллером и Ф. Роббинсом, которые показали, что вирус полиомиелита хорошо размножается в первично-трипсинизированных культурах клеток, полученных из почек обезьян.

Разработка способов получения культур клеток позволила широко внедрить в практическую медицину современные классические методы вирусологической диагностики инфекционных заболеваний, с одной стороны, и обеспечить накопление вирусов в количествах, достаточных для производства вакцин, с другой. Основной недостаток первично-трипсинизированных клеток заключается в том, что после нескольких пересевов они перестают размножаться. Поэтому предпочтением стали пользоваться культуры таких клеток, которые способны размножаться in vitro бесконечно долго. Такие перевиваемые культуры клеток получают из опухолевых тканей (HeLa, HEp-2 и др.) или из мутантных клеток с полиплоидным набором хромосом. Однако опухолевые клетки нельзя применять для получения вакцин. Для этих целей используют только культуры таких клеток, которые не содержат никаких контаминантных вирусов и не обладают злокачественностью. Лучше всего этим требованиям отвечают культуры диплоидных клеток. «Штаммом диплоидных клеток называется морфологически однородная культура клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами роста (стабилизации, активного роста и старения), сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая онкогенной активностью при трансплантации хомячкам» (решение Симпозиума по диплоидным клеткам, Москва, 1971).

Как оказалось, вирусы могут размножаться не только в культурах клеток, образующих монослой на стекле пробирок, но и в суспензиях живых клеток.

Таким образом, для выделения чистых культур вирусов в настоящее время используют чаще всего заражение куриных эмбрионов, первично-трипсинизированных и перевиваемых культур клеток.

Широкое распространение получил предложенный в 1952 г. Р. Дюльбекко метод бляшек (негативных колоний), позволяющий производить количественное определение вирусов (см. цв. вкл., рис. 79, 2). Для выделения вирусов монослой клеток после удаления питательной среды заражают вируссодержащим материалом и покрывают слоем агара, содержащего индикатор нейтральный красный. Чашки (флаконы) инкубируют при температуре 37 °C. Через 48 – 96 ч выявляются пятна-бляшки. Они имеют диаметр 1 – 3 мм и выглядят неокрашенными на розовом фоне. Пятна возникают за счет цитопатического действия вируса. Этот метод позволяет непосредственно обнаруживать рост вирусов.

Различают два механизма гибели клеток, вызываемой вирусами, – некроз и апоптоз. Некроз происходит из-за необратимых нарушений целостности клеточных мембран, апоптоз – вследствие фрагментации ядерной ДНК под действием клеточной эндонуклеазы. Установлено, что апоптоз играет важную роль в патогенезе инфекций, вызываемых рядом РНК-содержащих вирусов (ретровирусов, миксовирусов, альфавирусов, буньявирусов, пикорнавирусов, флавивирусов).

Цитопатическое действие вирусов может проявляться в виде следующих изменений:

1. Равномерная мелкозернистая деструкция клеток (полиовирусы, вирусы Коксаки и др.).

2. Очаговая мелкозернистая дегенерация клеток (вирус гриппа, клещевого энцефалита и др.).

3. Гроздевидная дегенерация клеток (аденовирусы).

4. Крупнозернистая равномерная деструкция клеток (вирус герпеса).

5. Симпластообразование (респираторно-синцитиальный вирус, вирус кори и другие).

О росте вирусов в клетках можно судить также по поведению индикатора, добавляемого к питательной среде. Если клетки активно осуществляют метаболизм, рН среды сдвигается в кислую сторону, и среда окрашивается в желтый цвет. В случае размножения вируса клетки погибают, рН среды мало меняется, и она сохраняет первоначальный (малиновый) цвет или (при нейтральной рН) приобретает оранжевый. Некоторые вирусы, в частности вирус гриппа, обладают особыми рецепторами (гемагглютининами), с помощью которых они адсорбируются на эритроцитах и вызывают их склеивание (гемагглютинацию). Такие вирусы легко обнаруживаются с помощью реакции гемагглютинации или гемадсорбции (эритроциты адсорбируются на инфицированных вирусами клетках культуры тканей, см. цв. вкл., рис. 79, 1). Кроме того, для обнаружения вируса в культурах клеток могут быть использованы различные серологические реакции: преципитации в агаре, иммунофлуоресценции, РСК, ИФМ и пр., а также метод ДНК-зонда и заражение животных, чувствительных к данному вирусу.

Методы идентификации (типирования) вирусов

Определение типа вируса (его идентификация) основано на нейтрализации биологической активности вируса с помощью типоспецифических сывороток. Конечный результат ее может быть установлен на основании следующих признаков:

1) нейтрализация цитопатического действия;

2) нейтрализация реакции гемадсорбции;

3) изменение проявления цветной пробы;

4) задержка (торможение) реакции гемагглютинации;

5) нейтрализация в опытах на животных.

Кроме того, для идентификации вирусов применяют методы иммунофлуоресценции, ДНК – ДНК-(РНК – РНК) – гибридизации, а также ПЦР.

Под жизненным циклом вируса понимают процесс его размножения. Он происходит только внутриклеточно. Особенности размножения зависят прежде всего от вирусного генома.

Типы вирусных геномов

Репликация вирусных геномов

Тип геномной вирусной ДНК определяет особенности ее репликации.

1. Двунитевая ДНК – репликация происходит по обычному механизму полуконсервативной репликации: нити разделяются, и на каждой из них достраивается комплементарная ей нить.

2. Однонитевая ДНК. Ее репликация происходит через образование вначале репликативной формы, а затем промежуточной репликативной формы. Репликативная форма возникает в результате синтеза на исходной вирионной ДНК («+» нити) комплементарной ей « – » нити, т. е. однонитевая ДНК превращается в двунитевую структуру ДНК. Промежуточная репликативная форма – это репликативная форма, « – » нить которой служит матрицей для синтеза «+» нити ДНК, идентичной исходной вирионной ДНК. Такой механизм обеспечивает передачу генов дочерним вирионам (рис. 80. I).

3. У вирусов, геном которых представлен однонитевой РНК, ее репликация происходит по следующей схеме: вначале на вирионной РНК (вРНК) синтезируются комплементарные ей РНК (кРНК). Этот процесс катализируется специфической РНК-репликазой I. Затем на кРНК синтезируется комплементарная ей, но идентичная исходной вирионная РНК (вРНК), этот процесс также катализируется специфической репликазой II. Таким образом, репликация идет по схеме (рис. 80. II):

4. Репликация однонитевой РНК ретровирусов происходит с участием обратной транскриптазы. Вначале на вРНК обратная транскриптаза синтезирует комплементарную ей «минус» цепь ДНК, а затем на ней – «плюс» нить ДНК. Двунитевая ДНК интегрируется в хромосому клетки и там служит матрицей для синтеза разных классов вирусных РНК. Таким образом, репликация ретровирусов происходит по схеме:

Рис. 80. Механизм репликации однонитевого вирусного ДНК-генома (I) и однонитевого вирусного РНК-генома (II):

а – геномная однонитевая ДНК; б – репликативная форма; в – промежуточная репликативная форма; г – однонитевая дочерняя геномная ДНК; вРНК – вирионная (геномная) РНК; кРНК – комплементарная РНК. Объяснение в тексте

5. Размножение вируса гепатита В также протекает с участием обратной транскриптазы, но вначале клеточная РНК-полимераза синтезирует на вирусной ДНК прегеномную РНК, после чего вирусная ревертаза синтезирует на ней минус-цепь ДНК, которая достраивается плюс-цепью ДНК. В виде двунитевой ДНК вирус интегрируется в хромосому клетки-хозяина, где на ней транскрибируется вирусная РНК.

Существуют некоторые общие закономерности размножения вирусов. Во-первых, все РНК-содержащие вирусы, кроме вирусов гриппа и ретровирусов, размножаются в цитоплазме. Для своего размножения вирусы гриппа А и В и ретровирусы проникают в ядро, что связано с особенностями поведения их генома. Во-вторых, размножение всех ДНК-содержащих вирусов, кроме вирусов оспы, протекает в ядре, где происходит транскрипция и репликация их геномных нуклеиновых кислот, и в цитоплазме, где происходит трансляция вирусных белков, их процессинг и морфогенез вирионов. Лишь размножение вирусов группы оспы происходит в цитоплазме клетки, поскольку они обладают собственными системами транскрипции.

Другая особенность размножения вирусов заключается в том, что их нуклеокапсидные белки синтезируются на свободных полирибосомах (не связанных с мембраной), а суперкапсидные белки – на рибосомах, ассоциированных с мембранами (на шероховатых мембранах). Кроме того, белки некоторых вирусов подвергаются протеолитическому процессингу и гликозилированию. Различают два типа протеолитического процессинга: каскадный и точечный.

При каскадном протеолизе вновь синтезированный вирусный полипептид-предшественник (полипротеин) подвергается последовательному «нарезанию» с образованием более коротких полипептидов, часть из которых дополнительно разрезается на более мелкие субъединицы. Ряд ступеней такого каскадного протеолиза осуществляется определенной областью самого полипротеина, обладающего протеазной активностью. Такому каскадному процессингу подвергаются белки у ретровирусов, пикорнавирусов, aльфа-, флави– и других вирусов. Для них такое протеолитическое нарезание белков является жизненно важным этапом репродукции, поскольку оно обусловливает реализацию их функций.

При точечном протеолизе разрезанию подвергается один (реже несколько) из вирусных полипептидов. Разрезание происходит, как правило, в определенном участке полипептида. Такой тип протеолиза необходим для того, чтобы определенный белок вируса приобрел свою специфическую активность. Например, суперкапсидный белок вируса гриппа – гемагглютинин – разрезается на две субъединицы: боEльшую и меньшую. В результате меньшая субъединица приобретает способность сливаться с мембранами клетки-мишени и ее лизосомами. Благодаря этому вирус гриппа приобретает способность проникать в клетку. Такой точечный протеолиз наблюдается у ортомиксовирусов, парамиксовирусов, ротавирусов, вирусов группы оспы и др. Точечный протеолиз, как и каскадный, жизненно важен для вируса.

Наконец, еще одна особенность вирусов, обладающих суперкапсидом, заключается в том, что суперкапсидные белки подвергаются в ходе своей транспортировки на наружную поверхность клеточной мембраны гликозилированию.

Механизм взаимодействия вируса с клеткой

Внутриклеточное размножение

Проникнув в клетку, вирусный геном полностью подчиняет жизнь клетки своим интересам и с помощью ее белоксинтезирующей системы и систем генераций энергии осуществляет собственное воспроизводство, очень часто ценой жизни клетки. В качестве примера на рис. 81 представлена схема жизненного цикла вируса леса Семлики, одного из представителей рода Alphavirus. Геном этого вируса – однонитевая позитивная нефрагментированная РНК. Вирион имеет суперкапсид, состоящий из липидного бислоя, через который проходят 240 копий гликопротеиновых комплексов, образующих на поверхности суперкапсида шипы. Капсид имеет форму икосаэдра (20 граней). Вирус входит в клетку, используя один из вариантов эндоцитоза, и далее по схеме: окаймленная ямка → окаймленный пузырек → эндосома → лизосома. В лизосоме происходит слияние примыкающих друг к другу липидных бислоев суперкапсида вириона и мембраны лизосомы, и нуклеокапсид выходит в цитозоль клетки. Здесь разрушается нуклеокапсид, и освобожденная геномная РНК транслируется на рибосомах клетки-хозяина, в результате чего синтезируется вирусспецифическая РНК-полимераза (репликаза), которая осуществляет многократную репликацию вРНК. В свою очередь молекула родительской вРНК и вновь синтезированные ее копии служат в качестве матриц, направляющих синтез четырех структурных белков вируса: С-белка капсида и трех белков (Е1, Е2 и Е3) суперкапсида. Синтез капсидного белка осуществляют свободные полирибосомы цитозоля, вновь синтезированный капсидный белок ассоциирует с реплицированными копиями вРНК, в результате чего формируются нуклеокапсиды. Суперкапсидные белки синтезируются на рибосомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума, включаются в мембрану и там гликозилируются, с помощью плотов переносятся в мембрану аппарата Гольджи, где они подвергаются дополнительному гликозилированию, после чего опять с помощью плотов поступают на наружную поверхность клеточной мембраны, вытесняя здесь клеточные белки. Заключительный этап морфогенеза вируса заключается в том, что нуклеокапсид, проходя через клеточную мембрану, обволакивается участком мембраны и встроенными в нее в этом месте вирусспецифическими суперкапсидными белками, после чего отпочковывается от клетки, отделяясь от ее поверхности так, что оказывается окруженным замкнутой внешней оболочкой (суперкапсидом).

Рис. 81. Схема жизненного цикла вируса леса Семлики (геном – однонитевая позитивная РНК, вирион имеет суперкапсид, относится к альфа-вирусам)

Типы вирусных инфекций

Взаимодействие вируса с клеткой может протекать по-разному и приводить к различным клиническим проявлениям. В зависимости от продолжительности пребывания вируса в организме различают две группы вирусных инфекций:

1. Вирусные инфекции, связанные с непродолжительным пребыванием вируса в организме.

2. Вирусные инфекции, обусловленные длительным пребыванием (персистенцией) возбудителя в организме.

В случае непродолжительного пребывания вируса в организме заболевание протекает либо в форме острой инфекции, либо в виде бессимптомной (инаппарантной) инфекции. Острая инфекция, как правило, заканчивается выздоровлением, формированием приобретенного иммунитета и освобождением организма от возбудителя. Бессимптомная инфекция протекает без каких-либо проявлений и заканчивается также формированием иммунитета и освобождением от возбудителя.

Вирусные инфекции, обусловленные длительным пребыванием возбудителя в организме, подразделяют на латентные, хронические и медленные инфекции.

Латентные инфекции протекают бессимптомно и могут сопровождаться либо нормальной репродукцией вируса во внешне здоровом организме и выделением его во внешнюю среду, либо сопровождаться вирусоносительством, при котором нарушен нормальный цикл вирусной репродукции и вирус длительно персистирует в организме.

Хронические вирусные инфекции характеризуются периодическими состояниями выздоровления и рецидивов (обострений).

Термин «медленные инфекции» был предложен исландским микробиологом Б. Сигурдсоном в 1954 г. для вирусных заболеваний, характеризующихся продолжительным (иногда в течение многих лет) инкубационным периодом, длительным прогрессирующим течением болезни и заканчивающихся тяжелыми расстройствами или, чаще, смертью. Типичным примером медленных инфекций является СПИД. В основе развития медленных инфекций лежат нарушения генетических, иммунологических и физиологических механизмов, которые обеспечивают длительную персистенцию возбудителя в организме.

Как оказалось, медленные инфекции могут вызывать и такие вирусы, которые обычно вызывают острые инфекции (например, вирусы кори, бешенства и др.). Так, вирус кори оказался возбудителем такой тяжелой медленной инфекции, как подострый склерозирующий панэнцефалит.

Известны несколько механизмов, которые обусловливают длительное переживание вируса в организме: 1) вирус находится в дефектном состоянии, он не способен размножаться и индуцировать эффективный иммунный ответ; 2) вирус находится в клетке в виде свободной геномной нуклеиновой кислоты, не доступной действию антител; 3) геном вируса интегрирован в хромосому клетки-мишени.

Персистенция вирусов столь часто наблюдается в клетках различных организмов, что это дало основание В. Д. Тимакову сформулировать следующее положение: «Состояние вирусного носительства является, пожалуй, наиболее распространенной и общей формой взаимодействия вируса с клеткой, а острое вирусное заболевание – лишь проявлением нарушения этого характерного равновесия».

Бактериофаги (ныне просто фаги) – вирусы бактерий. Бактериофагия – процесс взаимодействия фагов с бактериями, заканчивающийся очень часто их разрушением (лат. bacteriophaga – пожирающий бактерии).

Явление бактериофагии наблюдали многие ученые, но приоритет открытия фагов (1916) принадлежит Ф. Д’Эреллю – канадскому ученому, работавшему в Париже в Институте Пастера. Занимаясь изучением дизентерии, Феликс Д’Эрелль задумался над вопросом: почему возбудитель этой болезни, высевающийся в ее начале в большом количестве, в конце заболевания очень часто перестает выделяться? Заподозрив здесь действие какого-то агента, Д’Эрелль решил его обнаружить. С этой целью к свежей бульонной культуре дизентерийной палочки он стал добавлять по нескольку капель фильтрата испражнений больного. После одного из таких посевов Д’Эрелль и обнаружил этот агент по его способности разрушать дизентерийные бактерии. При добавлении к мутной бульонной культуре он вызвал ее просветление, а при добавлении к культуре, засеянной на плотную среду, появлялись прозрачные (стерильные) пятна – колонии. Способность вызывать такие пятна и размножаться при повторных посевах дали основание считать его живым корпускулярным агентом. Д’Эрелль назвал его Baсteriophagum intestinale, т. е. выделенный из кишечника пожиратель бактерий. Последующие наблюдения показали, что бактериофаги распространены повсеместно. Они встречаются всюду, где есть бактерии, – в почве, воде, кишечном тракте человека и животных, гнойных выделениях и т. п. Особенно много фагов в сточных водах; из этого источника можно выделить практически любой фаг. Поскольку естественной средой обитания любого фага является микробная клетка, жизнь фагов связана с бактериями. Фагам присущи все биологические особенности, которые свойственны вирусам. Их геном представлен либо ДНК, либо РНК и заключен в белковую оболочку (капсид), структурные субъединицы которой уложены по типу либо спиральной, либо кубической симметрии. Крупные фаги, имеющие хвостик, устроены по типу бинарной симметрии (головка – икосаэдр, хвостик – спиральная симметрия). Фаги различаются по форме – нитевидные, сферические; фаги, имеющие головку и хвостик; по размерам – мелкие, среднего размера и крупные (рис. 82). Чем крупнее фаги, тем больше у них генов и сложнее их жизненный цикл. К самым маленьким относятся фаги M13 и φX174.

Фаг М13 – нитевидный, геном – однонитевая кольцевидная молекула ДНК с м. м. 2 МД, содержит 8 генов. Оболочка в виде нити, состоит из 3000 белковых субъединиц, уложенных по спирали. Длина вириона 1000 нм, его диаметр 6 нм.

Фаг φX174 – икосаэдр с м. м. 6,2 МД, диаметр 25 нм. Геном – однонитевая кольцевидная молекула ДНК, состоящая из 5400 нуклеотидов, несет 9 генов. Капсид построен из 60 молекул белка F, вирион имеет 12 вершин, на каждой из них вмонтирован шип, содержащий 5 молекул белка G и одну молекулу Н-белка (белок-лоцман). Наиболее сложно устроены крупные фаги, состоящие из головки и хвостика. У энтеробактерий обнаружено более 500 фагов, из них более 140 состоят из головки и хвостика.

Фаг Т2 паразитирует у E. coli и имеет следующую структуру (рис. 83): головка – икосаэдр, геном представлен двунитевой линейной ДНК, несущей около 200 генов. Головка с помощью воротника и зонтика связана с хвостиком, который имеет сложное строение – полый внутри стержень, заканчивающийся шестиугольной пластинкой с шестью шипами. Хвостик имеет белковый чехол, который состоит из 144 субъединиц, образующих 24 спирали; каждая белковая молекула содержит одну молекулу АТФ-азы и ион Ca²⁺. Белок актиноподобный и способен сокращаться. В пластинке и шипах содержится лизоцим. Кроме того, хвостик имеет 6 ворсинок. У неактивного фага они свернуты и сложноэфирными связями прикреплены к белкам чехла. В момент адсорбции ворсинки раскрываются и обеспечивают плотное прикрепление фага к бактериальной клетке. Основное назначение хвостика – обеспечение адсорбции фага на клетке. Длина хвостика сильно варьирует. В тех случаях, когда хвостик содержит белковый чехол, последний, благодаря своему сокращению, обеспечивает проникновение стержня через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану.

Рис. 82. Различные формы фаговых вирионов (по Г. Шлегелю, 1972):

1 – нитевидная форма (фаг fd); 2 – гексагональная головка с отростком и сократительным чехлом (фаги Т2, Т4, Т6); 3 – гексагональная головка с длинным, не способным к сокращению хвостиком; 4 – головка с коротким отростком (фаги Т3, Т7); 5 – октаэдр; 6 – икосаэдр

Резистентность фагов. По степени устойчивости к действию различных факторов внешней среды и химических веществ фаги занимают место между вирусами и неспоровыми бактериями. Они устойчивы в пределах рН от 5,0 до 8,0, большинство из них не инактивируется холодными водными растворами глицерина и этилового спирта. На них не действуют такие ферментные яды, как цианид, фторид, динитрофенол, а также хлороформ и фенол. Фаги хорошо сохраняются в запаянных ампулах и в лиофилизированном состоянии, но они легко разрушаются при кипячении, действии кислот, химических дезинфектантов, при УФ-облучении.

Рис. 83. Схема строения бактериофага Т2:

1 – до инъекции фаговой ДНК; 2 – после инъекции. Объяснение в тексте

Жизненный цикл фага

Различают фаги инфекционные, т. е. способные вызвать разные формы фаговой инфекции, и неинфекционные (вегетативные), или незрелые, фаги, находящиеся еще в стадии размножения. В свою очередь инфекционные фаги разделяют на покоящиеся (находящиеся вне клетки), вирулентные – способные вызвать продуктивную форму инфекции, и умеренные фаги – способные вызывать не только продуктивную, но и редуктивную фаговую инфекцию.

Жизненный цикл фага может проявляться в форме продуктивной (фаг размножается в клетке и выходит из нее), редуктивной (геном фага проникает в клетку, однако размножения фага не происходит, его геном интегрируется в хромосому клетки-хозяина, становится ее составной частью, т. е. фаг превращается в профаг, а клетка становится лизогенной) и абортивной инфекции, при которой взаимодействие фага с клеткой обрывается на какой-то стадии жизненного цикла фага, и он погибает.

Клетка, несущая профаг, называется лизогенной, потому что профаг, передающийся клеткой по наследству, может выйти из хромосомы, активироваться и вызвать продуктивную форму инфекции.

Если в результате лизогении, т. е. внедрения профага в хромосому клетки-хозяина, она получает новые наследуемые признаки, такую форму ее изменчивости называют лизогенной конверсией, т. е. изменчивостью, обусловленной лизогенией. Лизогенную конверсию вызывают только умеренные фаги.

Жизненный цикл фага, сопровождающийся продуктивной инфекцией, складывается из шести последовательных стадий, каждая из которых, в свою очередь, состоит из нескольких этапов.

1. Адсорбция фагов на клеточной поверхности бактерий при помощи специфических рецепторов (белков-лоцманов), которые располагаются на кончике нити, шипа или хвостика. В свою очередь, на клеточной стенке бактерии располагаются ее фагоспецифические рецепторы, распознаваемые фагом. Адсорбция фага – пусковой момент его жизненного цикла. Она очень специфична и поэтому обусловливает возможность практического использования фагов, например для идентификации бактерий, а также для лечебных и профилактических целей.

2. Проникновение фагового генома через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану внутрь клетки и освобождение его от оболочки (раздевание фага).

3. Установление фагового генома с помощью белка-лоцмана для реализации содержащейся в геноме информации:

а) однонитевая ДНК – к репликативному аппарату для синтеза комплементарной ей нити и образования репликативной формы; далее ее поведение аналогично двунитевой ДНК;

б) двунитевая ДНК – к транскрипционному аппарату для синтеза мРНК и последующей трансляции вирусспецифических белков (ферментов и структурных);

в) РНК-геном – к трансляционному аппарату для синтеза вирусспецифических белков (ферментов репликации и структурных).

4. Репликация фаговой геномной ДНК или РНК.

5. Сборка вновь синтезированных вирионов – заключение геномной НК в белковую оболочку, морфогенез фагов.

6. Выход вновь синтезированных фагов из клетки:

а) путем отпочковывания (М13 – единственный фаг, не вызывающий при выходе из клетки ее гибели);

б) путем лизиса клетки изнутри. Он осуществляется свободным лизоцимом и вызывает гибель клетки.

Степень зависимости репликации ДНК фага от хромосомы клетки определяется набором генов у фагов. Крупные фаги, например Т4, осуществляют репликацию полностью автономно; средние – Т7 – частично нуждаются в помощи бактериальных генов, а мелкие (М13, φX174) почти полностью зависят от хромосомных генов.

Жизненный цикл фага Т4 протекает следующим образом. С помощью своего хвостика фаг распознает специфический для него рецептор на поверхности клеточной стенки бактерий (чаще всего липополисахаридной природы) и прикрепляется к нему. Эта фаза адсорбции обратима, но затем, когда ворсинки раскрываются и плотно прикрепляют фаг к клеточной стенке, она становится необратимой. Пластинка со своими шипами прикрепляется к стенке, содержащийся в них лизоцим вызывает в месте контакта лизис клеточной стенки. Одновременно ионы Ca²⁺ активируют содержащуюся в белках чехла аденозинтрифосфатазу (АТФазу), и чехол сокращается. Его длина уменьшается в 2 раза, количество витков также уменьшается в 2 раза: вместо 24 их становится 10 – 12 (см. рис. 83). В результате сокращения чехла внутренний стержень прокалывает клеточную стенку в участке, разрушенном лизоцимом, и цитоплазматическую мембрану. Прокалывание происходит в участках напротив зон адгезии цитоплазматической мембраны и нижнего слоя пептидогликана. Таких зон около 200 – 300, их размер 20 – 30 нм.

Внедрение фаговой ДНК в клетку происходит с помощью следующих механизмов:

а) около 10 % ее активно впрыскивается во время сокращения чехла хвостика;

б) остальная часть фаговой ДНК втягивается в цитоплазму бактерий благодаря процессам транскрипции и работе трансляционного аппарата.

Внутриклеточное размножение фага Т2 происходит в такой последовательности: уже через 1 мин синтезируются ранние мРНК, кодирующие белки, необходимые для репликации фаговой ДНК; через 5 мин начинается репликация ДНК; затем – синтез мРНК, необходимых для образования структурных белков фага и его морфогенеза, а через 13 мин в клетке появляются первые вирионы. Процесс синтеза ДНК, белков и морфогенез фагов продолжается далее: из одного фага в клетке синтезируется 200 – 300 новых вирионов.

Особенности морфогенеза фагов. Морфогенез мелких фагов протекает по типу самосборки. У крупных фагов этот процесс носит более сложный характер. Например, морфогенез фага Т4 требует активности более чем 40 генов и протекает при участии трех самостоятельных линий. На одной из них происходит сборка хвостика (участвует около 20 генов), на другой – головки фага (не менее 16 генов) и на третьей – сборка ворсинок (5 генов). Соединение хвостика с головкой не требует участия генов, однако оно не может произойти до тех пор, пока и хвостик, и головка не будут смонтированы полностью. Точно так же ворсинки могут присоединяться к хвостику только после того, как он соединится с полностью готовой головкой. Благодаря строгому генетическому контролю со стороны фага обеспечивается последовательность и согласованность всех процессов его внутриклеточного размножения.

Выход сформировавшихся фагов в большинстве случаев происходит благодаря лизису изнутри свободным лизоцимом. Он синтезируется на самом последнем этапе размножения фага. Иногда бывает лизис бактерий извне как следствие адсорбции многих фагов на одной клетке, но при этом размножения фагов не происходит.

Обычно же после внедрения фагового генома в клетку у нее возникает состояние иммунитета к суперинфекции данным фагом, т. е. проникновение других фаговых геномов становится невозможным. Иммунитет обеспечивается особым цитоплазматическим репрессором.

Редуктивная инфекция

Ее вызывают только умеренные фаги. В этом случае их жизненный цикл складывается из следующих стадий:

а) адсорбция фага на поверхности клетки;

б) проникновение фаговой ДНК в бактериальную клетку;

в) сайт-специфическая интеграция фаговой ДНК в хромосому клетки-хозяина и превращение фага в профаг.

Если первые две стадии протекают так же, как в случае продуктивной инфекции, то третья требует участия дополнительных фаговых и хозяйских генов.

Механизм интеграции фаговой ДНК в хромосому бактериальной клетки лучше всего изучен на примере фага λ (лямбда). Фаг состоит из головки и хвостика. Его геном представлен двунитевой линейной ДНК, имеющей «липкие» концы (избыточные нуклеотидные последовательности на противоположных концах нитей, комплементарные друг другу), поэтому она может переходить в кольцевую структуру, необходимую для ее включения в хромосому клетки-хозяина. ДНК фага λ имеет м. м. около 30 МД, содержит 46 500 нуклеотидных пар и несет 32 гена, 7 из которых кодируют головку, 11 – хвостик, а остальные играют регуляторную роль.

Фаг λ включается в хромосому E. coli между генами gal и bio с помощью сайт-специфической рекомбинации. Она оказывается возможной потому, что ДНК фага имеет особый участок – attP (англ. attachment phage – прикрепление фага). Такой же участок имеется и в хромосоме E. coli – attB. Он расположен между генами gal и bio. Участки att имеют сложную структуру и состоят из 250 нуклеотидов. В результате рекомбинации между attP и attB, протекающей по механизму кроссинговера, фаговая ДНК оказывается включенной в хромосому, причем слева она фланкирована участком attL (англ. left – левый), а справа – attR (англ. right – правый), которые образуются вследствие рекомбинации между attP и attB. Рекомбинация протекает с участием генов red фага и recA – бактерии. Для интеграции требуется также белок фага – продукт гена int (интеграза) и особый хозяйский белок интеграции. Таким образом, геном фага, интегрируясь в хромосому, превращается в профаг, а клетка становится лизогенной. Выходу профага из хромосомы препятствует цитоплазматический репрессор, который наделяет клетку одновременно иммунитетом против повторного инфицирования данным фагом. Синтез репрессора контролируется фагом. Однако профаг спонтанно или под воздействием различных факторов (химические вещества, облучение УФ, рентгеновскими лучами, повышенная температура) может выходить из хромосомы клетки и вызывать продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом клетки и выходом из нее вновь синтезированных вирионов. Механизм выхода (исключение фага) из хромосомы состоит в том, что происходит рекомбинация между attL и attR, в результате которой восстанавливаются attP и attB, а фаговая ДНК принимает кольцевидную структуру и исключается из хромосомы. Процесс выхода требует участия, помимо указанных выше белков, еще одного белка – продукта фагового гена xis (ген эксцизии, исключения).

Умеренные фаги играют важную роль в обмене генетическим материалом между бактериями. Этот процесс получил название трансдукции. Различают общую (генерализованную, или неспецифическую) и специфическую трансдукцию.

Общая трансдукция

Механизм ее заключается в том, что в процессе внутриклеточного размножения фага в его головку может быть случайно включен вместо фаговой ДНК фрагмент бактериальной ДНК, равный по длине фаговой. Это вполне возможно, так как в инфицированной клетке биосинтез ее ДНК блокирован, а сама ДНК подвергается распаду. Таким образом в процессе репродукции фага возникают дефектные вирионы, у которых в головках вместо собственной геномной ДНК содержится фрагмент ДНК бактерии. Такие фаги сохраняют инфекционные свойства. Они адсорбируются на бактериальной клетке, вводят в нее ДНК, содержащуюся в головке, но при этом размножения фага не происходит. Введенная в клетку реципиента донорная ДНК (фрагмент хромосомы донора), если она содержит гены, отсутствующие у реципиента, наделяет его новым признаком. Этот признак будет зависеть от того, какой ген (гены) попал в головку трансдуцирующего фага. В случае рекомбинации привнесенного фагом фрагмента ДНК донора с хромосомой клетки-реципиента этот признак наследственно закрепляется.

Специфическая трансдукция

Отличается от неспецифической тем, что в этом случае трансдуцирующие фаги всегда переносят только определенные гены, а именно, те из них, которые располагаются в хромосоме лизогенной клетки слева от attL или справа от attR. Специфическая трансдукция всегда связана с интеграцией умеренного фага в хромосому клетки-хозяина. При выходе (исключении) из хромосомы профаг может захватить ген с левого или правого фланга, например или gal, или bio. Но в этом случае он должен лишиться такого же размера своей ДНК с противоположного конца, чтобы ее общая длина оставалась неизменной (иначе она не может быть упакована в головку фага). Поэтому при такой форме исключения образуются дефектные фаги: λdgal или λdbio.

Специфическую трансдукцию у E. coli осуществляет не только фаг лямбда, но и родственные ему лямбдоидные и другие фаги. В зависимости от места расположения сайтов attB на хромосоме они при своем исключении могут включать различные бактериальные гены, сцепленные с профагом, и трансдуцировать их в другие клетки. Встраивающийся в геном материал может замещать до ¹/₃ генетического материала фага.

Трансдуцирующий фаг в случае инфицирования реципиентной клетки интегрируется в ее хромосому и привносит в нее новый ген (новый признак), опосредуя не только лизогенизацию, но и лизогенную конверсию.

Таким образом, если при неспецифической трансдукции фаг является только пассивным переносчиком генетического материала, то при специфической фаг включает этот материал в свой геном и передает его, лизогенизируя бактерии, реципиенту. Однако лизогенная конверсия может произойти и в том случае, если геном умеренного фага содержит такие собственные гены, которые у клетки отсутствуют, но отвечают за синтез существенно важных белков. Например, способностью вырабатывать экзотоксин обладают только те возбудители дифтерии, в хромосому которых интегрирован умеренный профаг, несущий оперон tox. Он отвечает за синтез дифтерийного токсина. Иначе говоря, умеренный фаг tox вызывает лизогенную конверсию нетоксигенной дифтерийной палочки в токсигенную.

Фаги размножаются только за счет паразитирования в микробной клетке. Их размножение в бульонной культуре приводит к тому, что культура, бывшая перед добавлением фага мутной, через несколько часов инкубации при температуре 37 °C становится прозрачной. На плотных средах фаги обнаруживают либо с помощью спот-теста (англ. spot – пятно), либо методом агаровых слоев, предложенным А. Грациа (1936). В первом случае на поверхность агара в чашке засевают культуру, а затем на нее наносят каплю содержащего фаг материала. Если в нем содержится много вирионов, то на месте нанесения капли будет большое стерильное пятно (рис. 84, 1).

Метод агаровых слоев заключается в следующем. Вначале в чашку наливают слой питательного агара. После застывания на этот слой добавляют 2 мл расплавленного и охлажденного до 45 °C агара 0,7 %-ного, в который предварительно добавляют каплю концентрированной суспензии бактерий и определенный объем суспензии фага. После того как верхний слой застынет, чашку помещают в термостат. Бактерии размножаются внутри мягкого слоя агара, образуя сплошной непрозрачный фон, на котором хорошо видны колонии фага в виде стерильных пятен (рис. 84, 2). Каждая колония образуется за счет размножения одного исходного фагового вириона. Применение этого метода позволяет: а) путем подсчета колоний точно определить количество жизнеспособных фаговых вирионов в данном материале;

б) по характерным признакам (размер, прозрачность и др.) изучать наследственную изменчивость у фагов.

По спектру своего действия на бактерии фаги подразделяются на поливалентные (лизируют родственные бактерии, например поливалентный сальмонеллезный фаг лизирует почти все сальмонеллы), монофаги (лизируют бактерии только одного вида, например фаг Vi-I лизирует только возбудителей брюшного тифа) и типоспецифические фаги, которые избирательно лизируют отдельные варианты бактерий внутри вида. С помощью таких фагов производится наиболее тонкая дифференциация бактерий внутри вида, с разделением их на фаговарианты. Например, с помощью набора фагов Vi-II возбудитель брюшного тифа делится более чем на 100 фаговариантов. Поскольку чувствительность бактерий к фагам является относительно стабильным признаком, связанным с наличием соответствующих рецепторов, фаготипирование имеет важное диагностическое и эпидемиологическое значение.

Рис. 84. Обнаружение бактериофагов в исследуемом материале:

1 – спот-тест; 2 – титрование по Грациа

Практическое применение фагов

Благодаря своему разрушающему (литическому) действию на бактерии фаги могут быть использованы с лечебно-профилактической целью при различных заболеваниях (дизентерия, холера, различные гнойно-воспалительные заболевания и т. д.). Наборы стандартных фагов, в том числе международные, используются для фаготипирования возбудителей ряда болезней (холеры, брюшного тифа, сальмонеллезов, дифтерии, стафилококковых и других заболеваний). Фаги широко используют для изучения генетики микроорганизмов.

Возбудителями заболеваний дыхательных путей могут быть различные виды бактерий (в том числе Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus, Klebsiella, Coxiella burnetii, Mycoplasma и др.), а также вирусы. Инфекции, вызываемые вирусами, принято называть острыми респираторными заболеваниями (ОРЗ). По частоте они занимают первое место среди всех заболеваний. Каждый человек в течение жизни неоднократно болеет ОРЗ. Причин этому несколько: большое количество вирусов – возбудителей ОРЗ (более 130); отсутствие перекрестного иммунитета между ними; отсутствие против многих из них эффективных вакцин; наипростейший способ заражения (воздушно-капельным путем), обусловливающий быстрое распространение возбудителя, которое при отсутствии иммунитета может стать причиной не только эпидемий, но и пандемий.

Возбудителями ОРЗ являются следующие вирусы:

1. Вирусы гриппа А, В, С (Оrthomyxoviridae).

2. Парамиксовирусы (Paramyxoviridae) – это семейство включает три рода: Рaramyxovirus – вирусы парагриппа человека (ВПГЧ) 1, 2, 3, 4-го типов, болезни Ньюкасл, парагриппа птиц и паротита; Pneumovirus – респираторно-синцитиальный вирус (RS-вирус); Morbillivirus – вирус кори.

3. Респираторные коронавирусы (Coronaviridae).

4. Респираторные реовирусы (Reoviridae).

5. Пикорнавирусы (Picornaviridae). Из этого семейства собственно возбудителями ОРЗ являются риновирусы (Rhinovirus, более 100 серовариантов), а также некоторые сероварианты вирусов Коксаки и ЕСНО (Enterovirus).

Все перечисленные пять семейств относятся к РНК-содержащим вирусам. 6. Респираторные аденовирусы (Adenoviridae), их геном представлен ДНК.

Возникает вопрос: почему столь большое количество разнообразных вирусов может поражать эпителиальные клетки слизистой оболочки дыхательных путей (главным образом верхних) и глаза? Ответ на этот вопрос может быть только один: мембраны этих клеток несут множество разнообразных рецепторов, с которыми взаимодействуют разнообразные рецепторы вирусов. Только после специфической адсорбции на клетке вирус может в нее проникнуть и вызвать заболевание.

По частоте, с которой они вызывают ОРЗ, вирусы можно расположить в следующей последовательности в порядке убывания: риновирусы, коронавирусы, RS-вирус, вирусы парагриппа, аденовирусы, вирус гриппа. Однако по масштабу вызываемых вспышек и по ущербу, который они наносят здоровью человека и экономике, первое место занимают вирусы гриппа. Грипп и гриппоподобные болезни ответственны за 90 % всей инфекционной заболеваемости в мире и в России.

Вирусы гриппа

Вирус гриппа А

Вирион имеет сферическую форму и диаметр 80 – 120 нм, его молекулярная масса 250 МД. Геном вируса представлен однонитевой фрагментированной (8 фрагментов) негативной РНК с общей м. м. 5 МД. Тип симметрии нуклеокапсида спиральный. Вирион имеет суперкапсид (мембрану), содержащий два гликопротеида – гемагглютинин и нейраминидазу, которые выступают над мембраной в виде различных шипов (рис. 85). Гемагглютинин имеет структуру тримера с м. м. 225 кД; м. м. каждого мономера 75 кД. Мономер состоит из меньшей субъединицы с м. м. 25 кД (НА2) и большей – с м. м. 50 кД (НА1).

Рис. 85. Схема строения вириона вируса гриппа А:

1 – спираль РНП; 2 – белки РВ1, РВ2, РА; 3 – гемагглютинин; 4 – липидный бислой; 5 – нейраминидаза; 6 – матриксный белок; 7, 8 – мономер и тример гемагглютинина; 9, 10 – мономер и тетрамер нейраминидазы

Основные функции гемагглютинина:

1) распознает клеточный рецептор – мукопептид, имеющий N-ацетилнейраминовую (сиаловую) кислоту;

2) обеспечивает слияние мембраны вириона с мембраной клетки и мембранами ее лизосом, т. е. отвечает за проникновение вириона в клетку;

3) определяет пандемичность вируса (смена гемагглютинина – причина пандемий, его изменчивость – эпидемий гриппа);

4) обладает наибольшими протективными свойствами, отвечая за формирование иммунитета.

У вирусов гриппа А человека, млекопитающих и птиц обнаружено 13 различающихся по антигену типов гемагглютинина, которым присвоена сквозная нумерация (от Н1 до Н13).

Нейраминидаза (N) является тетрамером с м. м. 200 – 250 кД, каждый мономер имеет м. м. 50 – 60 кД. Ее функции: 1) обеспечение диссеминации вирионов путем отщепления нейраминовой кислоты от вновь синтезированных вирионов и мембраны клетки; 2) совместно с гемагглютинином определение пандемических и эпидемических свойств вируса. У вируса гриппа А обнаружено 10 различных вариантов нейраминидазы (N1 – N10).

Нуклеокапсид вириона состоит из 8 фрагментов вРНК и капсидных белков, образующих спиралевидный тяж. На 3'-концах всех 8 фрагментов вРНК имеются одинаковые последовательности из 12 нуклеотидов. 5'-концы каждого фрагмента также имеют одинаковые последовательности из 13 нуклеотидов. 5'– и 3'-концы частично комплементарны друг другу. Это обстоятельство, очевидно, позволяет осуществлять регуляцию транскрипции и репликации фрагментов. Каждый из фрагментов транскрибируется и реплицируется самостоятельно. С каждым из них прочно связаны четыре капсидных белка: нуклеопротеид (NP), он выполняет структурную и регуляторную роль; белок РВ1 – транскриптаза; РВ2 – эндонуклеаза и РА – репликаза. Белки РВ1 и РВ2 обладают основными (щелочными) свойствами, а РА – кислотными. Белки РВ1, РВ2 и РА образуют полимер. Нуклеокапсид окружен матриксным белком (М1-белком), который играет ведущую роль в морфогенезе вириона и защищает вирионную РНК. Белки М2 (кодирует одна из рамок считывания 7-го фрагмента), NS1 и NS2 (кодируются восьмым фрагментом вРНК, который имеет, как и седьмой фрагмент вРНК, две рамки считывания) синтезируются в ходе репродукции вируса, но в его структуру не входят.

Жизненный цикл вируса. Адсорбция вируса на мембране клетки происходит благодаря взаимодействию его гемагглютинина с мукопептидом. Затем вирус проникает в клетку с помощью одного из двух механизмов: 1) слияние мембраны вириона с мембраной клетки или 2) по пути окаймленная ямка – окаймленный пузырек – эндосома – лизосома – слияние мембраны вириона с мембраной лизосомы – выход нуклеокапсида в цитозоль клетки. Второй этап «раздевания» вириона (разрушение матриксного белка) происходит на пути к ядру. Особенность жизненного цикла вируса гриппа заключается в том, что для транскрипции его вРНК необходима затравка. Дело в том, что вирус не может сам синтезировать «шапочку», или кэп (англ. cap) – особый участок на 5'-конце мРНК, состоящий из метилированного гуанина и 10 – 13 прилежащих нуклеотидов, который необходим для распознавания мРНК рибосомой. Поэтому он с помощью своего белка РВ2 откусывает шапочку от клеточной мРНК, а так как синтез мРНК в клетках происходит только в ядре, вирусная РНК должна обязательно проникнуть сначала в ядро. Она проникает в него в виде рибонуклеопротеида, состоящего из 8 фрагментов РНК, связанных с белками NP, PB1, PB2 и PA. Теперь жизнь клетки полностью подчиняется интересам вируса, его репродукции.

Особенность транскрипции. В ядре на вРНК синтезируются три типа вирусспецифических РНК: 1) позитивные комплементарные РНК (мРНК), используемые в качестве матриц для синтеза вирусных белков; они содержат на 5'-конце шапочку, отщепленную от 5'-конца клеточной мРНК, а на 3'-конце – поли-А-последовательность; 2) полноразмерная комплементарная РНК (кРНК), которая служит матрицей для синтеза вирионных РНК (вРНК); на 5'-конце кРНК шапочки нет, на 3'-конце отсутствует поли-А-последовательность; 3) негативная вирионная РНК (вРНК), являющаяся геномом для вновь синтезированных вирионов.

Немедленно, еще до завершения синтеза, вРНК и кРНК вступают в ассоциацию с капсидными белками, которые поступают в ядро из цитозоля. Однако в состав вирионов включаются только рибонуклеопротеиды, связанные с вРНК. Рибонуклеопротеиды, содержащие кРНК, не только не попадают в состав вирионов, но даже не покидают ядро клетки. Вирусные мРНК поступают в цитозоль, где и транслируются. Вновь синтезированные молекулы вРНК после ассоциации с капсидными белками мигрируют из ядра в цитозоль.

Особенности трансляции вирусных белков. Белки NP, PB1, PB2, PA и M синтезируются на свободных полирибосомах. Белки NP, PB1, PB2 и PA после синтеза из цитозоля возвращаются в ядро, где и связываются с вновь синтезированной вРНК, а затем в виде нуклеокапсида возвращаются в цитозоль. Белок матриксный после синтеза движется к внутренней поверхности клеточной мембраны, вытесняя из нее в этом участке клеточные белки. Белки H и N синтезируются на рибосомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума, транспортируются по ним, подвергаясь гликозилированию, и устанавливаются на внешней поверхности клеточной мембраны, образуя шипы как раз напротив белка М, расположенного на ее внутренней поверхности. Белок Н подвергается в ходе процессинга разрезанию на НА1 и НА2.

Заключительный этап морфогенеза вириона контролируется М-белком. С ним взаимодействует нуклеокапсид; он, проходя через мембрану клетки, покрывается вначале М-белком, а затем клеточным липидным слоем и суперкапсидными гликопротеидами Н и N. Жизненный цикл вируса занимает 6 – 8 ч и завершается отпочковыванием вновь синтезированных вирионов, которые способны атаковать другие клетки ткани.

Устойчивость вируса во внешней среде невелика. Он легко разрушается при нагревании (при 56 °C в течение 5 – 10 мин), под действием солнечного и УФ-света и легко обезвреживается дезинфицирующими веществами.

Эпидемиология. Источник инфекции – человек, больной или носитель, редко животные (домашние и дикие птицы, свиньи). Заражение от людей происходит воздушно-капельным путем, инкубационный период очень короткий (1 – 2 сут.), поэтому эпидемия распространяется очень быстро и может при отсутствии коллективного иммунитета перерасти в пандемию. Иммунитет – основной регулятор эпидемий гриппа. По мере нарастания коллективного иммунитета эпидемия идет на убыль. Вместе с тем вследствие формирования иммунитета происходит отбор штаммов вируса с измененной антигенной структурой, прежде всего гемагглютинина и нейраминидазы; эти вирусы продолжают вызывать вспышки до тех пор, пока и к ним не появятся антитела. Такой антигенный дрейф и поддерживает непрерываемость эпидемии. Однако у вируса гриппа А обнаружена еще одна форма изменчивости, получившая название шифта, или сдвига. Она связана с полной сменой одного типа гемагглютинина (реже – и нейраминидазы) на другой.

Все пандемии гриппа были вызваны вирусами гриппа А, претерпевшими шифт. Пандемия 1918 г. была вызвана вирусом с фенотипом H1N1 (погибло около 20 млн человек), пандемия 1957 г. – вирусом H2N2 (переболело более половины населения мира), 1968 г. – вирусом H3N2.

Для объяснения причин резкой смены типов вирусов гриппа А предложены две основные гипотезы. Согласно гипотезе А. А. Смородинцева, вирус, исчерпавший свои эпидемические возможности, не исчезает, а продолжает циркулировать в коллективе без заметных вспышек или длительно персистировать в организме человека. Через 10 – 20 лет, когда появится новое поколение людей, не имеющих иммунитета к этому вирусу, он становится причиной новых эпидемий. В пользу этой гипотезы говорит тот факт, что вирус гриппа А с фенотипом H1N1, исчезнувший в 1957 г., когда его вытеснил вирус H2N2, вновь появился после 20-летнего отсутствия в 1977 г.

По другой гипотезе, развиваемой и поддерживаемой многими авторами, новые типы вируса гриппа А возникают вследствие реассоциации геномов между вирусами гриппа человека и птиц, между вирусами гриппа птиц, между вирусами гриппа птиц и млекопитающих (свиньи), чему способствует сегментарная структура вирусного генома (8 фрагментов).

Таким образом, у вируса гриппа А есть два пути изменения генома.

1. Точечные мутации, обусловливающие антигенный дрейф. Им подвержены, прежде всего, гены гемагглютинина и нейраминидазы, особенно у вируса H3N2. Благодаря этому вирус H3N2 за период с 1982 по 1998 г. вызвал 8 эпидемий и сохраняет эпидемическое значение до сих пор.

2. Реассоциация генов между вирусами гриппа человека и вирусами гриппа птиц и свиней. Считается, что именно реассоциация геномов вирусов гриппа А с геномами вируса гриппа птиц и свиней – главная причина возникновения пандемических вариантов этого вируса. Антигенный дрейф позволяет вирусу преодолевать существующий у людей иммунитет. Антигенный шифт создает новую эпидемическую ситуацию: к новому вирусу у большинства людей иммунитета нет, и возникает пандемия гриппа. Возможность такой реассоциации геномов вирусов гриппа А доказана экспериментально.

Установлено, что эпидемии гриппа у людей вызывают вирусы типа А только 3 или 4 фенотипов: H1N1 (H0N1); H2N2; H3N2.

Однако существенную угрозу для человека предсталяет и куриный (птичий) вирус. Вспышки куриного гриппа наблюдались неоднократно, в частности куриный вирус H5N1 вызвал миллионную эпизоотию среди домашних и диких птиц с 80 – 90 %-ной летальностью. От кур заражались и люди; так в 1997 г. от кур заразилось 18 человек, треть из них погибла. Особенно крупная вспышка наблюдалась в январе – марте 2004 г. Она охватила почти все страны Юго-Восточной Азии и один из штатов США и нанесла огромный экономический ущерб. От кур заразилось и погибло 22 человека. Для ликвидации этой вспышки были предприняты самые жесткие и решительные меры: строгий карантин, ликвидация всего поголовья птиц во всех очагах, госпитализация и изоляция больных и всех людей с повышенной температурой, а также лиц, находившихся в контакте с больными, запрет импорта куриного мяса из указанных выше стран, строгий медицинский и ветеринарный надзор за всеми пассажирами и транспортными средствами, прибывающими из этих стран. Широкого распространения гриппа среди людей не произошло потому, что не было реассоциации генома вируса куриного гриппа с геномом вируса гриппа человека. Однако опасность такой реассоциации остается реальной. Всего в течение 2003–2007 гг. в мире переболело 322 человека, из них 195 умерли.

В названии выявляемых штаммов вирусов гриппа указывают серотип вируса (A, B, C), вид хозяина (если им не является человек), место выделения, номер штамма, год его выделения (последние 2 цифры) и фенотип (в круглых скобках).

Например: «A/Сингапур/1/57 (H2N2), A/утка/СССР/695/76 (H3N2)».

Особенности патогенеза и клиники. Инкубационный период при гриппе короткий – 1 – 2 сут. Вирус размножается в эпителиальных клетках слизистой оболочки дыхательных путей с преимущественной локализацией в области трахеи, что клинически проявляется в виде сухого мучительного кашля с болями по ходу трахеи. Продукты распада пораженных клеток попадают в кровь, вызывают сильную интоксикацию и повышение температуры тела до 38 – 39 °C. Повышение проницаемости сосудов, обусловленное повреждением клеток эндотелия, может стать причиной патологических изменений в различных органах: точечных кровоизлияний в трахее, бронхах, а иногда и отека мозга с летальным исходом. Вирус гриппа оказывает угнетающее действие на кроветворение и иммунную систему. Все это может приводить к вторичным вирусным и бактериальным инфекциям, которые осложняют течение болезни.

Постинфекционный иммунитет. Прежние представления о том, что после перенесенного гриппа остается слабый и кратковременный иммунитет, опровергнуты после возвращения вируса H1N1 в 1977 г. Этот вирус вызывал заболевание главным образом у людей не старше 20 лет, т. е. у тех, кто не болел им раньше, до 1957 г. Следовательно, постинфекционный иммунитет достаточно напряженный и продолжительный, но имеет выраженный типоспецифический характер.

Главная роль в формировании приобретенного иммунитета принадлежит вируснейтрализующим антителам, блокирующим гемагглютинин и нейраминидазу, а также секреторным иммуноглобулинам IgAs.

Лабораторная диагностика. Материалом для исследования служит отделяемое носоглотки, которое получают либо путем смыва, либо с помощью ватно-марлевых тампонов, и кровь. Методы диагностики применяют следующие:

1. Вирусологический – заражение куриных эмбрионов, культур клеток почек зеленых мартышек (Vero) и собак (МДСК). Культуры клеток особенно эффективны для выделения вирусов А (H3N2) и В.

2. Серологический – выявление специфических антител и возрастания их титра (в парных сыворотках) с помощью РТГА, РСК, иммуноферментного метода.

3. В качестве ускоренной диагностики используют иммунофлуоресцентный метод, позволяющий быстро обнаружить вирусный антиген в мазках-отпечатках со слизистой оболочки носа или в смывах из носоглотки больных.

4. Для обнаружения и идентификации вируса (вирусных антигенов) предложены методы РНК-зонда и ПЦР.

Лечение. Для лечения, которое следует начинать как можно раньше, и профилактики гриппа и других вирусных ОРЗ применяют дибазол, интерферон и его индукторы амиксин и арбидол по специальным схемам, а для лечения и профилактики гриппа у детей старше 1 года – альгирем (ремантадин) по специальным схемам.

Специфическая профилактика. Ежегодно в мире гриппом болеют сотни миллионов людей, что наносит колоссальный ущерб здоровью населения и экономике каждой страны. Единственным надежным средством борьбы с ним является создание коллективного иммунитета. Для этой цели предложены и используются следующие типы вакцин: 1) живая из аттенуированного вируса; 2) убитая цельновирионная; 3) субвирионная вакцина (из расщепленных вирионов); 4) субъединичная – вакцина, содержащая только гемагглютинин и нейраминидазу.

В нашей стране создана и применяется тривалентная полимер-субъединичная вакцина («гриппол»), в которой стерильный конъюгат поверхностных белков вирусов А и В связан с сополимером полиоксидонием (иммуностимулятор).

Детей от 6 мес. до 12 лет, по рекомендации ВОЗ, следует прививать только субъединичной вакциной как наименее реактогенной и токсичной.

Главная проблема в повышении эффективности противогриппозных вакцин – обеспечение их специфичности против актуального вируса, т. е. того варианта вируса, который вызвал данную эпидемию. Иначе говоря, вакцина должна содержать специфические антигены актуального вируса. Основной путь повышения качества вакцины – использование наиболее консервативных и общих для всех антигенных вариантов вируса А эпитопов, которые обладают максимальной иммуногенностью.

Парамиксовирусы

Вирусы парагриппа человека (ВПГЧ) впервые выделены в 1956 – 1958 гг. в США из носоглотки у детей, больных гриппоподобными заболеваниями, в связи с чем и получили такое название. Вирионы имеют сферическую форму, их диаметр 150 – 200 нм. Геном представлен однонитевой нефрагментированной негативной РНК с м. м. 5,6 МД и состоит из 6 генов. С вирионной РНК связаны белок NP и полимеразные белки P и L, образующие нуклеокапсид со спиральным типом симметрии. В составе полимеразного комплекса P и L имеется транскриптаза. Нуклеокапсид окружен оболочкой из матриксного белка М, играющего важную роль в морфогенезе вириона. Вирион покрыт суперкапсидом, состоящим из липидного бислоя и гликозилированных белков HN и F (англ. fusion – слияние), которые выступают в виде шипов. Белок HN, обладающий гемагглютинирующей и нейраминидазной активностью, ответствен за связывание вируса клеточными рецепторами. Белок F (F₁ и F₂), образующийся после протеолитического расщепления его предшественника F₀, опосредует три вида активности: гемолиз эритроцитов; слияние вирусной мембраны с мембраной клетки и ее лизосом; слияние клеток, которое обеспечивает возможность вирусу распространяться от клетки к клетке при помощи образующегося синцития, минуя околоклеточную среду. Таким образом, вирусы парагриппа обладают гемагглютинирующей, нейраминидазной, гемолитической и симпластообразующей активностью, однако у разных типов вирусов эти свойства проявляются в разной степени.

Особенностью размножения вирусов парагриппа, как и всех парамиксовирусов, является то, что, в отличие от вирусов гриппа, они не нуждаются для своей транскрипции в затравочной мРНК и поэтому не проникают в ядро клетки. Их жизненный цикл, подобно вирусу леса Семлики, протекает в цитоплазме клетки. ВПГЧ плохо размножаются в куриных эмбрионах. Для их выделения применяют культуры клеток, в основном первично-трипсинизированных, при размножении в которых они легко могут быть обнаружены с помощью реакции гемадсорбции. Парамиксовирусы не имеют общего антигена, единого для всего семейства. ВПГЧ по поверхностным антигенам разделены на четыре сероварианта, но их внутренние белки имеют общие детерминанты. Вирусы парагриппа – очень распространенные возбудители ОРЗ. У взрослых эти заболевания протекают легче, чем грипп. При этом ВПГЧ чаще поражают клетки гортани, поэтому заболевание протекает с явлениями ларингита (сухой болезненный кашель, охрипший голос). У детей заболевания, вызываемые ВПГЧ, протекают более тяжело, у них чаще развивается интоксикация. Наиболее тяжело протекают заболевания, вызываемые ВПГЧ-3, особенно у детей первого года жизни. ВПГЧ-3 являются виновником 60 – 70 % заболеваний нижних отделов дыхательных путей (бронхиолиты, пневмонии) у детей первых полутора лет жизни. Для заболеваний, вызываемых вирусами парагриппа 1-го и 2-го типов, характерен симптом ложного крупа.

Вирусы парагриппа вызывают в основном локальные вспышки, однако они наблюдаются повсеместно, особенно в странах с умеренным климатом.

Для лабораторной диагностики парагриппозных заболеваний применяются следующие методы:

а) обнаружение вирусных антигенов с помощью методов иммунофлуоресценции и ИФМ в эпителиальных клетках слизистой оболочки носовых ходов и носоглотки;

б) выделение вируса в культурах клеток с последующей идентификацией его с помощью реакций торможения гемадсорбции или гемагглютинации;

в) определение противовирусных антител с помощью реакций торможения гемадсорбции (гемагглютинации) или нейтрализации в культуре клеток с использованием парных сывороток (нарастание титра антител).

Методы специфической профилактики не разработаны.

Вирус эпидемического паротита (свинки)

Эпидемический паротит – острое вирусное заболевание, для которого характерно поражение одной или обеих околоушных слюнных желез. Возбудитель был выделен в 1934 г. К. Джонсоном и Р. Гудпасчуром из слюны больного свинкой путем заражения обезьян в проток слюнной железы.

Морфологически вирус сходен с другими парамиксовирусами, обладает гемагглютинирующей, гемолитической, нейраминидазной и симпластообразующей активностью. Геном представлен однонитевой нефрагментированной негативной РНК, м. м. ее 8 МД. В составе вириона 8 белков; суперкапсидные белки HN и F выполняют такие же функции, как и у других парамиксовирусов. Вирус хорошо размножается в амниотической полости 7 – 8-дневных куриных эмбрионов и в культурах клеток, лучше первично-трипсинизированных, с образованием симпластов. Антигенная структура вируса стабильна, никаких серовариантов не описано.

Вирус малоустойчив, разрушается в течение нескольких минут при воздействии жирорастворителей, детергентов, 2 %-ного фенола, 1 %-ного лизола и других дезинфицирующих веществ. Лабораторные животные к вирусу паротита малочувствительны. Лишь у обезьян путем введения им вируса в проток слюнной железы удается воспроизвести сходное с паротитом человека заболевание.

Особенности эпидемиологии. Заболевание встречается повсеместно. Источником инфекции является только больной человек (в том числе с бессимптомной формой болезни). Он заразен в течение всего инкубационного периода и первой недели болезни. Болеют дети 5 – 15 лет (чаще мальчики), однако могут болеть и взрослые.

Особенности патогенеза и клиника. Инкубационный период составляет в среднем 14 – 21 день. Вирус проникает из полости рта по стенонову (околоушному) протоку в околоушную слюнную железу, где и происходит в основном его размножение. Возможно, что первичное размножение вируса происходит в эпителиальных клетках верхних дыхательных путей. Поступая в кровь, вирус может проникнуть в различные органы (яички, яичники, поджелудочную и щитовидную железы, мозг) и вызвать соответствующие осложнения (орхит, менингит, менингоэнцефалит, реже – тиреоидит, полиартрит, нефрит, панкреатит; тяжелые формы орхита могут обусловить последующую половую стерильность). Наиболее типичным проявлением болезни является воспаление и увеличение околоушных и других слюнных желез, сопровождающееся умеренным повышением температуры. Как правило, в неосложненных случаях заболевание заканчивается полным выздоровлением. Очень часто оно протекает бессимптомно.

Постинфекционный иммунитет прочный, длительный, повторных заболеваний почти не бывает. Естественный пассивный иммунитет сохраняется в течение первых шести месяцев жизни ребенка.

Лабораторная диагностика. Применяют вирусологические и серологические методы, используя слюну, мочу, спинномозговую жидкость, пунктат желез. Заражают 7 – 8-дневные куриные эмбрионы или культуры клеток. Вирус идентифицируют с помощью реакций торможения гемагглютинации (гемадсорбции), иммунофлуоресценции, нейтрализации и связывания комплемента. Серологическая диагностика осуществляется на основании нарастания титра антител в парных сыворотках больных с помощью РТГА или РСК.

Специфическая профилактика. По мнению Международной службы по ликвидации заболеваний, эпидемический паротит относится к группе потенциально ликвидируемых болезней. Основным средством для ее ликвидации является создание коллективного иммунитета с помощью живой вакцины, приготовленной из аттенуированного штамма (пассажи на куриных эмбрионах приводят к снижению патогенности вируса для человека). Вакцина вводится подкожно однократно детям на первом году жизни, иммунитет столь же стойкий, как и постинфекционный. К категории потенциально ликвидируемых болезней относятся также краснуха и корь. Поэтому для ликвидации их рекомендуется применение трехвалентной вакцины (против кори, краснухи и паротита).

Респираторно-синцитиальный вирус (RS-вирус)

RS-вирус является одним из наиболее частых возбудителей ОРЗ у детей первых 2 – 3 лет жизни. Впервые был выделен в 1956 г. от шимпанзе, страдавшей ОРЗ, а в 1957 г. Р. Ченок [и др.] выделили сходные штаммы от детей, больных ОРЗ.

Вирион сферической формы, диаметр его варьирует у отдельных частиц от 120 до 200 нм. Геном представлен однонитевой нефрагментированной негативной РНК с м. м. около 5,6 МД; она несет, очевидно, 10 генов, кодирующих 10 вирусспецифических белков, из которых 7 входят в состав вириона, а остальные являются неструктурными. RS-вирус отличается от других парамиксовирусов тем, что у него не обнаружены гемагглютинин и нейраминидаза, и он не обладает гемолитической активностью. Структура генома такова: 3' – 1C – 1B – N – P – M – 1A – G – F – 22K – L – 5'. Белки G и F – гликопротеиды, которые входят в состав суперкапсида и образуют поверхностные шипы. Белок G обеспечивает фиксацию вируса на чувствительных клетках, а белок F обеспечивает слияние двух типов: а) слияние мембраны вируса с мембраной клетки и ее лизосом; б) слияние инфицированной клетки с прилегающими неинфицированными клетками, вследствие чего и образуется синцитий – симпласт из клеток, связанных между собой цитоплазматическими отростками («сетчатая ткань»). Этот феномен и послужил основанием назвать вирус «респираторно-синцитиальным». Белки N, P и L (полимеразный комплекс, содержащий транскриптазу) входят в состав нуклеокапсида. Белки М и К связаны с внутренней поверхностью суперкапсида вириона. Функции остальных белков пока не известны. По антигенным свойствам различают два сероварианта вируса. Вирус хорошо размножается в культурах многих штаммов перевиваемых клеток (HeLa, HЕp-2 и др.) с проявлением характерного цитопатического действия, а также с образованием бляшек; не культивируется на куриных эмбрионах. RS-вирус очень лабилен и легко разрушается при замораживании и оттаивании, при обработке жирорастворителями, детергентами, различными дезинфицирующими веществами; при нагревании до 55 °C погибает за 5 – 10 мин.

Источником инфекции является больной человек. Заражение происходит воздушно-капельным путем. Инкубационный период 3 – 5 дней. Вирус размножается в эпителиальных клетках дыхательных путей, процесс быстро распространяется и на их нижние отделы. Особенно тяжело заболевание протекает у детей первых шести месяцев жизни в виде бронхита, бронхиолита, пневмонии. У 75 % детей трехлетнего возраста обнаруживаются антитела к вирусу.

Постинфекционный иммунитет стойкий и длительный, он обусловлен появлением вируснейтрализующих антител, клеток иммунной памяти и секреторных антител класса IgAs.

Лабораторная диагностика основана на быстром обнаружении вирусных антигенов в отделяемом носоглотки (у погибших исследуют ткани легких, трахеи, бронхов) с помощью иммунофлуоресцентного метода, выделении и идентификации вируса и определении специфических антител. Для выделения вируса исследуемым материалом заражают культуры клеток, о его размножении судят по характерному цитопатическому эффекту; вирус идентифицируют с помощью иммунофлуоресцентного метода, РСК и реакции нейтрализации в культуре клеток.

Серологический метод (РСК, РН) у детей первых шести месяцев жизни, которые имеют материнские антитела в титре до 1: 320, недостаточно надежен. Для диагностики заболевания у них лучше использовать методы обнаружения специфических антигенов с помощью РИФ или ИФМ.

Специфическая профилактика не разработана.

Вирус кори (Morbillivirus)

Респираторные коронавирусы

К семейству Coronaviridae с двумя родами, Coronavirus (включающим также возбудителей гастроэнтерита у детей – см. табл. 20, с. 346) и Torovirus, относятся вирусы округлой формы диаметром 50 – 220 нм. Вирионы имеют суперкапсид, над которым выступают шипы длиной 12 – 24 нм, они состоят из тонкой шейки и массивной головки шаровидной или грушевидной формы и напоминают фигуру солнечной короны, в связи с чем семейство получило название коронавирусов. В сердцевине вириона располагается нуклеокапсид. Из всех РНК-вирусов коронавирусы имеют самый большой геном в виде однонитевой нефрагментированнойпозитивной РНК из 27 000 – 32 000 п. н. Вирион содержит 3 группы белков: белок нуклеокапсида, связанный с РНК; матриксный белок и наделяющие вирус способностью адсорбироваться на рецепторах клетки и проникать в нее гликозилированные белки суперкапсида. Естественными хозяевами коронавирусов являются человек, домашние и дикие животные, у которых они вызывают широкораспространенные заболевания.

Респираторные коронавирусы разделяют на 3 серогруппы. Заражение от больного человека происходит воздушно-капельным путем; заболеваемость спорадическая. Эпидемические вспышки коронавирусных инфекций в виде лихорадки, насморка, бронхита и пневмонии отмечаются преимущественно в холодное время года. До появления SARS эти вспышки чаще всего вызывал коронавирус HCV-209E.

В ноябре 2002 г. в Китае произошла вспышка болезни, получившей название SARS (англ. Severe Acute Respiratory Syndrome), или тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС), или атипичная пневмония; она была описана в Гонконге К. Урбани. Болезнь стала быстро распространяться и, по данным ВОЗ, на 19 июня 2003 г. в 32 странах было зарегистрировано 8462 случая SARS (больше всего в Китае (7058)). Погибло 804 человека (летальность около 9,5 %). В России зарегистрирован 1 случай. Благодаря предпринятым по инициативе ВОЗ энергичным профилактическим мерам (обязательная госпитализация, изоляция, карантинизация, широкое использование ватно-марлевых масок и т. д.) эпидемия SARS к июню 2003 г. была ликвидирована, однако позднее было выявлено еще несколько случаев заболевания, и опасность повторения эпидемии не исключена. Возбудитель SARS обнаружен в апреле 2003 г. Им оказался коронавирус, не родственный ни одному из известных штаммов этого вируса. Его геномная РНК состоит из 29 727 – 29 736 п. н. По нуклеотидным последовательностям вирус SARS отличается на 50 – 60 % от трех известных серогрупп коронавирусов.

Природные носители вируса пока точно не установлены. Ими могут быть крысы, другие грызуны, насекомые. В Китае полагают, что главным носителем его является мелкий хищник виверра азиатская, или восточная (Viverra zibetha). Ее разводят в вольерах для продажи, так как мясо высоко ценится гурманами.

Основная биологическая особенность вируса – высокая контагиозность, которая во много раз превышает таковую вирусов возбудителей различных ОРЗ, включая грипп. Причина ее также не ясна.

Инкубационный период 4 – 6, реже 7 – 10 дней.

Клиника SARS. Заболевание начинается с повышения температуры до 38 °C и выше, озноба, сухого кашля, слабости, одышки, а затем быстро развивается тяжелая пневмония, вызывающая нарушение дыхания в силу возникновения отека и воспаления альвеол.

Лабораторная диагностика коронавирусных инфекций, включая SARS, осуществляется путем выделения культур вирусов и их идентификации либо путем определения вирусспецифических антител и нарастания их титра в парных сыворотках с помощью различных серологических реакций или с помощью ДНКи РНК-зондов, ПЦР. В частности, для диагностики SARS с помощью ПЦР уже предложено несколько типов праймеров. Для обнаружения РНК-вируса с помощью ПЦР может быть использован любой биологический материал: кровь, мокрота, моча, фекалии и т. п. Однако все предложенные тест-системы для диагностики SARS нуждаются в дополнительном изучении степени их специфичности.

Для лечения коронавирусных заболеваний, включая SARS, используют противовирусные препараты: рибавирин, интерфероны, специфические иммуноглобулины (плазма крови людей, переболевших SARS); для предупреждения бактериальных осложнений – антибиотики (β-лактамные, фторхинолоны, цефалоспорины, тетрациклины).

Профилактика SARS. Меры общей профилактики такие же, как при чуме. В России ведутся исследования для создания эффективной безвредной вакцины против SARS.

Респираторные аденовирусы

Первые представители семейства аденовирусов были выделены в 1953 г. У. Роу [и др.] из миндалин и аденоидов детей, в связи с чем и получили такое название. Семейство Adenoviridae разделяется на два рода: Mastadenovirus – аденовирусы млекопитающих, он включает аденовирусы человека (41 серовариант), обезьян (24 сероварианта), а также крупного рогатого скота, лошадей, овец, свиней, собак, мышей, земноводных; и Aviadenovirus – аденовирусы птиц (9 серовариантов).

Аденовирусы лишены суперкапсида. Вирион имеет форму икосаэдра – кубический тип симметрии, его диаметр 70 – 90 нм. Капсид состоит из 252 капсомеров диаметром 7 – 9 нм. Группы из 9 капсомеров образуют 20 равносторонних граней (180 капсомеров), а по их углам расположены 12 вершин, состоящих из 6 капсомеров (72 капсомера). Поскольку каждый из 180 капсомеров соседствует с шестью другими, он называется гексоном (рис. 86б). В свою очередь гексон состоит из трех субъединиц с м. м. 120 кД. Каждый из 12 вершинных капсомеров соседствует с пятью, поэтому он называется пентоном. Двенадцать вершинных капсомеров икосаэдра несут нитчатые выступы (фибры) длиной 8 – 30 нм, заканчивающиеся головкой диаметром 4 нм. В сердцевине вириона расположен дезоксирибонуклеопротеид, состоящий из молекулы двунитевой геномной ДНК (20 – 25 МД), с 5'-концами обеих нитей которой ковалентно связан терминальный белок (55 кД), и двух основных белков: VII (18 кД) и V (48 кД). Дезоксирибонуклеопротеид представляет собой структуру из 12 петель, вершины которых направлены к основаниям вершинных капсидов, поэтому сердцевина вириона на срезе имеет форму цветка (рис. 86а). На наружной поверхности располагается белок V. Кроме того, в сердцевине находятся белки VI и X. Геном аденовирусов представлен двунитевой линейной ДНК с м. м. 19 – 24 МД. Нити ДНК фланкированы терминальными инвертированными повторами, позволяющими формировать кольцевые молекулы. С 5'-концами обеих нитей ковалентно связан гидрофобный терминальный белок, который необходим для инициации репликации ДНК. Количество генов в молекуле ДНК точно не установлено. У аденовирусов человека на долю белков приходится 86 – 88 % от массы вириона. Общее число их, вероятно, более 30, а м. м. варьирует от 5 до 120 кД. Белки обозначают римскими цифрами, охарактеризованы из них II – XIII. В настоящее время в геноме аденовирусов выделено четыре области ранней транскрипции Е1, Е2, Е3, Е4 и не менее 5 областей поздней – L1, L2, L3, L4, L5.

Продукты Е1 угнетают транспорт клеточных мРНК в цитоплазму и их трансляцию. Область Е2 кодирует синтез ДНК-связывающего белка, который играет важную роль в репликации вирусной ДНК, экспрессии ранних генов, в контроле сплайсинга и сборке вирионов. Один из поздних белков защищает аденовирусы от действия интерферона. К числу главных продуктов, кодируемых поздними генами, относятся белки, формирующие гексоны, пентоны, сердцевину вириона, и неструктурный белок, который выполняет три функции: а) участвует в образовании гексоновых тримеров; б) осуществляет транспорт этих тримеров в ядро; в) участвует в формировании зрелых вирионов аденовируса. В составе вириона выявлено не менее 7 антигенов. Антиген А (гексон) является группоспецифическим и общим для всех аденовирусов человека. По антигену В (основание пентона) все аденовирусы человека подразделяются на три подгруппы. Антиген С (нити, фибры) является типоспецифическим. По этому антигену все аденовирусы человека делятся на 41 серовариант. Все аденовирусы человека, кроме серовариантов 12, 18 и 31, обладают гемагглютинирующей активностью, которая опосредуется пентоном (вершинным капсомером). Для идентификации серовариантов аденовирусов Л. Розеном в 1960 г. была предложена РТГА.

Рис. 86. Аденовирус:

а – схема строения вириона (по А. Г. Букринской, 1986); б – модель аденовируса.

Римскими цифрами обозначены основные белки вириона; в центре – дезоксирибонуклеопротеид, содержащий вирусный геном

Жизненный цикл аденовирусов при продуктивной инфекции складывается из следующих этапов:

1) адсорбция на специфических рецепторах клеточной мембраны с помощью головки фибров;

2) проникновение в клетку с помощью механизма рецепторопосредованного эндоцитоза, сопровождающегося частичным «раздеванием» в цитоплазме;

3) окончательная депротеинизация генома у ядерной мембраны и проникновение его в ядро;

4) синтез ранних мРНК с помощью клеточной РНК-полимеразы;

5) синтез ранних вирусспецифических белков;

6) репликация геномной вирусной ДНК;

7) синтез поздних мРНК;

8) синтез поздних вирусных белков;

9) морфогенез вирионов и выход их из клетки.

Процессы транскрипции и репликации происходят в ядре, процесс трансляции – в цитоплазме, откуда белки транспортируются в ядро. Морфогенез вирионов также происходит в ядре и носит многоступенчатый характер: вначале полипептиды собираются в мультимерные структуры – фибры и гексоны, затем формируются капсиды, незрелые вирионы и, наконец, зрелые вирионы. В ядрах инфицированных клеток вирионы нередко образуют кристаллические скопления. На поздних стадиях инфекции в ядрах накапливаются не только зрелые вирионы, но и незрелые капсиды (без ДНК). Выход вновь синтезированных вирионов сопровождается разрушением клеток. Из клетки, в которой синтезируется до миллиона новых вирионов, выходят далеко не все они. Остающиеся вирионы нарушают функции ядра и вызывают дегенерацию клеток.

Помимо продуктивной формы инфекции, аденовирусы могут вызывать абортивную инфекцию, при которой репродукция вируса резко нарушена на ранней или более поздней ее стадии. Кроме того, некоторые сероварианты аденовирусов человека способны индуцировать злокачественные опухоли при инокуляции различным грызунам. По своим онкогенным свойствам аденовирусы разделяют на высокоонкогенные, слабоонкогенные и неонкогенные. Онкогенные способности находятся в обратной зависимости от содержания Г – Ц пар в ДНК аденовирусов. Основным событием, которое приводит к трансформации клеток (в том числе в их культурах), является интеграция вирусной ДНК в хромосому клетки-хозяина. Молекулярные механизмы онкогенного действия аденовирусов остаются неясными.

Онкогенными свойствами в отношении человека аденовирусы не обладают.

Аденовирусы не размножаются в куриных эмбрионах, но хорошо размножаются в первично-трипсинизированных и перевиваемых культурах клеток различного происхождения, вызывая характерный цитопатический эффект (округление клеток и образование из них гроздевидных скоплений, мелкоточечная дегенерация).

По сравнению с другими вирусами человека аденовирусы несколько более устойчивы во внешней среде, не разрушаются жирорастворителями (нет липидов), не погибают при температуре 50 °C и при рН 5,0 – 9,0; хорошо сохраняются в замороженном состоянии.

Особенности эпидемиологии. Источник инфекции – только больной человек, в том числе со скрытой ее формой. Заражение происходит воздушно-капельным, контактно-бытовым путем, через воду в плавательных бассейнах и фекально-оральным путем. В кишечник вирус может проникать и через кровь. Заболевания верхних дыхательных путей и глаз вызывают сероварианты 1 – 8, 11, 19, 21. Сероварианты 1, 2, 3, 12, 18, 31, 40 и 41 вызывают гастроэнтериты у детей от 6 мес. до 2 лет, мезентеральный аденит. Сероварианты 1, 2, 5, 6 часто обнаруживаются при латентных формах инфекции.

Нет данных о способности аденовирусов животных вызывать заболевания у людей, и, наоборот, аденовирусов человека – у животных. Аденовирусы вызывают спорадические заболевания и локальные эпидемические вспышки. Самая крупная вспышка в нашей стране охватила 6000 человек.

Особенности патогенеза и клиники. Инкубационный период 6 – 9 дней. Вирус размножается в эпителиальных клетках верхних дыхательных путей, слизистой оболочки глаз. Может проникать в легкие, поражать бронхи и альвеолы, вызывать тяжелую пневмонию; характерное биологическое свойство аденовирусов – тропизм к лимфоидной ткани.

Аденовирусные заболевания можно характеризовать как лихорадочные с катаральным воспалением слизистой оболочки дыхательных путей и глаз, сопровождающиеся увеличением подслизистой лимфоидной ткани и регионарных лимфатических узлов. Чаще всего они протекают в виде тонзиллита, фарингита, бронхита, атипичной пневмонии, гриппоподобного заболевания, в форме фаринго-конъюнктивальной лихорадки. Конъюнктивит в одних случаях сопровождает аденовирусное заболевание, в других – основной симптом его.

Таким образом, для аденовирусных заболеваний характерно преобладание респираторного, конъюнктивального или кишечного синдрома. Вместе с тем вирус способен вызывать латентную (бессимптомную) или хроническую инфекцию с длительным персистированием в тканях миндалин и аденоидов.

Постинфекционный иммунитет длительный, стойкий, но типоспецифический, перекрестного иммунитета нет. Иммунитет обусловлен вируснейтрализующими антителами и клетками иммунной памяти.

Лабораторная диагностика. 1. Выявление вирусных антигенов в пораженных клетках с помощью методов иммунофлуоресценции или ИФМ. 2. Выделение вируса. Материалом для исследования служат отделяемое носоглотки и конъюнктивы, кровь, испражнения (вирус удается выделить не только в начале болезни, но и на 7 – 14-й ее день). Для изоляции вируса используют первично-трипсинизированные культуры клеток (в том числе диплоидные) эмбриона человека, которые чувствительны ко всем серовариантам аденовирусов. Вирусы обнаруживают по их цитопатическому эффекту и с помощью РСК, так как все они обладают общим комплементсвязывающим антигеном. Идентификацию производят по типоспецифическим антигенам с помощью РТГА и РН в культуре клеток. 3. Выявление нарастания титра антител в парных сыворотках больного с помощью РСК. Определение нарастания титра типоспецифических антител осуществляют с эталонными сероштаммами аденовирусов в РТГА или РН в культуре клеток.

Специфическая профилактика. Против некоторых серовариантов аденовирусов получены живые иммуногенные пероральные вакцины, но они широкого применения не получили.

Вирус краснухи

Вирус краснухи является единственным представителем рода Rubivirus, относящегося к семейству тогавирусов.

Краснуха (коревая краснуха) – острое инфекционное заболевание, характеризующееся пятнистыми высыпаниями на коже, катаральным воспалением верхних дыхательных путей и конъюнктивы, увеличением шейных лимфатических узлов и признаками незначительной общей интоксикации.

Вирус краснухи является типичным представителем семейства тогавирусов и по основным характеристикам похож на альфа-вирусы (см. главу 54). Вирион сферической формы, диаметр около 60 нм, геном представлен позитивной нефрагментированной однонитевой молекулой РНК с молекулярной массой 3 МД. Вирус имеет суперкапсид, на поверхности которого присутствуют шипы гликопротеидной природы длиной 6 – 10 нм. Имеются две разновидности гликопротеидов: Е1 – обладает гемагглютинирующими свойствами в отношении птичьих эритроцитов, и Е2 – выполняет функцию рецептора при взаимодействии с клеткой. Оба гликопротеида являются протективными антигенами. Существует только один серовар вируса.

Вирус сравнительно нестоек во внешней среде, легко инактивируется жирорастворителями, детергентами, при рН ниже 5,0, при температуре выше 56 °C. Хорошо сохраняется при замораживании, особенно при –70 °C.

Вирус краснухи хорошо размножается и вызывает цитопатические изменения в культурах клеток амниона человека, почек кролика и почек обезьян Vero. В пораженных клетках наступает дегенерация, появляются гигантские многоядерные клетки. В других клеточных культурах вирус может размножаться без видимых изменений, но индуцирует развитие интерференции, защищающей от цитопатического действия других вирусов. Именно на этом основан стандартный метод выделения вируса краснухи, заключающийся в заражении исследуемым материалом клеток почки зеленой мартышки и внесении в культуру через 7 – 10 дней вируса ЕСНО типа II или вируса везикулярного стоматита. Если развиваются цитопатические изменения, вызванные вирусом ЕСНО, следовательно, материал не содержит вируса краснухи, и, наоборот, отсутствие цитопатического действия вируса ЕСНО свидетельствует о присутствии вируса краснухи в исследуемом материале.

Вирус краснухи патогенен для человека, обезьян макак и кроликов. Другие животные к вирусу нечувствительны.

Эпидемиология. Краснуха является типичной антропонозной воздушно-капельной инфекцией, высококонтагиозной для лиц, не имеющих иммунитета. Пик заболеваемости краснухой обычно приходится на весну. В ХХ в. эпидемии наблюдались каждые 6 – 9 лет, и после каждой эпидемии в последующие 5 лет заболеваемость снижалась, а затем опять возрастала до эпидемического уровня через 6 – 9 лет после последней крупной вспышки. При краснухе вирус выделяется из слизи носоглотки и верхних дыхательных путей за 1 – 2 нед. до появления сыпи и в течение 2 – 3 нед. после начала высыпания. У внутриутробно зараженных детей вирус может выделяться с мочой и испражнениями в течение 1 – 1,5 лет.

Патогенез и клиника. Попавший в организм человека воздушно-капельным путем вирус сначала размножается в шейных лимфатических узлах. Через неделю развивается вирусемия, и еще через неделю появляется сыпь, начинающаяся с лица и переходящая на туловище и конечности. В этот период возможны лихорадка, увеличение других регионарных лимфатических узлов, боли в суставах (особенно у взрослых). Сыпь обычно держится 2 – 3 дня.

Если у детей краснуха обычно протекает доброкачественно, в виде легкого заболевания, то у взрослых течение болезни довольно тяжелое, иногда развиваются артриты, энцефалиты и тромбоцитопения. Особенно опасна краснуха для женщин детородного возраста, так как она может стать причиной синдрома врожденной краснухи (СВК), обусловленного способностью вируса проникать через плаценту в период вирусемии и оказывать на растущий плод тератогенное действие. Это связано с цитопатическим действием вируса как на делящиеся клетки плода, так и на клетки сосудов плаценты. Следствием этого могут быть пороки сердца, глухота, врожденные заболевания органов зрения, микроцефалия, спонтанный аборт, мертворождение и др.

Иммунитет. Вируснейтрализующие антитела (IgM) появляются в крови в период проявления сыпи, максимума их титр достигает через 2 – 3 нед., а через 2 – 3 мес. они исчезают. IgG появляются после исчезновения сыпи и сохраняются длительно.

Иммунитет после перенесенной в детстве краснухи пожизненный.

Лабораторная диагностика. Диагностика краснухи может проводиться вирусологическим и серологическим методами. Материал для выделения вируса – отделяемое носоглотки (при наличии катаральных явлений) и кровь до появления сыпи;

кровь, моча, испражнения – после появления сыпи. Материалом заражают культуры клеток, идентифицируют вирус в РТГА, а также по тесту интерференции. При врожденной краснухе используют в качестве материала для исследования мочу и испражнения детей.

При серологической диагностике определяют антитела класса IgМ с помощью РИФ, ИФМ, РИМ. Используют парные сыворотки, определяют нарастание титра антител.

Специфическая профилактика и лечение. Основное в профилактике краснухи – карантинные мероприятия в детских коллективах. Целесообразна выборочная иммунизация девочек 12 – 14 лет, девушек и женщин детородного возраста. Для этих целей используют живые и убитые вакцины, полученные из аттенуированных штаммов вируса, пассируемых при низкой температуре в культуре клеток почек зеленых мартышек и диплоидных клеток легких эмбриона человека. Существуют ассоциированные препараты в комбинации с вакцинами против кори и эпидемического паротита. ВОЗ поставлена задача снижения частоты синдрома врожденной краснухи к 2010 г. на уровень ниже 1 на 100 000 родов живым ребенком. Как уже было указано, для массовой вакцинации против кори, паротита и краснухи применяется живая трехвалентная вакцина.

Методов специфического лечения не существует.

Острые кишечные заболевания (ОКЗ) по частоте, по-видимому, занимают второе место после острых респираторных заболеваний. По данным диарейного центра (Бангладеш), ежегодно в 80-х гг. ХХ в. ОКЗ болело около 3 млрд человек и умирало от них не менее 5 – 18 млн человек. По данным ВОЗ (1992), ежегодно регистрируется от 68,4 до 275 млн диарейных заболеваний детей и взрослых. Причин повсеместного распространения ОКЗ много, но можно выделить по крайней мере три главные из них:

1. Низкий уровень жизни населения, плохие санитарно-гигиенические условия (недостаточное водоснабжение, отсутствие канализации, плохая очистка населенных мест и т. п.) значительной части населения развивающихся стран. ВОЗ установлен основной закон здравоохранения: чем выше национальный доход на душу населения страны, тем больше средняя продолжительность жизни человека и, наоборот, тем ниже заболеваемость вообще и ОКЗ в частности.

2. Отсутствие эффективных вакцин против многих кишечных заболеваний.

3. Наличие большого количества разнообразных возбудителей ОКЗ. К ним относятся различные виды бактерий (шигеллы, сальмонеллы, вибрионы, диареегенные кишечные палочки и т. п.). Однако бEольшая часть ОКЗ (около 60 %) вызывается вирусами.

Во второй половине XX в. были обнаружены неизвестные ранее вирусы (ротавирусы, астровирусы, калицивирусы и вирусы Норволк) и установлена их этиологическая роль при ОКЗ. Большинство случаев небактериальных диарей в различных регионах мира (60 – 70 %) вызывают ротавирусы и калицивирусы, остальные приходятся на долю других вирусов. Известно более 200 потенциальных возбудителей инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта человека из 11 семейств: Picornaviridae, Togaviridae, Caliciviridae, Reoviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Adenoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Parvoviridae (табл. 20). Кроме того, один из возбудителей гепатита является дефектным вирусом (HDV), структура его РНК-генома сходна со структурой вироида. Большой ущерб здоровью населения во всем мире наносят также вирусы, вызывающие гепатиты.

В истории изучения этих групп вирусов решающую роль сыграли следующие открытия: 1) 1909 г. – вирус полиомиелита; 2) 1948 г. – вирусы Коксаки; 3) 1951 г. – вирусы ЕСНО; 4) начиная с 1964 г. – возбудители вирусных гепатитов A, B, C, D, E, G (GB-C) и TT; 5) 1968 г. – калицивирусы (Норволк); 6) 1973 г. – ротавирусы.

Таблица 20

Вирусные инфекции желудочно-кишечного тракта (из обзора Д. К. Львова. Вопросы вирусологии. 1997, 6)

Энтеровирусы

Вирус полиомиелита

Геном вируса полиомиелита представлен однонитевой нефрагментированной РНК, состоящей из 7,5 – 8 тыс. нуклеотидов, ее молекулярная масса составляет 2,5 МД. Организация вирионной РНК имеет следующие особенности, определяющие характер ее поведения в клетке:

1) на долю кодирующих последовательностей приходится около 90 % всей длины;

2) между 5'-концом и началом рамки считывания находится так называемая 5'-нетранслируемая область, на долю которой приходится около 10 % длины РНК;

в этой области располагается от 6 до 12 АУГ-инициаторных кодонов;

3) геномная РНК полиовируса на 5'-конце не содержит шапочки (кэпа), вместо нее с 5'-концом РНК ковалентно связан небольшой вирусспецифический гликопротеид, который перед трансляцией отщепляется клеточным ферментом;

4) под влиянием вирионной РНК в клетке подавляется синтез белковых факторов, необходимых для инициации кэпзависимой трансляции, в результате чего кэпнезависимая трансляция вирусных белков происходит очень активно;

5) в 5'-нетранслируемой области РНК полиовируса содержится особый регуляторный элемент, который обеспечивает ее кэпнезависимую трансляцию. Установлена зависимость между нейровирулентностью вируса и степенью активности этого регуляторного элемента, который определяет интенсивность синтеза вирусных белков, особенно в нервных клетках.

Масса вириона составляет 8 – 9 МД. Вирус имеет сферическую форму. Тип симметрии – кубический. Капсид вириона образован четырьмя белками по 60 копий каждого. Три из них – VP1, VP2, VP3 – образуют внешнюю поверхность капсида, а VP4 – внутреннюю, поэтому он снаружи не виден.

Оболочка вириона формируется из 12 компактных структур, называемых пентамерами, так как они содержат по 5 молекул каждого белка. Пентамеры устроены наподобие горы, вершину которой занимает VP1, а ее основание образует VP4; белки VP2 и VP3 вперемежку окружают подножие. Геном вириона очень плотно заключен в его центральной полости. Белки оболочки играют роль в распознавании рецептора клетки-хозяина, в прикреплении вириона к ней и в высвобождении вирионной РНК внутри клетки. Гемагглютинирующими свойствами вирион не обладает. Способность вируса полиомиелита вызывать паралич также, по-видимому, связана с одним из белков оболочки. Они же – белки – определяют иммуногенные свойства вируса. По антигенным признакам вирусы полиомиелита подразделяются на три типа: I, II, III.

Наибольшей патогенностью для человека обладает полиовирус I типа: все значительные эпидемии полиомиелита были вызваны этим типом. Полиовирус III типа вызывает эпидемии реже. Полиовирусы II типа чаще вызывают латентную форму инфекции.

Внутриклеточное размножение вируса. Взаимодействие вируса с клеткой складывается из следующих стадий:

1) адсорбция вируса;

2) проникновение в клетку, сопровождающееся разрушением капсида и выделением геномной РНК.

Являясь позитивной, вРНК непосредственно транслируется в вирусспецифические белки. Одним из таких белков – неструктурным – является РНК-репликаза, при участии которой происходит репликация вРНК по схеме:

Структурные белки, все четыре, синтезируются в виде исходной единой полипептидной цепи, которая затем подвергается каскадному протеолизу и расщепляется в конечном счете на четыре белка VP1 – VP4. Это разрезание, по-видимому, катализируется самим вирусным белком, оно необходимо для формирования вновь образующихся вирионов. Вновь синтезированная вРНК включается в капсид, и формирование вириона на этом заканчивается. Вновь синтезированные вирионы выходят из клетки. Из одного вириона в клетке синтезируется до 150 000 вирионов.

Слово полиомиелит (poliomyelitis) в переводе на русский язык означает воспаление серого вещества мозга (греч. polios – серый, myelitis – воспаление спинного мозга). Дело в том, что важнейшим биологическим свойством полиовирусов является их тропизм к нервной ткани, они поражают двигательные клетки серого вещества спинного мозга.

Эпидемиология. Источником инфекции является только человек. Хотя вирус размножается в эпителиальных и лимфоидных тканях верхних дыхательных путей, воздушно-капельный способ заражения существенной роли не играет из-за отсутствия катаральных явлений. Основной способ заражения – фекально-оральный. Вирус выделяется с испражнениями в огромном количестве с конца инкубационного периода (последние 3 – 7 дней) до 40-го дня болезни, а в ряде случаев – несколько месяцев.

Патогенез и клиника полиомиелита. Входными воротами при полиомиелите является слизистая оболочка глотки, желудка и кишечника. В них происходит первичное размножение вируса, и поэтому через несколько дней после заражения его можно обнаружить в глоточной слизи и испражнениях. После размножения в эпителиальных клетках вирус проникает в регионарные лимфатические узлы, а затем в кровь. Иначе говоря, вслед за алиментарной стадией болезни наступает вирусемия с гематогенной диссеминацией возбудителя. Эти две стадии, как правило, протекают бессимптомно. Лишь иногда вирусемия сопровождается кратковременным повышением температуры и легким недомоганием, это характеризует так называемую «малую» болезнь, она заканчивается выздоровлением и формированием постинфекционного иммунитета. Однако полиовирусы могут преодолевать гематоэнцефа-

лический барьер и проникать в центральную нервную систему, в результате чего развивается «большая» болезнь. Вызываемая вирусом гибель двигательных нейронов передних рогов спинного мозга приводит к развитию параличей скелетных мышц, вследствие чего больной либо умирает, либо остается инвалидом на всю жизнь.

Различают четыре основные клинические формы полиомиелита: 1) абортивная (малая болезнь); 2) непаралитическая (менингеальная), проявляющаяся серозным менингитом; 3) паралитическая и 4) инаппарантная (скрытая).

Паралитическую форму в зависимости от локализации очага разделяют на спинальную, бульбарную, понтинную (варолиев мост) и другие, более редкие формы.

Форма течения полиомиелита определяется величиной инфицирующей дозы, степенью нейровирулентности вируса и иммунным статусом организма. Очаги поражения обнаруживаются в передних рогах спинного мозга, чаще всего в области поясничного расширения, в двигательных клетках ретикулярной формации продолговатого мозга и варолиева моста, мозжечке, в моторной и премоторной областях коры головного мозга.

Иммунитет. После перенесенного заболевания (в том числе и в скрытой форме) остается прочный пожизненный иммунитет, обусловленный вируснейтрализующими антителами и клетками иммунной памяти.

Лечение острого полиомиелита должно быть комплексным и проводиться с учетом стадии и формы болезни. При паралитических формах особенно важно соблюдать ранний ортопедический режим. Основное значение в лечении полиомиелита принадлежит правильно и длительно проводимой гимнастике. Больные с дыхательными нарушениями должны находиться под особым наблюдением специально обученного персонала. Специфическая терапия отсутствует.

Специфическая профилактика. Полиомиелит к середине ХХ в. превратился в грозную эпидемическую болезнь, периодически поражавшую тысячи и десятки тысяч человек, из которых около 10 % умирало, а у 40 % оставались пожизненные параличи. Единственным надежным оружием против этой болезни могли быть только вакцина и создание с ее помощью коллективного иммунитета. Для этого необходимо было разработать методы, которые бы позволяли накапливать вирус в необходимом количестве. И упорные усилия ученых дали, наконец, свои плоды. В конце 1940-х – начале 1950-х гг. были разработаны методы получения однослойных культур клеток (вначале первично-трипсинизированных, затем перевиваемых), которые были широко использованы для выращивания вирусов, а стало быть, возникли реальные условия для создания вакцины против полиомиелита. Следует отметить, что разработка методов получения культур клеток имела огромное значение для развития вирусологии.

В 50-х гг. ХХ в. были созданы две вакцины против полиомиелита:

1. Инактивированная формалином вакцина Дж. Солка.

2. Живая вакцина А. Себина из аттенуированных им штаммов полиовирусов I, II и III типов.

Крупномасштабное производство живой вакцины впервые было освоено в 1950-х г. в нашей стране. Сразу же (с 1959 г.) была начата массовая вакцинация детей против полиомиелита этой вакциной. Обе вакцины – убитая и живая – являются достаточно эффективными, однако в нашей стране отдается предпочтение живой вакцине, так как вакцинные штаммы, размножаясь в эпителиальных клетках кишечного тракта, выделяются во внешнюю среду и, циркулируя в коллективах, вытесняют дикие штаммы полиовирусов. По рекомендации ВОЗ, прививки против полиомиелита являются обязательными и проводятся начиная с 3-месячного возраста и до 16 лет. Поскольку живая вакцина, хотя и крайне редко, вызывает осложнения, прививки теперь рекомендуется проводить инактивированной вакциной Солка. С помощью имеющихся вакцин заболеваемость полиомиелитом во всех странах мира может и должна быть сведена до единичных случаев, т. е. появилась возможность резко снизить ее.

Ротавирусы

Ротавирус человека впервые обнаружил в 1973 г. Р. Бишоп с соавторами при электронно-микроскопическом исследовании энтероцитов двенадцатиперстной кишки у больных гастроэнтеритом детей и в их испражнениях с помощью метода иммунной электронной микроскопии (были использованы сыворотки реконвалесцентов с заведомо известными антителами), а в опытах на добровольцах была доказана их этиологическая роль.

В 1978 г. Международный комитет по таксономии вирусов выделил ротавирусы человека и животных (у которых они также были обнаружены) в самостоятельный род Rotavirus семейства Reoviridae. Родовое название происходит от латинского слова rota – колесо, так как форма вириона сходна с колесом. Это обусловлено тем, что вирион имеет сферическую форму, а его геном окружен нуклеокапсидом, состоящим из двух слоев: внутренний слой плотно окружает сердцевину, имеет форму икосаэдра и соприкасается с тонким наружным слоем капсида, в результате образуется структура, напоминающая колесо: втулка, спицы и ободок (рис. 87).

В выделениях больного обычно встречаются однокапсидные (60 – 65 нм) и двухкапсидные вирионы (70 – 75 нм). Инфекционными являются полные двухкапсидные вирионы.

Геном вириона представлен двунитевой фрагментированной РНК (11 фрагментов); в сердцевине кроме геномной РНК располагается вирионная РНК-полимераза. Суперкапсид отсутствует. В составе вириона имеется 8 белков (VP1 – VP8). Особенно важным является VP3-белок наружного капсида. Он отвечает за проникновение вируса в клетку и его вирулентность. Кроме того, он обладает гемагглютинирующим свойством. По белкам VP3 и VP7 ротавирусы делят на 4 сероварианта.

Ротавирусы человека и животных по групповым антигенам подразделяются на 6 серогрупп: A, B, C, D, E, F. Их представители не имеют антигенного родства и различаются по электрофоретическим свойствам геномной РНК. Для каждой серогруппы характерен свой профиль миграции фрагментов, состоящий из 4 классов. Идентифицированы:

С помощью электрофореза выявляют и дифференцируют вирусы различных серогрупп.

Особенностью ротавирусов человека является то, что они плохо размножаются в лабораторных условиях, и поэтому требуется длительное время для адаптации их к росту в культурах клеток.

Рис. 87. Схема строения ротавирусного вириона (по А. Г. Букринской, 1986):

1 – сердцевина, содержащая вирионную РНК; 2 – внутренний капсид; 3 – наружный капсид

Эпидемиология. Источник заражения – человек. Болеют главным образом дети в возрасте до 4 лет. Ротавирусы ежегодно вызывают более 130 млн случаев заболевания диареей, в результате чего ежегодно умирает до 600 тыс. человек.

Патогенез и клиника. Вирус размножается в эпителиальных клетках двенадцатиперстной кишки, вызывая различные повреждения. Инкубационный период варьирует от 1 до 7 дней, но обычно менее 2 сут. При типичной ротавирусной инфекции основным ранним симптомом является рвота, которая возникает раньше, чем понос, и продолжается от 2 до 6 дней. Отмечается небольшое повышение температуры. Понос проявляется в виде частых позывов, стул жидкий или полужидкий, частота позывов до 20 раз в день. Дегидратация наблюдается у 83 % больных. Длительность болезни варьирует от 4 до 7 дней, выделение вируса продолжается до 10 дней. Рвота достигает максимума в первые 2 дня болезни, понос длится дольше.

Лечение ротавирусной диареи преследует три главные цели:

1) прекращение дегидратации;

2) восстановление и поддержание нормального водно-солевого обмена;

3) обеспечение нормального питания.

Ротавирусная диарея успешно излечивается путем регидратации с помощью орального солевого раствора (NaCl – 3,5 г; NaHCO₃ – 2,5 г; KCl – 1,5 г; глюкоза – 20,0 г на 1 литр воды).

Методы диагностики ротавирусных диарей. 1. Обнаружение вируса в испражнениях с помощью электронной и иммунной электронной микроскопии, иммуноферментного анализа в твердофазном варианте, встречного иммуноэлектрофореза, иммунодиффузионной преципитации в агаре, РСК, реакции коагглютинации, клонированных РНК-зондов. 2. Специфические антитела выявляют с помощью различных серологических реакций, в том числе с помощью иммуноферментного метода, РСК, реакции нейтрализации и иммунофлуоресценции.

В нашей стране для диагностики ротавирусной инфекции предложены следующие методы: а) РПГА с применением антительного ротавирусного диагностикума; б) реакция коагглютинации; в) тест-системы для обнаружения антигена с помощью ИФМ.

Эти методы предназначены для быстрого обнаружения ротавирусов в испражнениях больного. Для обнаружения специфических антител к ротавирусам используют реакцию торможения непрямой (пассивной) гемагглютинации.

В США создана высокоэффективная вакцина против ротавирусной инфекции.

Вирусы Норволк

В 1968 г. во время вспышки ОКЗ среди школьников и учителей в городе Norwolk (США) был обнаружен возбудитель этой вспышки – вирус, получивший название Norwolk. Он был идентифицирован с помощью метода иммунной электронной микроскопии. Вирус имеет сферическую форму и диаметр 27 – 32 нм. Подобные вирусы были обнаружены при многих других вспышках гастроэнтеритов в Англии, США,

Австралии. В антигенном отношении они оказались неоднородными, установлено не менее 4 серовариантов. Геном представлен однонитевой нефрагментированной РНК позитивной полярности. Вирус отнесен к семейству Caliciviridae; это самые частые возбудители гастроэнтеритов у детей старше 4 лет и у взрослых. Вирус выделяется в первые 48 – 72 ч после заболевания, очень устойчив во внешней среде. Распространяется фекально-оральным путем через инфицированную воду и пищу. Инкубационный период 18 – 48 ч. Начало болезни острое, в 70 % случаев рвота, в 65 % – диарея. Болезнь длится 2 – 3 дня. У пожилых людей возможен летальный исход. Диагностика заболевания затруднена из-за отсутствия лабораторных тестсистем и невозможности культивирования вируса in vitro.

Калицивирусы

Впервые были выделены от животных в 1932 г., а в 1976 г. были обнаружены в фекалиях детей, страдающих острым гастроэнтеритом. Сейчас они выделены в самостоятельное семейство – Caliciviridae.

Вирионы имеют сферическую форму и диаметр 37 нм, суперкапсида нет. Геном представлен позитивной однонитевой РНК с м. м. около 2,6 – 2,8 МД. При негативно-контрастной микроскопии на поверхности вирионов обнаруживается 32 глубоких (около 10 нм) чашевидных вдавления, что послужило основанием дать им название калицивирусы (греч. calyx – чаша). Калицивирусы не размножаются в культурах клеток, это затрудняет их обнаружение. Для диагностики в основном используют метод иммунной электронной микроскопии.

Астровирусы

Были обнаружены в 1975 г. при электронномикроскопическом исследовании испражнений 120 детей в возрасте до 2-х лет, страдающих гастроэнтеритом. При электронной микроскопии вирион имел типичную звездообразную форму, поэтому ему и дали название астровирус (греч. astron – звезда). Астровирусы способны вызывать диареи и у животных. Астровирусы имеют размер около 28 нм. Геном представлен однонитевой РНК. Астровирусы относятся к семейству Caliciviridae. Различают 5 их серотипов. Повсеместно распространенное заболевание у людей – диарею новорожденных – в 75 случаев вызывает серотип 1. В составе вириона обнаружены два структурных белка. Астровирусы с трудом культивируются в культурах клеток человека и обезьян без цитопатического эффекта, поэтому вирион обнаруживают с помощью иммунофлуоресценции в культуре клеток. Для обнаружения вируса в испражнениях больных можно использовать метод иммунной электронной микроскопии.

Вирусные гепатиты – группа заболеваний с общими клиническими синдромами – представляют собой серьезнейшую глобальную проблему. Только гепатитом А ежегодно в СССР заболевало более 1 млн человек. Сколько человек ежегодно инфицируется вирусом гепатита В, сказать трудно во всяком случае не менее 50 млн человек. Если еще несколько лет тому назад в мире насчитывалось примерно 200 млн носителей вируса гепатита В, то теперь, по данным ВОЗ, носителей вируса гепатита В в мире более 2 млрд человек. Гепатит А занимает по уровню заболеваемости и причиняемому экономическому ущербу одно из первых мест среди инфекционных болезней человека.

Впервые инфекционный гепатит был выделен в самостоятельную нозологическую единицу в 1888 г. выдающимся русским врачом С. П. Боткиным. Он сумел дифференцировать инфекционный гепатит (катаральную желтуху) от других болезней печени, сопровождающихся желтухой. Поэтому в нашей стране инфекционный гепатит в течение многих десятилетий называли болезнью Боткина. Заражение инфекционным гепатитом происходит фекально-оральным путем. Однако начиная с 30-х гг. ХХ в., а именно, после того как начались массовые заболевания желтухой среди привитых против желтой лихорадки, стало ясно, что существуют две этиологически и эпидемиологически разные формы гепатита; одну из них назвали инфекционным гепатитом, а другую – сывороточным, поскольку заражение в последнем случае связывали с парентеральными манипуляциями. Следует сказать, что название «сывороточный гепатит» явно не совсем удачное, так как последний тоже является инфекционным заболеванием, как и инфекционный гепатит. Поэтому еще в 1947 г. Ф. Мак-Каллум предложил называть инфекционный гепатит гепатитом А, а сывороточный гепатит – гепатитом В. Это предложение было узаконено ВОЗ только в 1973 г.

В 1974 г. была выделена еще одна форма вирусного гепатита, а именно гепатит ни А ни В, а в 1977 г. был обнаружен возбудитель дельта-гепатита. Тот факт, что инфекционный и сывороточный гепатиты вызываются вирусами, был установлен давно в опытах на добровольцах, однако их истинные возбудители были обнаружены в 70-х гг. ХХ в. Это обусловлено тем, что, во-первых, указанные вирусы долгое время не удавалось выращивать в культурах клеток, во-вторых, долгое время не могли обнаружить восприимчивых к ним животных.

Вирусный гепатит А

Вирусный гепатит А – инфекционная болезнь человека, характеризующаяся преимущественным поражением печени и проявляющаяся клинически интоксикацией и желтухой. Вирус гепатита А был обнаружен в 1973 г. С. Фейнстоном [и др.] с помощью метода иммунной электронной микроскопии и путем заражения обезьян – шимпанзе и мармозеток. Суть метода иммунной электронной микроскопии состоит в том, что к фильтрату испражнений больного гепатитом А добавляют специфические антитела (сыворотку реконвалесцента) и осадок подвергают электронной микроскопии. Благодаря взаимодействию вирусов со специфическими антителами они подвергаются специфической агрегации. Их в этом случае легче обнаружить, а агрегация под влиянием антител подтверждает специфичность возбудителя. Открытие С. Фейнстона было подтверждено в опытах на добровольцах.

Вирус гепатита А имеет сферическую форму, диаметр вириона – 27 нм. Геном представлен однонитевой позитивной РНК с м. м. 2,6 МД. Суперкапсид отсутствует. Тип симметрии кубический – икосаэдр. Капсид имеет 32 капсомера, он образован четырьмя полипептидами (VP1 – VP4). По своим свойствам вирус гепатита А отнесен к роду Heparnovirus, семейству Picornaviridae. В антигенном отношении вирус гепатита А (HAV – hepatitis A virus) является однородным. HAV хорошо размножается в организме шимпанзе, павианов, гамадрилов и игрунковых обезьян (мармозеток). Длительное время вирус не умели культивировать. Лишь в 1980-х гг. удалось получить культуры клеток, в которых HAV размножается. Вначале для этих целей использовали перевиваемые линии клеток почки эмбриона макака-резус (культура FRhK-4), а сейчас – перевиваемую линию клеток почек зеленых мартышек (культура 4647).

Резистентность. Вирус относительно устойчив к высокой температуре, кислотам, жирорастворителям (отсутствуют липиды), дезинфицирующим средствам, хорошо переносит низкую температуру. Все это способствует длительному сохранению его во внешней среде. При комнатной температуре он выживает несколько недель, при 60 °C частично утрачивает инфекциозность через 4 – 12 ч, полностью – через несколько минут при 85 °C. Высокорезистентен к хлору, благодаря чему способен проникать в водопроводную воду через барьеры водоочистных сооружений.

Эпидемиология. Вирус гепатита А обладает высокой патогенностью для человека. По заключению ВОЗ (1987 г.), для возникновения болезни достаточно заражения всего одним вирионом. Однако практическая заражающая доза, вероятно, значительно выше. Источником инфекции является только инфицированный человек. Вирус выделяется в большом количестве с испражнениями за 12 – 14 дней до появления желтухи и в течение 3 нед. желтушного периода. Существенных различий в выделении возбудителя у больных желтушными, безжелтушными и бессимптомными формами гепатита А не выявлено. Способ заражения – фекально-оральный, главным образом водный, а также бытовым и пищевым путем. Способ заражения – фекальнооральный, главным образом водный, а также бытовым и пищевым путем. Основной (первичный) путь передачи вируса – водный. Возможно также заражение воздушно-капельным путем. Восприимчивость населения всеобщая. Болеют преимущественно дети в возрасте до 14 лет. Болезнь имеет выраженную осенне-зимнюю сезонность.

Патогенез, клиника. Инкубационный период варьирует от 15 до 50 дней, что зависит от величины заражающей дозы вируса, но в среднем составляет 28 – 30 дней. Попав в организм, вирус гепатита А размножается в регионарных лимфатических узлах, проникает в кровь, а затем в клетки печени и вызывает острый диффузный гепатит, который сопровождается поражением гепатоцитов и ретикулоэндотелиальных элементов печени и снижением ее дезинтоксикационной и барьерной функций. Повреждение гепатоцитов возникает не за счет прямого действия вируса, а в результате иммунопатологических механизмов.

Наиболее типичной картиной гепатита А является острая желтушная циклическая форма: инкубационный период, продромальный (преджелтушный), желтушный период и реконвалесценция. Однако в очагах инфекции выявляется большое количество больных с безжелтушными и бессимптомными формами инфекции, число которых значительно преобладает над желтушными («феномен айсберга»).

Постинфекционный иммунитет прочный и длительный, обусловлен вируснейтрализующими антителами и клетками иммунной памяти.

Методы микробиологической диагностики. Для диагностики гепатита А (кроме заражения животных – шимпанзе, мармозет, павианов, которых у нас нет) предложены различные иммунологические методы: РСК, иммунофлуоресцентный метод, гемагглютинация иммунного прилипания (комплекс вирусный антиген + антитело в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах и вызывает их склеивание). Однако возможности применения этих методов ограничены из-за отсутствия специфических вирусных антигенов, а реакция иммунофлуоресценции требует биоптатов печени, что нежелательно. Надежным и специфическим является метод иммунной электронной микроскопии, однако он очень трудоемкий. Поэтому пока единственной приемлемой иммунологической реакцией является метод иммуносорбентного анализа твердой фазы в виде ИФМ или РИМ, особенно в модификации «захвата» иммуноглобулинов класса M. В нашей стране для этой цели предложена тест-система – «ДИАГН-А-ГЕП». Принцип работы этой тест-системы следующий. На стенках полистироловых луночек сорбируются вначале антитела к иммуноглобулинам класса М (антииммуноглобулины М), затем добавляется исследуемая сыворотка больного. Если в ней есть антитела класса IgM, они будут связываться анти-антителами М, затем добавляется специфический вирусный антиген (вирус гепатита А), который получают путем выращивания в культуре клеток. Система промывается, и к ней добавляются противовирусные антитела, меченные пероксидазой хрена. Если произошло взаимодействие всех четырех компонентов системы, возникает четырехслойный «сэндвич»:

1) антииммуноглобулины М, 2) иммуноглобулины М (против вируса гепатита А – в исследуемой сыворотке больного), 3) вирусный антиген, 4) антивирусные антитела, меченные ферментом.

Для обнаружения этого комплекса в луночки добавляют субстрат для фермента. Под влиянием фермента он разрушается, и образуется окрашенный продукт. Интенсивность окраски можно измерить количественно с помощью спектрофотометра или фотоколориметра.

Преимущество метода «захвата» IgM состоит в том, что антитела этого класса иммуноглобулинов появляются при первичном иммунном ответе и свидетельствуют об активной стадии инфекции, они исчезают после перенесенного заболевания. Противовирусные антитела, относящиеся к классу IgG, напротив, длительное время сохраняются после перенесенного заболевания, обеспечивая приобретенный иммунитет. Для обнаружения вируса гепатита А предложен метод ДНК-зонда: используют в качестве зонда ДНК комплементарную вРНК.

Специфическая профилактика. Ранее широко применявшаяся серопрофилактика гепатита А с помощью гамма-глобулина себя не оправдала, поэтому основной упор был сделан на проведение вакцинопрофилактики. С этой целью разрабатываются и уже используются различные варианты вакцин. В России эффективная вакцина против гепатита A была получена еще в 1995 г., и сейчас она успешно применяется.

Лечение. В связи с тем что при вирусных гепатитах нарушена продукция интерферонов, для лечения гепатитов, в том числе гепатита A, применяют интерферон и индуктор его эндогенного синтеза амиксин.

Вирусный гепатит В

Гепатит В – инфекционное заболевание человека, характеризующееся избирательным поражением печени вирусом. Эта форма гепатита является наиболее опасной по своим последствиям среди всех известных форм вирусных гепатитов. Его возбудителем является вирус гепатита В (HBV).

Впервые антиген вируса гепатита В был обнаружен Б. Блюмбергом в 1964 г. в сыворотке крови австралийского аборигена, а сам возбудитель был обнаружен в 1970 г. Д. Дейном [и др.] и получил название частиц Дейна, поскольку не было полной уверенности в том, что это действительно вирус, а не его компоненты. В последующем все сомнения отпали, так как в составе частиц Дейна были обнаружены геномная ДНК и вирусная ДНК-зависимая ДНК-полимераза. В составе вириона имеются три основных антигена, для которых в 1974 г. были введены следующие обозначения:

1. HBsAg – поверхностный (superficial), или растворимый (soluble), или австралийский антиген.

2. HBcAg – сердцевинный антиген (сor-антиген).

3. HBeAg – антиген e, локализован в сердцевине вириона и, в отличие от HBcAg, не только присутствует в составе вириона, но и циркулирует в крови в свободном виде или в виде комплекса с антителом анти-HBeAg. Он выделяется в кровь из гепатоцитов при активной репликации HBV.

Поверхностный антиген – HBsAg – существует в виде трех морфологически различных вариантов: 1) представляет суперкапсид цельного вириона; 2) в большом количестве встречается в виде частиц диаметром 20 нм, имеющих сферическую форму; 3) в виде нитей длиной 230 нм. Химически они идентичны. В составе HBsAg имеется один общий антиген а и две пары взаимоисключающих типоспецифических детерминантов: d/y и w/r, поэтому существуют четыре основных субтипа HBsAg (и соответственно HBV): adw, adr, ayw и ayr. Антиген а обеспечивает формирование общего перекрестного иммунитета ко всем субтипам вируса.

Собственно вирион – частица Дейна – имеет сферическую форму и диаметр 42 нм. Суперкапсид вириона состоит из трех белков: главного (основного), большого и среднего (рис. 88, 1). Геном заключен в капсид и представлен двунитевой кольцевидной ДНК с м. м. 1,6 МД. ДНК состоит приблизительно из 3200 нуклеотидов, однако ее «плюс» – нить на 20 – 50 % короче «минус» – нити. С 5'-концом длинной нити ковалентно связан вирусспецифический белок. 5'-концы обеих нитей комплементарны и образуют «липкие» последовательности длиной в 300 нуклеотидов, благодаря чему нити замыкаются в кольцо. Содержание Г + Ц в вирионной ДНК 48 – 49 мол %. В сердцевине вириона находится кроме геномной ДНК-вирусная ДНК-зависимая ДНК-полимераза. «Минус» – нить ДНК HBV содержит всего четыре гена (S, C, P и X), но они организованы очень компактно (рис. 88, 2). Гены S, C, P, X сильно перекрываются и контролируют синтез следующих продуктов. Ген S кодирует синтез главного белка оболочки и содержит всю информацию о поверхностном антигене HBsAg. Кроме того, он кодирует синтез среднего и большого белков оболочки. Белки содержат общий СООН-конец, но их трансляция начинается с трех различных инициаторных кодонов. Ген С кодирует синтез капсидных белков (HBcAg и HBeAg); хотя эти белки кодируются одним геном, пути их трансляции различны. Ген Р – самый большой. Он включает в себя часть всех трех других генов и кодирует ферменты, необходимые для репликации вируса. В частности, он кодирует обратную транскриптазу, домен фермента РНК-азы Н, 5'-концевой белок «минус» – цепи. Ген X кодирует белки, регулирующие экспрессию (выражение) всех вирусных генов, в частности белок с м. м. 17 кД, который является трансактиватором транскрипции генов.

Белки, образующие поверхностный антиген, существуют в гликозилированной (gp) и негликозилированной форме. Гликозилированными являются gp27, gp33, gp36 и gp42 (цифры обозначают м. м. в кД). Суперкапсид HBV состоит из главного, или основного, S-белка (92 %); среднего М-белка (4 %) и большого, или длинного, L-белка (1 %).

Главный белок – p24/gp27, или основной белок (белок S), является основным компонентом оболочки HBV. В отсутствие других оболочечных белков он полимеризуется и образует сферические частицы диаметром 20 нм, которые состоят из 100 полипептидных молекул.

Рис. 88. Структура вириона HBV (1) и его генома (2)

Большой белок – p39/gp42, или длинный белок (белок L), присутствует во всех трех формах HBsAg. Он играет важную роль в морфогенезе вирионов и в выходе их из клетки. L-белок содержит последовательность белка М, которая на N-конце дополнена последовательностями из 108 (ayw) или 119 (adw, adr, ayr) аминокислотных остатков, кодируемых пре-S1-областью S-гена.

Средний белок – gp33/gp36, или белок М, также присутствует во всех трех морфологических формах HBsAg. Белок М содержит на N-конце участок из 55 аминокислотных остатков, кодируемых пре-S2-областью S-гена. Предполагается, что этот участок играет важную роль в распознавании вирусом гепатита В клеток печени ограниченного круга хозяев (человек, обезьяна шимпанзе). Последовательности белков, кодируемых пре-S-областями S-гена, обладают высокой иммуногенностью, а их детерминанты расположены на поверхности вириона. Поэтому антитела против этих антигенов играют важную роль в формировании иммунитета против гепатита В.

Синтез вирусных белков жестко контролируется на уровне транскрипции и трансляции. При транскрипции вирусного генома синтезируются два типа мРНК: а) меньшая – 2100 нуклеотидов – кодирует главный и средний белки оболочки;

б) бо́льшая – 3500 нуклеотидов, т. е. длиннее само́й геномной ДНК; она содержит концевые повторы длиной 100 нуклеотидов. Этот вид мРНК кодирует белок капсида и продукты гена Р. Она также является матрицей для репликации вирусной ДНК. В составе генома есть энхансеры (усилители транскрипции) – регуляторные элементы, которые активируют экспрессию всех вирусных генов и действуют преимущественно в клетках печени. В частности, ген S экспрессируется на очень высоком уровне только в клетках печени и под влиянием стероидных гормонов. Это обстоятельство и объясняет, почему хронический гепатит В и рак печени (гепатома) наблюдаются у мужчин чаще, чем у женщин, у которых уровень стероидных гормонов ниже.

Другие регуляторные элементы вируса гепатита В модулируют (контролируют) уровни синтеза отдельных белков. Например, большой белок синтезируется лишь в малом количестве. Больше всего его на поверхности инфекционных вирионов. А главный белок и, в меньшей степени, средний белок синтезируются в огромном количестве и покидают клетки в составе частиц поверхностного антигена, которых в сыворотке крови содержится во много раз больше, чем зрелых вирионов. Количество частиц поверхностного антигена может составлять 10¹¹– 10¹³ на 1 мл крови (несколько сотен мкг).

Вирус гепатита В выделен в новое семейство вирусов – Hepadnaviridae, род Orthohepadnavirus. Сходные с ним гепаднавирусы обнаружены у различных животных (земляных белок, сурков, бурундуков, пекинских уток).

Репродукция гепаднавирусов происходит несколько необычным образом. В частности, репликация геномной ДНК происходит через промежуточное звено – РНК, т. е. с механизмом обратной транскрипции.

Жизненный цикл вируса гепатита В.

1. Адсорбция на клетке.

2. Проникновение в клетку с помощью механизма рецепторопосредованного эндоцитоза (окаймленная ямка → окаймленный пузырек → лизосома → выход нуклеокапсида и проникновение вирусного генома в ядро гепатоцита).

3. Внутриклеточное размножение.

В ходе проникновения в клетку происходит удлинение (достраивание) короткой («плюс») цепи ДНК. В ядре клеточная ДНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует РНК размером 3500 нуклеотидов (прегеном) и мРНК, меньшие по размерам, для синтеза вирусных белков. Затем прегеном и вирусная ДНК-полимераза упаковываются во вновь синтезированный капсид, который переносится в цитоплазму. Здесь и происходит обратная транскрипция прегенома. На нем синтезируется новая «минус» – нить ДНК. После завершения синтеза «минус» – нити ДНК прегеномная РНК разрушается. Вирионная ДНК-полимераза на «минус» – цепи синтезирует «плюс» – цепь. Вирусная ДНК, теперь уже двухцепочечная, может существовать в клетке довольно долго и возвращаться в ядро для следующего цикла репликации. Если новая вирусная частица не подвергается дальнейшей репликации, то сформировавшийся нуклеокапсид, проходя через мембрану клетки, покрывается суперкапсидом, отпочковывается от клетки, и в нем немедленно прекращается удлинение короткой «плюс» – цепи ДНК. Вот почему длина этой нити варьирует. При типичной острой форме гепатита В в крови последовательно появляются следующие серологические маркеры: HBsAg, HBeAg и антитела (IgM, IgG): анти-HBcAg, анти-HBeAg и анти-HBsAg.

В составе вируса гепатита В нет онкогена, однако установлено, что, внедряясь в клеточную хромосому (в разные ее участки), вирусная ДНК может индуцировать в них различные генетические перестройки – делеции, транслокации, амплификации, которые и могут стать причиной развития рака печени – одного из самых тяжких последствий вирусного гепатита В.

Резистентность. Вирус гепатита В обладает высокой устойчивостью. При комнатной температуре сохраняет жизнеспособность в течение 3 мес., в замороженном состоянии – несколько лет. Вирус полностью инактивируется при автоклавировании (120 °C), при кипячении в течение 30 мин, сухим жаром при температуре 180 °C в течение 60 мин, при 60 °C – в течение 10 ч. Устойчив в кислой среде, но разрушается в щелочной. Вирус погибает при обработке Н₂О₂, хлорамином, формалином, фенолом и при УФ-облучении.

Эпидемиология. Источником заражения вирусом гепатита В является только человек. Вопреки прошлым представлениям о том, что заражение вирусом гепатита В

происходит исключительно парентеральным путем, теперь доказано, что он обнаруживается в различных секретах и экскретах: в слюне, носоглоточных выделениях, испражнениях, слезной жидкости, в сперме, менструальной крови и пр. Таким образом, заражение происходит не только парентеральным путем, но и половым, и вертикальным (от матери плоду), т. е. практически заражение вирусом гепатита В возможно разными способами.

От гепатита B в мире погибло столько же людей, сколько за все годы Второй мировой войны. Число носителей HBV, по данным ВОЗ, составляет от 0,1 до 20 % населения разных стран или регионов.

Патогенез и клиника. Вирус гематогенным путем заносится непосредственно в печень. В патогенезе гепатита важную роль играют аутоиммунные гуморальные и клеточные реакции. Предполагается, что поражение гепатоцитов связано не столько с непосредственным действием самого вируса, сколько с иммунологическими реакциями хозяина, возникающими в связи с модификацией клеточной мембраны вирусными белками, которые индуцируют появление аутоантител к клеткам печени. Поэтому развивающийся хронический гепатит и цирроз печени можно рассматривать как аутоиммунное заболевание.

Клеточные аутоиммунные реакции к вирусным белкам, содержащимся в мембране гепатоцитов, опосредуются Т-цитотоксическими лимфоцитами и другими киллерными клетками печени. Поэтому острую дистрофию печени можно рассматривать как реакцию отторжения своеобразного гетеротрансплантата.

Инкубационный период длится от 45 до 180 дней, в среднем составляет 60 – 90 дней. Клиническое течение гепатита В характеризуется большим разнообразием;

болезнь может протекать: в латентной форме, выявляемой лишь лабораторными методами, в типичной желтушной форме и в злокачественной форме, заканчивающейся летально. Продолжительность преджелтушной стадии составляет от одного дня до нескольких недель. Желтушный период, как правило, длительный и характеризуется хорошо выраженными симптомами (желтуха, гипербилирубинемия, потемнение мочи, желтушность склер). Затяжная форма наблюдается у 15 – 20 % больных, а у 90 % из них развивается хронический гепатит В. У больных с затяжной формой нередко наблюдаются аутоиммунные процессы, сопровождающиеся повышенным содержанием противопеченочных антител, которые выявляются с помощью иммуносорбентного анализа (ИФМ). У детей гепатит В протекает в более легкой форме и часто без развития желтухи, у детей младшего возраста – преимущественно бессимптомно.

Постинфекционный иммунитет (гуморальный и клеточный) длительный, пожизненный, обусловлен вируснейтрализующими антителами (анти-HBsAg) при отсутствии в крови поверхностного антигена. Нередко наблюдается скрытая иммунизация вследствие повторного контакта с HBV, которая является причиной широкого распространения иммунитета к вирусу среди населения. Обычно больные с острой формой гепатита В выздоравливают полностью по мере накопления антител к нему. Однако в некоторых случаях, несмотря на высокий уровень вирусного антигена в крови (обстоятельство, объясняющее, почему парентеральное заражение происходит наиболее часто), антитела к нему не вырабатываются. Вирус сохраняется в печени, и человек на долгое время, иногда пожизненно, становится хроническим носителем. Это обстоятельство связано, очевидно, со слабым иммунным ответом. Одним из наиболее частых исходов хронического гепатита В является цирроз печени и рак печени, который развивается по истечении латентного периода продолжительностью до 30 – 50 лет.

Методы диагностики гепатита В. В настоящее время основным методом диагностики гепатита В является использование реакции обратной пассивной гемагглютинации (РОПГА) для обнаружения вируса или его поверхностного антигена – HBsAg. Как уже отмечалось, в крови поверхностного антигена содержится во много раз больше, чем самого вируса (в 100 – 1000 раз). Для реакции РОПГА используют сенсибилизированные антителами против вируса гепатита В эритроциты. При наличии антигена в крови происходит реакция гемагглютинации. РОПГА проста, удобна, очень специфична. Для обнаружения антител к вирусному антигену HBsAg используют различные иммунологические методы (РСК, РПГА, ИФМ, РИМ и др.). Кроме того, для обнаружения HBV и его антигенов используют варианты ПЦР.

Для обнаружения в сыворотке больного антител к вирусному антигену (HBsAg) могут быть использованы различные иммунологические методы (РСК, РПГА, реакция преципитации, ИФМ, РИМ и др.).

Специфическая профилактика. Принимая во внимание высокий уровень заболеваемости гепатитом В, а также, что в мире очень много носителей HBV, по рекомендации ВОЗ прививки против гепатита В являются обязательными и должны проводиться на первом году жизни. Для вакцинации предложено два типа вакцин. Для приготовления одной из них в качестве сырья используют плазму вирусоносителей, поскольку в ней вирусный антиген содержится в количествах, достаточных для приготовления вакцины. Главное условие для приготовления этого типа вакцин – их полная безопасность, т. е. полная инактивация вируса, что и предусматривается технологией приготовления вакцины. Для изготовления вакцины другого типа применяют методы генной инженерии, в частности, для получения антигенного материала используют рекомбинантный клон дрожжей, вырабатывающих поверхностный антиген вируса гепатита В. О дивакцине против гепатитов A и B см. с. 6.

Обе вакцины обладают высокой эффективностью (защищают 95 % привитых). Продолжительность поствакцинального иммунитета не менее 5 – 6 лет. В России созданы вакцины как для взрослых людей, так и для новорожденных и детей раннего возраста – наиболее важный компонент борьбы с гепатитом В в глобальном плане. Полный курс прививки состоит из трех инъекций:

I доза – сразу после рождения; II доза – через 1 – 2 мес.; III доза – до конца 1-го года жизни.

Эти прививки включены в расширенную программу иммунизации ВОЗ и совмещаются с календарем ее проведения (по рекомендации ВОЗ, на 1-м году жизни проводят прививки против туберкулеза, полиомиелита, гепатита В, кори, столбняка, дифтерии, коклюша).

Гамма-глобулин, содержащий антитела против HBV, применяют для экстренной пассивной иммунопрофилактики лицам, имевшим контакт с больным гепатитом В. Для лечения гепатита B (острой и хронической форм) используют интерферон и амиксин (для индукции его эндогенного синтеза). При лечении хронического гепатита B эффективен новый препарат ламивудин (синтетический нуклеозид).

Дельта-гепатит

Возбудитель (HDV) обнаружен в 1977 г. М. Ризетто с сотрудниками в ядрах гепатоцитов у больных хроническим гепатитом с помощью метода иммунофлуоресценции. Форма вириона сферическая, диаметр 35 – 37 нм. Геном – одноцепочечная кольцевая РНК с м. м. 0,5 МД (как у вироидов). Вирион имеет два белка – внутренний и наружный. Внутренний белок HDAg кодируется геном HDV, а наружный – геном HBV, т. е. это поверхностный антиген вируса гепатита В – HBsAg. В связи с этим полагают, что HDV – это сателлит вируса гепатита В, и для размножения HDV требуется наличие вируса-хозяина (HBV). Различают три геноварианта HDV (I – III). Заражение происходит парентерально (с кровью и ее препаратами) или от матери к плоду. С HDV связано большинство молниеносных форм гепатита В и около 30 % циррозов печени у больных гепатитом В. Около 5 % носителей HBV в мире инфицированы HDV. Основной метод диагностики – обнаружение специфических к HDV антител (ИФМ, РИФ и др.) или антигена (ПЦР). Вакцинация против гепатита В служит средством профилактики и дальта-гепатита.

Вирусный гепатит Е

Вирус гепатита Е (HEV) имеет сферическую форму, диаметр 27 – 34 нм, тип симметрии нуклеокапсида икосаэдрический, наружной оболочки нет. Геном представлен одноцепочечной нефрагментированной позитивной РНК из 7500 оснований, содержит три открытые рамки считывания, кодирующие вирусспецифические белки. На поверхности вириона имеются вдавления, напоминающие чаши (греч. calyx), поэтому первоначально вирус был включен в семейство Caliciviridae (род Hepavirus). Более подробное изучение генома HEV показало, что нуклеотидная последовательность его РНК уникальна и имеет лишь некоторое сходство с вирусом краснухи. HEV имеет и ряд других существенных отличий от калицивирусов. Поэтому в 1998 г. было решено исключить его из семейства Caliciviridae и отнести его к неклассифицированным вирусам. Возможно, что это самостоятельный вид отдельного семейства.

Источник инфекции – только человек, возбудитель выделяется с испражнениями. Механизм заражения – фекально-оральный. Основной путь заражения – через загрязненную испражнениями воду. Заражающая доза по сравнению с вирусом гепатита А существенно выше. Восприимчивость к вирусу HEV всеобщая. Эпидемии могут охватить десятки тысяч людей при нарушении питьевого режима, особенно во время сезонных работ летом и осенью.

Клинически болезнь протекает легче, чем гепатит А, перехода в хроническую форму не отмечено. У 85 – 90 % больных гепатит Е протекает в легкой или средней тяжести форме, часто бессимптомно. Однако у беременных женщин гепатит Е протекает тяжело – с летальностью до 20 %.

Для диагностики используют метод иммунной электронной микроскопии; предложена тест-система для обнаружения антител к антигенам HEV. Постинфекционный иммунитет прочный, пожизненный, обусловлен вируснейтрализующими антителами и клетками иммунной памяти. Для специфической профилактики предложена цельновирионная вакцина и разрабатываются живые и рекомбинантные вакцины.

Вирусный гепатит С

Вирус гепатита C (HCV) открыт в конце 80-х гг. XX в. М. Хогтом с соавторами (Hougt M. [et al.]). Он относится к семейству Flaviviridae, рoду Hepacivirus; имеет суперкапсид, форма сферическая, диаметр 55 – 65 нм. Геном представлен однонитевой нефрагментированной РНК позитивной полярности длиной 9500 – 10 000 нуклеотидов. Образующийся при репликации вируса полипротеиновый предшественник разрезается клеточной и вирусной протеазами на белки: С (нуклеопротеин), 2 белка оболочки и 6 неструктурных белков, необходимых для регуляции репродукции вируса. Вирус отличается высокой изменчивостью всех генов. Известно до 14 геновариантов и более 90 их подтипов. Геновариант вируса определяет течение инфекции, переход ее в хроническую форму и в последующем – развитие цирроза и карциномы печени. Наиболее опасны геноварианты 1b и 4a. В России циркулируют генотипы 1b, 2a, 2b и 3а. Вирус гепатита С распространен повсеместно. По данным ВОЗ, около 1 % населения планеты инфицировано HCV.

Источником инфекции является только человек. Вирус у больных и носителей обнаруживается в 100 % случаев в крови (2/3 всех посттрансфузионных гепатитов вызывает HCV), в 50 % – в слюне, в 25 % – в сперме, в 5 % – в моче. Это определяет пути заражения.

Клиническое течение гепатита С легче, чем гепатита В. Вирус С называют «мягким убийцей». Желтуха наблюдается в 25 % случаев; до 70 % случаев заболевания протекают в скрытой форме. Независимо от тяжести течения в 50 – 80 % случаев гепатит С принимает хроническую форму, а у таких больных в 20 % случаев впоследствии развиваются цирроз, карцинома. В опытах на мышах установлено, что вирус гепатита С помимо гепатоцитов может поражать и нервные клетки, вызывая тяжелейшие последствия.

Вирус в культуре клеток размножается плохо, поэтому диагностика его затруднена. Это один из немногих вирусов, для которых определение РНК – единственный способ идентификации. Возможно определение РНК вируса с помощью ЦПР в варианте с обратной транскрипцией, методом ИФА антител к вирусу с использованием рекомбинантных белков и синтетических пептидов.

Интерферон, продукция которого при хронических гепатитах нарушена, и индуктор его эндогенного синтеза амиксин – основные патогенетические средства лечения всех вирусных гепатитов.

Вирусный гепатит G (GB-C)

Вирус гепатита G (HGV) открыт в 1995 г., относится к семейству Flaviviridae (poд Hepacivirus). Геном вируса G – одноцепочечная нефрагментированная позитивная РНК длиной ~9500 оснований. Структурная организация генома вируса G подобна таковой HVC. Геном содержит одну большую рамку считывания, которая кодирует полипротеин-предшественник, содержащий около 2800 аминокислотных остатков. Он разрезается клеточной и вирусной протеазами с образованием двух структурных и не менее пяти неструктурных белков. Гены, кодирующие структурные белки (cor и env), прилегают к 5'-концу вирусной РНК, а гены неструктурных белков (хеликазы, протеазы, полимеразы) – к 3'-концу. Установлено, что неструктурные гены HGV сходны с генами вируса гепатита С, а также вирусов GBV-A и GBV-B. Все эти вирусы выделены в один род Hepacivirus семейства Flaviviridae. По строению структурных генов HGV не имеют ничего общего с GBV-A и HCV и лишь отдаленно напоминают GBV-B. Вирус гепатита G оказался идентичным вирусу GBV-C, выделенному также при изучении субпопуляции вирусов GBV от обезьян тамаринов, через которых пассировали РНК-вирус от больного острым гепатитом неустановленной этиологии, имевшего инициалы GB; в честь него все эти вирусы и получили название вирусов гепатита GBV-A, GBV-B, GBV-C. Вирус HGV (GB-C) имеет дефектный cor-белок и обладает менее выраженной изменчивостью, чем HCV. Выделено 3 типа и 5 субтипов генома HGV. Доминирует генотип 2а, в том числе и на территории России, Казахстана и Киргизии. Маркеры вируса G обнаружены у 2 % населения этих стран. Вирус G обнаруживается в разных странах мира у 1 – 2 % доноров крови, т. е. чаще, чем вирус гепатита С. Подобно гепатоцитным вирусам HBV/HCV этот вирус способен к персистенции, но реже ведет к хронической патологии, и протекает эта персистенция, вероятно, по типу здорового носительства. Острые клинические проявления гепатита G также менее тяжелы, чем при гепатитах В и С. Для диагностики гепатита G используют ЦПР и ИФМ.

Вирус TT (TTV)

Вирус открыт японским ученым Т. Нисизавой (T. Nishizava) [и др.] в 1997 г. в сыворотке больного (TT – инициалы больного), но не в виде вириона, а как фрагмент его геномной однонитевой кольцевидной минус-ДНК размером 2,6 кД. Вирион диаметром 30 – 50 нм лишен липидной оболочки, капсид имеет кубический тип симметрии. ДНК содержит три открытые рамки считывания и нетранслируемый участок, содержащий много инвертированных повторов, за счет которого и происходят внутригеномные перестройки. Дифференцировано более 16 генотипов. Вирус идентифицирован как первый представитель нового семейства Circinoviridae. Диагностика основана на выявлении вирусной ДНК с помощью ПЦР. Вирусоносительство среди населения достигает 80 % и обнаруживается у 15 – 30 % людей с заболеваниями печени. Вирус способен размножаться в гепатоцитах, передается гемотрансфузионно и фекально-оральным путем. Однако вопрос о том, действительно ли вирус TT является возбудителем гепатита, остается открытым; высказываются различные версии. К числу возможных возбудителей гепатита относится также группа SEN-вирусов (SENV) (SEN-A – SEN-H). Геном SENV – одноцепочечная линейная ДНК, состоящая из 3800 нуклеотидов, имеет три вариабельные открытые рамки считывания. Вирусы размножаются в гепатоцитах, передаются при переливании крови. Вирусы SEN-D и SEN-H чаще присутствуют в крови больных гепатитами B и C.

Семейство Herpesviridae (греч. herpes – ползучий) по современной классификации подразделяют на 3 подсемейства. Alphaherpesvirinae характеризуются высокой цитопатической активностью с относительно коротким репликативным циклом и широким кругом поражаемых хозяев, часто вызывают латентное пожизненное инфицирование ганглиев. К ним относятся вирусы простого герпеса 1-го и 2-го типов (соответственно ГВЧ-1² и ГВЧ-2 – род Simplexvirus), вирус ветряной оспы – опоясывающего лишая, или вирус VZV (ГВЧ-3, род Varicellovirus), и многочисленные вирусы животных. Betaherpesvirinae включают вирусы цитомегалии человека и мышей и характеризуются более длительным репродуктивным циклом с медленно развивающимся цитопатическим эффектом и узким кругом хозяев. К ним относятся цитомегаловирус человека (ГВЧ-5 – род Cytomegalovirus), а также ГВЧ-6 и ГВЧ-7 – возбудители внезапной экзантемы (эритемы новорожденных) и синдрома хронической усталости и иммунной депрессии (род Roseolovirus). Gammaherpesvirinae также имеют узкий круг хозяев, размножаются в лимфобластоидных клетках и специфичны для Т– и В-лимфоцитов, часто вызывая латентную инфекцию, обнаруживаемую в лимфоидной ткани. В это подсемейство включены вирус Эпстайна-Барр (ГВЧ-4 – род Lymphocryptovirus), вирус саркомы Капоши (ГВЧ-8 – род Rhadinovirus), вирус болезни Марека и некоторые герпесвирусы обезьян.

ГВЧ-1 вызывает у человека орофарингеальный герпес (десны и слизистая рта), лабиальный герпес, герпес кожи, офтальмогерпес, генитальный герпес, энцефалит, пневмонии. ГВЧ-2 вызывает генитальный герпес, неонатальный герпес, диссеминированный герпес. ГВЧ-3 вызывает ветряную оспу (ветрянку) и опоясывающий лишай (опоясывающий герпес); язвенно-некротическая форма herpes zoster – один из признаков заболевания СПИД. ГВЧ-4 – причина инфекционного мононуклеоза, назофарингеальной карциномы, лимфомы Беркитта, В-клеточной лимфомы, синдрома хронической усталости и иммунной депрессии. ГВЧ-5 вызывает врожденные повреждения ЦНС, ретинопатии, интерстициальную пневмонию, гепатит, энтероколит при ВИЧ-инфекции, цитомегалию при иммунодефиците и трансплантации органов и костного мозга.

Вирион герпесвируса состоит из трех основных компонентов (см. рис. 77.2): нуклеоида, располагающегося в центральной части; капсида, покрывающего нуклеоид и состоящего из капсомеров; и оболочки. Диаметр вириона 150 – 210 нм. Геном представлен двунитевой линейной ДНК с молекулярной массой 92 – 102 МД и состоит из двух фрагментов, связанных ковалентно: короткого S (10 МД) и длинного L (68 – 75 МД). Содержание Г + Ц составляет 57 – 74 мол. %. Капсид окружает «ядро» вириона, состоящее из ДНК, покрытой белком. ДНК вируса как бы намотана на цилиндрическую массу, расположенную внутри капсида. Капсид имеет форму икосаэдра диаметром 100 нм (иногда 120 – 150 нм) и построен из 162 капсомеров. Каждый капсомер имеет длину 12,5 нм, диаметр 8,5 нм и центральное углубление в 4 нм.

Герпесвирусы термолабильны: инактивируются при температуре 50 – 52 °C в течение 30 мин, при 37 °C – в течение 10 ч. Соли, добавленные в среду, могут или увеличивать (Na₂SO₄, Na₂HPO₄), или снижать (MgCl₂, MgSO₄, NaCl, KCl и др.) термостабильность. Наиболее термостабилен вирус при рН 6,5 – 6,9. Способен длительно сохраняться при низких температурах, особенно при – 70 °C. Инактивируется УФ-лучами, фотодинамическим действием красителей. Очень чувствителен к спиртам и другим органическим жирорастворителям, детергентам, протеазам, фосфатазе, желчи.

Вирус простого герпеса

Инфекция, вызванная вирусом простого герпеса, может иметь несколько клинических форм, но чаще всего бессимптомна. Обычными клиническими проявлениями бывают везикулярные высыпания на коже и слизистых оболочках. Иногда может быть тяжелый кератит, менингоэнцефалит или диссеминированное заболевание новорожденных. Вирус простого герпеса патогенен для многих видов животных – мышей, крыс, хомячков, морских свинок, кроликов, собак, обезьян, у которых обычно вызывает лихорадку и энцефалит (при внутримозговом заражении), а у кроликов также кератоконъюнктивит.

Так как вирус обладает дермонейротропным действием, то у выживших животных и инфицированных людей он может длительно сохраняться в латентном состоянии в мозге, эпителиальных клетках, ганглиях тройничного и других нервов в виде двунитевых кольцевых форм ДНК.

Вирус хорошо размножается в хорион-аллантоисной оболочке куриных эмбрионов, где через 2 – 3 сут. после заражения образует выпуклые белые бляшки, видимые невооруженным глазом. В препаратах-отпечатках из них видны гигантские клетки с внутриядерными включениями. Вирус легко размножается почти во всех широко используемых культурах клеток, образуя в монослоях бляшки. В зараженных клетках образуются тельца-включения, появляются гигантские многоядерные клетки, которые далее некротизируются (цитопатический эффект). Особенно пригодна для заражения первичная культура клеток почек кролика.

Эпидемиология различна для вирусов типов 1 и 2. Имеются данные, что до 70 – 90 % людей инфицированы вирусом герпеса типа 1 и что он присутствует в организме человека более постоянно, чем любой другой вирус. Первичное инфицирование происходит в раннем периоде жизни. После исчезновения материнских антител инфекция протекает в виде везикулярного или афтозного стоматита. Вирус уже не удаляется из организма, так как не доступен действию антител. Вирус герпеса типа 1 передается прямым контактом через слюну или через посуду, загрязненную слюной носителя. Источником заражения детей обычно является один из родителей с активной формой герпеса.

Вирус простого герпеса типа 2 передается половым путем или во время родов от больной матери. Распространяется как типичная венерическая болезнь. Источник инфекции – только человек.

Особенности патогенеза. ГВЧ-1 и -2 проникают в клетку-мишень в несколько стадий при участии различных своих гликопротеидов, однако решающим является связывание гликопротеида D со специфическим рецептором клетки-хозяина; только после этого происходит депротеинизация вируса и проникновение его нуклеокапсида в цитоплазму. ГВЧ-1 в качестве рецептора распознает нектин-1 и HVEM (родствен фактору некроза опухоли), а ГВЧ-2 – также и нектин-2. Т-лимфоциты экспрессируют HVEM и нектин-2, но не нектин-1, нервные клетки – только нектин-1, а эпителиоциты – полный спектр распознаваемых этими вирусами рецепторов, что и определяет тропизм их действия.

После попадания в организм вирус может далее распространяться нейрогенно (эндоневрально, периневрально, по шванновским клеткам) и гематогенным путем. Вирус простого герпеса обладает не только дермотропным, но и комбинированным нейроиммунотропным действием и способен к пожизненной персистенции в организме. У 30 – 50 % инфицированных людей может развиваться рецидивирующая герпетическая инфекция в той или иной форме, причем лабиальный герпес и поражения полости рта хотя бы раз на протяжении жизни возникают у 75 % людей. Рецидивы могут быть спровоцированы различными агентами: солнечная радиация, лихорадка, стресс, острая пища, прием алкоголя и др.

Есть две гипотезы, объясняющие причины возникновения рецидивов инфекции, – статическая и динамическая. Согласно первой, вирус находится в клетках паравертебральных ганглиев в виде провируса, но под влиянием пускового фактора реактивируется и перемещается по аксону периферического нерва к участку, где формируется очаг поражения. Динамическая гипотеза предполагает постоянную репродукцию и выделение ограниченного числа вируса к очагу поражения, где возникают бессимптомно протекающие микроочаги благодаря адекватному функционированию местного иммунитета кожи и слизистых. Доказана способность вируса простого герпеса «ускользать» от иммунной системы хозяина за счет подавления апоптоза клеток, инфицированных вирусом, и за счет блокирования классического и альтернативного путей активации системы комплемента (один из гликопротеидов вируса препятствует связыванию С5 компонента комплемента и пропердина с C5b, делая невозможным лизис инфицированной вирусом клетки).

ГВЧ-1 может вызывать острый (афтозный) стоматит, чаще у детей; губной герпес, герпетическую экзему, кератоконъюнктивит, редко – менингоэнцефалит. ГВЧ-2 вызывает генитальный герпес (характерны частые рецидивы) и герпес новорожденных. Возможно трансплацентарное заражение плода, приводящее к врожденным уродствам.

Иммунитет. Ребенок первых 6 мес. жизни имеет, как правило, антитела к вирусу, приобретенные пассивно от матери. Далее они утрачиваются, ребенок наиболее восприимчив к герпетической инфекции в возрасте от 6 мес. до 2 лет. В крови переболевших обнаруживаются антитела, нейтрализующие вирус, а также специфические IgA на слизистых, но они не препятствуют персистированию вируса и развитию латентной инфекции.

Лабораторная диагностика. Для диагностики могут быть использованы вирусоскопический, вирусологический и серологический методы. Материалом для исследования служат соскобы с роговой оболочки, содержимое пузырьков, слюна и др. Соскобы и мазки, взятые из основания свежих герпетических высыпаний и окрашенные по Романовскому – Гимзе после немедленной фиксации в абсолютном спирте, содержат гигантские многоядерные клетки с внутриядерными включениями (тельца Каудри).

Для выделения вируса используют культуры клеток, куриные эмбрионы и лабораторных животных. В зараженных культурах клеток обнаруживают бляшки и характерный цитопатический эффект, в куриных эмбрионах при заражении на хорион-аллантоисную оболочку обнаруживают бляшки, причем бляшки, образованные вирусом герпеса типа 2, крупнее бляшек, образованных вирусом типа 1. При заражении новорожденных мышей в мозг симптомы энцефалита развиваются на 2 – 6-й день. Очень чувствительно и специфично для вируса герпеса заражение на скарифицированную роговицу кролика. Окончательную идентификацию производят в реакции нейтрализации на мышах, куриных эмбрионах или клеточных культурах с использованием стандартных противогерпетических иммунных сывороток животных, а также в реакции иммунофлуоресценции (РИФ).

При серодиагностике важно решить, первичное это заболевание или обострение хронической инфекции. Поэтому используют парные сыворотки, которые исследуют с помощью РСК, РИФ и ИФМ.

Лечение и специфическая профилактика. В качестве средств специфического лечения используют химиопрепараты – модифицированные нуклеозиды, подавляющие репликацию вируса, но обладающие токсичностью и способствующие появлению резистентных к ним штаммов вируса (аденин-арабинозид, 5-йод-2'-дезоксиуридин, ацикловир и др.). Эффективны, особенно в случае острого течения заболевания, индукторы интерферона. Для лечебных целей в тяжелых случаях, а также для профилактики при частых рецидивах используют убитую культуральную герпетическую вакцину.

Вирус ветряной оспы – зостер (V – Z)

Вирус V – Z может вызывать высококонтагиозное легкое заболевание у детей – ветряную оспу, проявляющуюся в развитии везикулезной сыпи на коже и слизистых. У взрослых (и крайне редко у детей) этот же вирус вызывает опоясывающий лишай (зостер), характеризующийся воспалительной реакцией в задних корешках спинного мозга и в ганглиях; он сопровождается высыпанием пузырьков на коже в участке, иннервируемом пораженным чувствительным нервом. Ветряная оспа рассматривается как реакция на первичный контакт вируса с организмом человека, тогда как зостер – это ответ частично иммунного хозяина на реактивацию вируса, присутствующего в латентной форме в чувствительных ганглиях.

Этот вирус идентичен вирусу простого герпеса по морфологическим, биологическим и даже антигенным свойствам, но он не размножается в организме лабораторных животных. Оказывает действие на клетки человека: часто видны остановка деления в метафазе, сморщивание хромосом, разрыв хромосом и образование микроядрышек.

Патогенез и клиника. Вирус V – Z передается воздушно-капельным путем, источник инфекции – больной человек. Первичное размножение вируса происходит в эпителии слизистой оболочки верхних дыхательных путей. Далее лимфогенным путем вирус проникает в кровь, с ней – в кожу. Эпителиальные клетки набухают, наблюдается баллонирующая дегенерация (дистрофия) клеток шиповатого слоя, накопление тканевой жидкости приводит к образованию пузырьков. В ядрах пораженных клеток, особенно на ранних стадиях, обнаруживаются эозинофильные тельца-включения. При опоясывающем лишае, помимо этого, имеется воспалительная реакция в задних корешках спинного мозга и чувствительных ганглиях. Инкубационный период при ветряной оспе – 14 – 21 день, при опоясывающем лишае не известен. Заболевание начинается с недомогания, подъема температуры, появления сыпи на лице, затем на туловище и конечностях. Сначала появляется зудящее пятнышко, которое довольно быстро превращается в пузырек, наполненный серозно-мутной жидкостью. Затем пузырек лопается, на его месте образуется корочка, впоследствии отторгающаяся и не оставляющая рубца. Высыпания новых пузырьков продолжаются 3 – 4 дня, содержимое их включает огромное количество вируса. Летальность и осложнения (энцефалит, пневмония) довольно редки, чаще наблюдаются у новорожденных. В первые три месяца беременности перенесенная ветряная оспа у женщин может привести к врожденным уродствам плода.

При опоясывающем лишае вслед за недомоганием и подъемом температуры появляются сильнейшие боли в области слизистой оболочки или кожи, иннервируемой одной или несколькими группами чувствительных ганглиев. Через несколько дней в этой зоне появляются пузырьки. Чаще всего это наблюдается на туловище (по ходу межреберного нерва), на коже головы или шеи.

Лабораторная диагностика проводится так же, как диагностика простого герпеса, но следует учитывать следующие моменты. Вирус простого герпеса вызывает развитие поражений в роговице кроликов, мозге мышей и на хорион-аллантоисной оболочке куриного эмбриона, тогда как вирус V – Z почти не заражает указанные ткани. В большинстве культур клеток вирус простого герпеса растет быстро, образует бляшки за 18 – 24 ч. Вирус V – Z растет в основном в фибробластных клетках в течение 3 – 5 дней. Отличаются эти вирусы по морфологии (в основном, размерами) вирионов в везикулярной жидкости при электронной микроскопии, а также по присутствию в везикулярной жидкости антигена, выявляемого методом иммунодиффузии в геле со специфическими преципитирующими сыворотками (против вирусов герпеса, V – Z и осповакцины).

Лечение и специфическая профилактика. Хорошим лечебным эффектом обладает гамма-глобулин, полученный из сыворотки больных опоясывающим лишаем в стадии выздоровления. Этот препарат можно использовать и для профилактики ветряной оспы у контактных детей, имеющих иммунодефицитные состояния.

Цитомегаловирус человека

Цитомегалия с внутриклеточными включениями является генерализованной инфекцией новорожденных, вызванной внутриутробным заражением цитомегаловирусом (ЦМВ) или заражением сразу после рождения. Инфекция распространена широко и повсеместно, антитела к вирусу цитомегалии обнаружены у 80 % людей старше 35 лет. ЦМВ удается выделять из шейки матки почти у 10 % здоровых женщин. Заболевание характеризуется возникновением крупных внутриядерных включений в слюнных железах, легких, печени, поджелудочной железе, почках, железах внутренней секреции и иногда в мозге. Умирают в основном дети в возрасте до 2 лет. Для старших детей и подростков характернее бессимптомная инфекция. У взрослых, получающих для лечения иммунодепрессанты, часто развивается тяжелая цитомегаловирусная инфекция.

ЦМВ весьма похож на вирусы простого герпеса и V – Z, но отличается от них по следующим признакам. ЦМВ имеет более продолжительный цикл внутриклеточной репродукции (1 – 2 нед.) и поэтому обладает меньшей цитопатической активностью, имеет чрезвычайно узкий круг хозяев (только человек) и менее чувствителен к модифицированным нуклеозидам, так как слабо способен индуцировать вирусспецифическую тимидинкиназу.

Патогенез и клиника. При внутриутробном заражении развивается наиболее тяжелая форма болезни. Дети могут инфицироваться также контактным или алиментарным путем, так как больные способны выделять вирус с мочой довольно продолжительное время. ЦМВ размножается в эпителиальных клетках различных внутренних органов, в них он может длительно персистировать. Характерны изменения в клетке, в которой размножается ЦМВ: размер цитомегалических клеток 25 – 40 мкм, в их ядрах имеются 1 – 2 включения, состоящие из вирусных частиц и ядерного хроматина, окруженные светлым ободком.

При врожденной цитомегалии наблюдается специфический синдром, характеризующийся признаками незрелости плода, желтухой, увеличенными печенью и селезенкой, тромбоцитопенической пурпурой, пневмонией и различными повреждениями ЦНС (микроцефалия, хориоретинит, атрофия зрительного нерва, олигофрения и др.). У детей при приобретенной цитомегалии развиваются гепатит, интерстициальная пневмония или гемолитическая анемия. Вирус обнаруживают в слюнных железах и почках, откуда он может продолжительное время выделяться. При заболевании большое значение имеют иммунопатологические реакции: иммунный лизис клеток системой антитело + комплемент и цитотоксическими лимфоцитами, появление иммунных комплексов в крови и тканях. Резко увеличивается количество Т-супрессоров, и отношение Т-хелперов к Т-супрессорам падает до 0,23.

Иммунитет носит гуморальный характер: в сыворотке появляются комплементсвязывающие и вируснейтрализующие антитела.

Лабораторная диагностика. Вирус может быть выделен из разного патологического (в том числе секционного) материала путем заражения культур клеток фибробластов человека и диплоидных культур клеток легких человека. Через 1 – 2 нед. появляются типичные цитомегалические клетки. Их также можно обнаружить с помощью электронной микроскопии клеточного осадка мочи, где вирус присутствует в больших количествах. Антитела в парных сыворотках определяют в реакции нейтрализации в культуре клеток, а также с помощью РСК, РПГА, РИФ, ИФМ и РИМ.

Лечение и специфическая профилактика. Имеются данные об успешном применении аномальных нуклеозидов с лечебной целью при различных формах цитомегалии. Целесообразно также использование иммуномодуляторов (левомизол), так как вирус обладает иммунодепрессивным действием. Для специфической профилактики разработаны живые вакцины, полученные из аттенуированных штаммов и применяющиеся в виде моновакцины и дивакцины в сочетании с вакциной против краснухи.

Вирус Эпстайна – Барр

Вирус Эпстайна – Барр (ЭБ) вызывает инфекционный мононуклеоз, которым болеют люди всех возрастных групп, а также встречающуюся у детей и юношей в Центральной Африке опухоль чаще всего верхней челюсти – лимфому Беркитта и у взрослых мужчин в Китае – назофарингеальную карциному. Вирус ЭБ впервые был выявлен при электронной микроскопии перевиваемых клеток, полученных из лимфомы Беркитта.

Вирус ЭБ от других герпесвирусов существенно отличается по антигенным свойствам. С помощью РСК, иммунодиффузии и РИФ обнаруживают различные антигены. Раньше всего обнаруживается мембранный антиген (МА, или LYDMA: membrane antigen, или lymphocyte detected membrane antigen), комплементсвязывающий ядерный антиген (EBNA – Epstein – Barris nucleic antigen); поздним антигеном является антиген вирусного капсида (VCA – virus capsid antigen).

Вирус ЭБ весьма оригинален во взаимодействии с поражаемой им клеткой-хозяином: он вызывает не гибель, а пролиферацию лимфоцитов. Вызванная вирусом ЭБ трансформация лимфоцитов позволяет длительно культивировать последние; при этом выявляется положительная РИФ с антисывороткой к вирусу ЭБ. Указанная трансформация делает лимфоциты способными к бесконечному делению. Во всех клетках в больших количествах появляются геномы вируса ЭБ, а в окружающую среду выделяется ядерный антиген (EBNA).

Патогенез и клиника. Патогенез инфекции, вызванной вирусом ЭБ, до сих пор мало понятен. При инфекционном мононуклеозе вирус ЭБ попадает на слизистую рото– и носоглотки, далее проникает в регионарные лимфатические узлы, размножается и диссеминируется гематогенным путем. В лимфатических узлах, миндалинах и селезенке происходит пролиферация ретикулярных и лимфоидных клеток с образованием крупных мононуклеарных форм; нередко возникают очаговые некрозы. В печени могут образовываться лимфоидные клеточные инфильтраты.

Инкубационный период при инфекционном мононуклеозе от 4 до 60 дней, чаще 7 – 10 дней. Для заболевания характерно постепенное развитие: повышается температура, появляется боль в горле, нарушается носовое дыхание, увеличиваются регионарные лимфатические узлы, на миндалинах появляется налет. В крови отмечается лейкоцитоз, одним из самых характерных признаков заболевания является появление в крови атипичных зрелых одноядерных клеток среднего и крупного размера с широкой базофильной протоплазмой – атипичных мононуклеаров и широкоплазменных лимфоцитов; их количество составляет 10 – 15 % и более. Осложнения (синуситы, пневмония, менингит, нефрит) бывают редко, прогноз благоприятный. Весьма своеобразен иммунитет. В-лимфоциты продуцируют вирусные частицы, но малигнизации обычно не наступает. Это связано с появлением специфических Т-киллеров, мишенью которых является вирусный антиген МА на поверхности В-лимфоцита. Активируются естественные киллеры, К-клеточный механизм. Увеличивается активность супрессоров, тормозящих пролиферацию и дифференциацию В-лимфоцитов и тем самым препятствующих размножению пораженных клеток. При выздоровлении появляются Т-клетки памяти, которые уничтожают зараженные вирусом В-лимфоциты после их рестимуляции. Эти клетки циркулируют в крови переболевших пожизненно. Синтезируются также вируснейтрализующие антитела. При лимфоме Беркитта и карциноме носоглотки пораженные клетки содержат множественные копии интегрированного генома вируса ЭБ, в ядрах клеток появляется антиген EBNA. В крови переболевших появляются антитела к капсидному антигену сначала класса IgM, затем класса IgG. Позднее появляются антитела к ранним антигенам MA и EBNA. Антитела сохраняются пожизненно. Для выявления вирусной ДНК в пораженных трансформированных клетках применяется метод ДНК-зонда.

Вирус саркомы Капоши

Саркома Капоши – мультифокальное заболевание с преимущественным поражением кожных покровов, а также внутренних органов и лимфатических узлов. Возбудитель открыт недавно, получил название KSHV (герпесвирус, ассоциированный с саркомой Капоши), или HHV-8. Различают 3 геноварианта: F, B, C. Вирус широко распространен в разных странах мира. Антитела к нему обнаружены у 90 % ВИЧ-инфицированных.

Под названием «арбовирусы» (лат. Arthropoda – членистоногие и англ. borne – передающийся) в настоящее время понимают вирусы, передающиеся восприимчивым позвоночным (в том числе и человеку) через укусы кровососущих членистоногих. Участие переносчика в передаче возбудителя обусловливает такие особенности арбовирусных инфекций, как сезонность, связанную с жизненным циклом переносчика, и распространение в регионах его обитания. Эти вирусы не обязательно вызывают летальные инфекции у членистоногих, у них инфекция может протекать бессимптомно, не вызывая каких-либо поражений или изменений. Арбовирусы обладают уникальной способностью к репликации как при температуре тела теплокровных позвоночных, так и при сравнительно низких температурах внешней среды. Передача возбудителя у членистоногих из поколения в поколение может осуществляться трансовариально.

Арбовирусы – нетаксономическое, собирательное понятие. В настоящее время насчитывается около 400 арбовирусов, относящихся в основном к семействам тогавирусов, флавивирусов, буньявирусов, аренавирусов, реовирусов, рабдовирусов. Для человека патогенны около 100 из них. Природные очаги арбовирусных инфекций встречаются во всех районах земного шара, но чаще в тропических дождевых лесных зонах из-за обилия видов теплокровных животных и членистоногих. В России встречаются лишь некоторые из арбовирусных инфекций.

Заболевания, вызываемые арбовирусами, могут проявляться в виде трех клинических синдромов:

1) лихорадки недифференцированного типа, часто называемой «денгеподобной», с наличием мелкопятнистой сыпи или без нее и с относительно легким течением;

2) энцефалита, нередко с летальным исходом;

3) геморрагической лихорадки, часто с тяжелым течением и летальным исходом.

Деление это весьма условно, так как один и тот же возбудитель может вызывать заболевание с преобладанием тех или иных симптомов и различной тяжестью течения.

Тогавирусы и флавивирусы

Тогавирусы (лат. toga – плащ) подразделяют на 3 рода:

– альфа-вирусы (арбовирусы антигенной группы А) с типовым видом – вирусом Синдбис;

– рубивирус; единственный представитель – вирус коревой краснухи: арбовирусом не является, передается воздушно-капельным путем;

– пестивирусы, включающие вирусы чумы животных, поражающие слизистые оболочки, арбовирусами также не являются.

Флавивирусы (арбовирусы антигенной группы В), типовой – вирус желтой лихорадки.

Все альфа– и большинство флавивирусов – полихозяинные и циркулируют в природе между позвоночными и членистоногими. Среди них многие служат возбудителями тяжелых заболеваний людей – желтой лихорадки, геморрагических лихорадок, клещевого и японского энцефалитов, денге и т. д. (табл. 21). Все альфа-вирусы экологически связаны с комарами; флавивирусы связаны с комарами и клещами, но часть их выделяется только от позвоночных.

Таблица 21

Наиболее тяжелые и распространенные инфекции человека, вызываемые альфа-вирусами и флавивирусами

Буньявирусы

Семейство Bunyaviridae (от названия местности Буньямвера в Африке) является крупнейшим по числу входящих в него вирусов (свыше 250). Это типичная экологическая группа арбовирусов. Подразделяется на пять родов: 1) Bunyavirus (свыше 140 вирусов, объединенных в 16 антигенных групп, и несколько несгруппированных) – передаются в основном комарами, реже мокрецами и клещами; 2) Phlebovirus (около 60 представителей) – передаются в основном москитами; 3) Nairobivirus (около 35 вирусов) – передаются иксодовыми клещами; 4) Uukuvirus (22 антигенно родственных вируса) – также передаются иксодовыми клещами; 5) Hantavirus (более 25 серовариантов). Кроме того, насчитывается несколько десятков буньявирусов, не отнесенных к какому-либо из родов.

Вирусы содержат однонитевую негативную фрагментированную (3 фрагмента) РНК с молекулярной массой 6,8 МД. Нуклеокапсид спиральной симметрии. Зрелые вирионы имеют сферическую форму (см. рис. 78, 11, с. 301) и диаметр 90 – 100 нм. Оболочка состоит из мембраны толщиной 5 нм, покрытой поверхностными выступами длиной

8 – 10 нм. Поверхностные выступы состоят из двух гликопептидов, которые, объединяясь, образуют цилиндрические морфологические единицы диаметром 10 – 12 нм с центральной полостью диаметром 5 нм. Они располагаются таким образом, что образуют поверхностную решетку. Мембрана, на которой фиксированы поверхностные субъединицы, состоит из бислоя липидов. Тяжеподобный нуклеопротеид располагается непосредственно под мембраной. Буньявирусы имеют три основных белка: один белок, связанный с нуклеокапсидом (N), и два гликопротеина (G1 и G2), связанных с оболочкой. Размножаются в цитоплазме клетки, аналогично флавивирусам; созревание происходит путем почкования во внутриклеточные пузырьки, далее вирусы транспортируются на клеточную поверхность. Обладают гемагглютинирующими свойствами.

Буньявирусы чувствительны к действию повышенной температуры, жирорастворителей и колебаниям температуры. Очень хорошо сохраняются при низких температурах.

Буньявирусы культивируют в куриных эмбрионах и в культурах клеток. Они образуют бляшки в клеточных монослоях под агаром. Могут быть выделены при заражении 1 – 2-дневных белых мышей-сосунков.

Из заболеваний, вызываемых буньявирусами, чаще встречаются москитная лихорадка (лихорадка паппатачи), калифорнийский энцефалит, крымская (Конго) геморрагическая лихорадка (КГЛ – Конго).

Патогенез и клиника. Патогенез многих буньявирусных инфекций человека изучен сравнительно мало, а клиническая картина не имеет характерных симптомов. Даже при заболеваниях, протекающих с симптомами поражения ЦНС и геморрагическим синдромом, клиника варьирует от крайне редких тяжелейших случаев с летальным исходом до скрытых форм, которые преобладают.

Переносчиком москитной лихорадки является москит Phlebotomus papatasi. Инкубационный период 3 – 6 дней, начало заболевания острое (лихорадка, головная боль, тошнота, конъюнктивит, светобоязнь, боли в животе, лейкопения). За 24 ч до и через 24 ч после начала болезни вирус циркулирует в крови. Все больные выздоравливают. Специфического лечения нет. Профилактика неспецифическая (москитные сетки, применение репеллентов и инсектицидов).

Калифорнийский энцефалит (переносчик – комар рода Aedes) начинается внезапно сильной головной болью в лобной области, повышением температуры до 38 – 40 °C, иногда рвотой, заторможенным состоянием и судорогами. Реже наблюдаются признаки асептического менингита. Летальные случаи и остаточные неврологические явления редки.

Крымская (Конго) геморрагическая лихорадка встречается на юге нашей страны и во многих других странах. Заражение наступает при укусах клещей родов Hyalomma, Rhipicephalus, Dermacentor, а также контактным путем. Вирус выделен М. П. Чумаковым в 1944 г. в Крыму. Инкубационный период 3 – 5 дней. Начало острое (озноб, лихорадка). В основе заболевания лежит повышение проницаемости сосудистой стенки. Нарастающая вирусемия обусловливает развитие кровоизлияний, тяжелого токсикоза, вплоть до инфекционно-токсического шока с диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови. Летальность – 8 – 12 %.

Иммунитет. В результате перенесенной буньявирусной инфекции формируется длительный иммунитет за счет накопления вируснейтрализующих антител.

Лабораторная диагностика. Буньявирусы могут быть выделены из патологического материала (кровь, секционный материал) при внутримозговом заражении мышей-сосунков, у которых наступают параличи и смерть. Типируют вирусы в реакции нейтрализации, РСК, РПГА и РТГА. При серологическом методе исследуют парные сыворотки в РН, РСК или РТГА (следует учитывать, что у вируса крымской геморрагической лихорадки гемагглютинин отсутствует).

Аренавирусы

Семейство Arenaviridae (лат. arena – песок) состоит из одного рода, включающего свыше десятка антигенно родственных представителей. Четыре из них вызывают тяжелейшие заболевания, протекающие обычно с геморрагическим синдромом: лимфоцитарный хориоменингит (ЛХМ), лихорадки Ласса, Хунин и Мачупо.

Аренавирусы варьируют как по форме (округлые, овальные, полиморфные), так и по величине (50 – 300 нм), но преимущественно имеют округлую форму и средний диаметр 110 – 130 нм (см. рис. 78.4). Окружены плотной оболочкой, на которой расположены без видимой симметрии тесно прилегающие друг к другу поверхностные отростки, или ворсинки, часто булавовидной формы, длиной около 10 нм. Наиболее характерным морфологическим признаком семейства служит наличие внутри вирусных частиц электронно-плотных зернистых структур, напоминающих песчаные вкрапления, что нашло отражение в названии семейства. Эти включения являются рибосомами клеток-хозяев, располагаются циркулярно, особенно в крупных вирусных частицах, и иногда соединены тонкими нежными волоконцами.

Геном аренавирусов представлен одноцепочечной линейной негативной РНК, состоит из пяти фрагментов, два из которых являются вирусспецифическими (с молекулярной массой 3,2 и 1,6 МД), а остальные, вероятно, происходят из рибосом клеток-хозяев. В состав вирионов входит транскриптаза, которая синтезирует комплементарную нить РНК, функционирующую как мРНК; репродукция происходит в цитоплазме, созревание вирионов – на клеточных мембранах.

Аренавирусы, как все имеющие липидную оболочку вирусы, инактивируются жирорастворителями и детергентами. Легко теряют инфекционность при нагревании, особенно в присутствии двухвалентных катионов, в щелочной (рН выше 8,5) и кислой (рН ниже 5,5) средах. Чувствительны к УФ– и гамма-лучам. Хорошо сохраняются в замороженном и лиофилизированном состоянии. Способны к размножению в курином эмбрионе и в организме грызунов различного возраста в зависимости от вида аренавируса. Из клеточных культур наибольшей чувствительностью к аренавирусам обладает культура клеток почек зеленых мартышек (Vero); вирусы активно в ней размножаются и образуют бляшки под агаровым покрытием.

Аренавирусы не обладают гемагглютинирующими свойствами, но имеют комплементсвязывающий растворимый антиген, который может быть обнаружен в РСК, реакции иммунофлуоресценции и идентичен внутреннему антигену вириона. За счет этого антигена возможны перекрестные реакции между разными аренавирусами. С помощью непрямой иммунофлуоресценции с использованием иммунных сывороток морских свинок и хомячков и иммунных асцитических жидкостей мышей выявляются две антигенные группы аренавирусов – вирусы Старого Света (ЛХМ и лихорадки Ласса) и Нового Света (вирусы Мачупо и Хунин). Реакция нейтрализации характеризуется высокой специфичностью и позволяет идентифицировать отдельные виды вирусов.

Лимфоцитарный хориоменингит широко распространен практически повсеместно, в том числе в России. ЛХМ – зооантропоноз. Основной хозяин вируса – серые домовые мыши, иногда сирийские хомячки и полевки. Человек может заражаться от инфицированных животных аэрозольным и алиментарным путем, а также через укусы гамазовых клещей. У человека наблюдается прямое повреждающее действие вируса. Он размножается в лимфатических узлах, откуда распространяется по всей ретикулоэндотелиальной ткани (системе мононуклеарных фагоцитов), вызывая повреждение капилляров, нарушение их проницаемости и обширные кровоизлияния. Инкубационный период 6 – 7 дней; клинически ЛХМ

протекает как гриппоподобное заболевание, иногда с картиной асептического менингита или менингоэнцефалита. Сопровождается лейко– и тромбоцитопенией. Как правило, протекает благоприятно и заканчивается полным выздоровлением. Имеются данные о возможном тератогенном действии вируса ЛХМ на плод при внутриутробном инфицировании.

Лихорадка Ласса – эндемичная инфекция саванн к югу от Сахары (Нигерия, Либерия, Сьерра-Леоне). Основным резервуаром вируса является многососковая крыса Mastomys natalensis, которая выделяет большое количество вируса с мочой. Вирус передается путем контакта от человека к человеку (во время вспышек), от животных аэрогенным, алиментарным путем, возможно заражение через поврежденную кожу. Все это обусловливает возникновение внутрибольничных и семейных вспышек, заболеваний медицинского персонала. Вирус Ласса относится к числу наиболее опасных для человека, работа с ним требует строжайших мер предосторожности. Патогенез такой же, как при ЛХМ, но с преимущественным поражением внутренних органов. Инкубационный период 7 – 8, иногда до 20 дней. Начало заболевания постепенное: нарастает интоксикация, появляются геморрагический диатез, язвенный фарингит, желудочные боли, позже – отек лица и шеи, выпот в брюшную и плевральную полости и в перикард. Летальность в среднем около 43 %, во время отдельных эпидемических вспышек – до 67 %.

Боливийская геморрагическая лихорадка (Мачупо) имеет природно-очаговый характер, встречается в северо-восточных провинциях Боливии Манора и Итенес. Вирус персистирует в организме мышевидного грызуна – хомячка Calomys callosus, от которого передается человеку через воду и пищу, загрязненные мочой грызуна. Возможно также заражение воздушно-капельным путем в первые дни болезни при контакте с больным, когда вирус выделяется из верхних дыхательных путей. Инкубационный период 7 – 14 дней. Клиника заболевания складывается из признаков, присущих другим геморрагическим лихорадкам, особенностью является дрожание конечностей и языка, протеинурия; в период выздоровления наблюдаются выпадение волос и ломкость ногтей. Прогноз благоприятный, но при отдельных вспышках летальность достигает 30 %. У погибших обнаруживаются глубокие изменения в разных органах, особенно в печени (кровоизлияния, участки некроза паренхимы).

Аргентинская геморрагическая лихорадка (Хунин) – заболевание, встречающееся в центральной части Аргентины (провинции Буэнос-Айрес, Кордова и Санта-Фе), где ежегодно регистрируют до 3,5 тыс. случаев. Резервуар и источник вируса Хунин – грызуны Calomys musculinus и Calomys laucha; вирус также удается выделить от их экзопаразитов. У грызунов наблюдается персистентная инфекция, и вирус длительно и массивно выделяется с мочой. Человек заражается при вдыхании пыли или при употреблении продуктов, загрязненных грызунами. Не исключен трансмиссивный путь заражения. Инкубационный период 7 – 16 дней. Начало постепенное: нарастают признаки интоксикации, с 5-го дня – явления геморрагического диатеза. Заболевание протекает на фоне нарушения функции почек, нервной и сердечно-сосудистой систем. Исход в общем благоприятный, хотя летальность иногда может достигать 10 – 20 %.

Иммунитет. При аренавирусных инфекциях происходит накопление антител, динамика которого хорошо изучена. Антитела, определяемые методом непрямой иммунофлуоресценции, обычно появляются на 2 – 3-й нед. заболевания, когда состояние больного начинает улучшаться, причем во многих случаях находят IgA-антитела. Комплементсвязывающие и вируснейтрализующие антитела удается обнаружить значительно позже.

Лабораторная диагностика. При применении вирусологического и биологического методов для выделения вирусов в качестве материала используют смывы из носоглотки, кровь, ликвор, мочу, плевральный выпот, секционный материал. Выбор тест-объекта для заражения определяется патогенностью предполагаемого возбудителя для лабораторных животных (белые мыши, морские свинки, обезьяны различного возраста; используется заражение в мозг), а также разной чувствительностью к нему клеточных культур. Чаще используются клетки Vero, амниона человека, эмбриона мышей (цитопатический эффект с внутриклеточными включениями, образование бляшек). Идентифицируют вирусы в РСК, реакции нейтрализации или непрямой иммунофлуоресценции.

Наиболее доступными методами серологической диагностики служат реакция непрямой иммунофлуоресценции (антитела появляются в более ранние сроки и сохраняются дольше), а также РСК и РПГА.

Лечение и специфическая профилактика. Для большинства аренавирусных инфекций специфическое лечение не разработано. Единственным эффективным методом лечения лихорадки Ласса является применение гипериммунной сыворотки от переболевших или иммунизированных людей. Сыворотку от реконвалесцентов следует применять с осторожностью, так как вирус может персистировать в крови в течение нескольких месяцев после острой инфекции. Для профилактики перспективно применение живых аттенуированных вакцин, которыми в первую очередь должны иммунизироваться медицинские и лабораторные работники, а также лица, контактирующие с грызунами.

Реовирусы, род орбивирусы

Семейство Reoviridae состоит из 3 родов: реовирусы, ротавирусы (см. главу 51) и орбивирусы. Представители орбивирусов – вирусы колорадской клещевой лихорадки, вирусы группы Кемерово и др. – являются типичными арбовирусами, передаваемыми комарами Aedes, мокрецами и клещами. Эти вирусы в основном имеют ветеринарное значение, но некоторые из них могут вызывать легкие лихорадочные заболевания у человека. Орбивирусы имеют сферическую форму, диаметр вириона 60 – 80 нм (см. рис. 78.9). Геном представлен двунитевой РНК, состоящей из 10 фрагментов и имеющей молекулярную массу 12 МД. Имеется вирионная транскриптаза. Капсид двухслойный, 32 капсомера кольцевидной формы (лат. orbis – кольцо) упакованы в икосаэдр. Пушистый, трудно различимый даже при электронной микроскопии белковый слой покрывает снаружи основной капсид. Суперкапсид отсутствует. Репликативный цикл аналогичен циклу реовирусов. Орбивирусы чувствительны к низким значениям рН, инактивируются при рН менее 3,0.

Колорадская клещевая лихорадка. Заболевание регистрируется на Тихоокеанском побережье США, в основном в горной сельской местности. Вирус передается через укусы инфицированного клеща Dermacentor andersoni и циркулирует в крови в острой стадии заболевания. Инкубационный период 4 – 6 дней. Начало острое – озноб, миалгия, головная боль, тошнота, рвота. Лихорадка имеет двухволновый характер, наблюдается лейкопения. Исход благоприятный. Иммунитет после заболевания гуморальный, длительный.

Лабораторная диагностика: в течение первых 14 дней заболевания вирус выделяют из крови путем внутримозгового или внутрибрюшинного заражения молодых хомячков или новорожденных мышей. Комплементсвязывающие и вируснейтрализующие антитела появляются на 2-й нед. болезни и сохраняются до 3 лет.

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) – острое тяжелое инфекционное заболевание, характеризующееся системным поражением мелких сосудов, геморрагическим диатезом, гемодинамическими расстройствами и своеобразным поражением почек (интерстициальный нефрит с развитием острой почечной недостаточности).

Возбудитель ГЛПС относится к роду Hantavirus семейства Bunyaviridae. Хантавирусы имеют сферическую форму, липидсодержащую оболочку; диаметр вириона 90 – 120 нм. Оболочка имеет выступы, образованные гликопротеидами. Геном вируса – сегментированная одноцепочечная негативная РНК. Три сегмента: большой (L), средний (M) и малый (S) кодируют вирусную РНК-полимеразу, оболочечные гликопротеиды (G1 и G2) и нуклеокапсид соответственно. Инициация транскрипции у хантавирусов происходит так же, как и у вируса гриппа А: с помощью вирионной эндонуклеазы, входящей в комплекс РНК-полимеразы, отрезается кэп (шапочка) от клеточной мРНК. Кэп служит в качестве праймера – затравки для синтеза вирионной мРНК. Жизненный цикл хантавирусов также сходен с таковым вируса гриппа. Как все РНК-содержащие вирусы, хантавирусы подвержены частым мутациям. К настоящему времени род Hantavirus включает уже более 25 серологически и генетически отличающихся друг от друга вирусов. Их делят на вирусы Старого Света (Хантаан, Сеул, Пумала, Добрава/Белград, Хабаровск, Таиланд, Тоттопалаяма и др.) и вирусы Нового Света (Проспект Хилл, Син Номбре, Нью-Йорк, Андес, Байон, Лагуна Негра и др.). Они вызывают две клинические формы хантавирусной инфекции у людей: ГЛПС (возбудители – Хантаан, Сеул и др.) и хантавирусный кардиопульмональный синдром (ХКПС), возбудителями которого являются вирусы Син Номбре, Нью-Йорк, Байон, Андес, Лагуна Негра и, возможно, другие.

Хантавирусы распространены повсеместно.

В г. Сочи выделен новый подвид вируса Добрава – До/Сочи, его носитель – кавказская лесная мышь Apodemus ponticus.

Эпидемиология. Заражение хантавирусами происходит от грызунов воздушнопылевым, контактным или алиментарным, но не трансмиссивным путем. Вирусы, передающиеся таким путем, названы робовирусами (англ. rodent – грызун и borne – рожденный). Высокая заболеваемость ГЛПС (в 1997 г. в России зарегистрирован 20 921 случай заболевания) обусловлена наличием на территории страны активно действующих природных очагов, особенно в Поволжье, Уральском и Волго-Вятском районах, а также в Приморском крае. Установлена естественная инфицированность хантавирусами более чем 50 видов мелких млекопитающих, принадлежащих к различным семействам из отрядов грызунов и насекомоядных. Широкое признание получила гипотеза, согласно которой каждый хантавирус в природных условиях связан с единственным видом мелких млекопитающих. Однако вопрос о реальном количестве существующих в природе хантавирусов и видов их основных носителей требует дальнейшего изучения.

У животных при заражении хантавирусами развивается бессимптомная инфекция, во время которой вирусные антигены могут быть обнаружены во многих органах, преимущественно в легких. Вирус длительное время выделяется у животных со слюной, фекалиями и мочой. Заражение человека происходит через воздух. Вирус вместе с аэрозолем, содержащим продукты жизнедеятельности грызунов, через верхние дыхательные пути попадает в легкие, где условия для его размножения наиболее благоприятны, затем с кровью переносится в другие органы и ткани. Заражения здоровых людей от больного не происходит.

Патогенез. Проникнув в организм, вирус циркулирует в крови, поражая стенки капилляров и мелких вен, особенно в сосудах мозгового слоя почек. Вирус размножается в клетках почек, селезенки, легких и в эндотелии сосудов. Он содержится в крови и моче больных в течение всего лихорадочного периода. Иммунные комплексы вирусный антиген + антитело откладываются в клетках клубочков и извитых канальцев почек, что и вызывает почечный синдром.

Клиника. Инкубационный период 11 – 23 дня. Болезнь начинается с озноба, повышения температуры до 39 – 40 °C. Отмечаются сильная головная боль, гиперемия лица и шеи, инъекция сосудов склеры, с 3 – 5-го дня болезни появляется геморрагическая сыпь на коже и возникает олигоурия, в тяжелых случаях – анурия и уремия. Выздоровление медленное. Функции почек восстанавливаются через 1 – 3 мес. полностью. Перехода ГЛПС в хроническую форму не бывает. Наряду с тяжелой формой ГЛПС (геморрагический нефрозонефрит) наблюдаются стертые, легкие и среднетяжелые формы болезни. Летальность варьирует от 0 до 44 %.

Иммунитет после перенесенного заболевания стойкий, длительный, обусловлен вируснейтрализующими антителами и клетками иммунной памяти.

Лабораторная диагностика. Хантавирусы плохо размножаются в культуре клеток, и для них нет лабораторной модели инфекции, поэтому их трудно выделить и идентифицировать. Практически единственным методом прямого обнаружения хантавирусов является ПЦР. Все остальные методы могут лишь косвенно указывать на присутствие вируса в исследуемом материале. ПЦР позволяет непосредственно обнаружить вирус в различных биологических образцах, взятых как от животных, так и от человека.

Лечение. Применение интерферона и его индукторов. При острой почечной недостаточности, уремии и геморрагическом нефрозонефрите необходим гемодиализ. В России создана убитая вакцина против ГЛПС на основе штамма К-27 вируса Пумала.

Рабдовирусы – возбудители бешенства и везикулярного стоматита

Бешенство – острое инфекционное заболевание, вызываемое рабдовирусом, – возникает при укусе человека больным животным или при попадании на поврежденную кожу или слизистую оболочку слюны больного животного. Эта инфекция центральной нервной системы почти всегда заканчивается летально.

Первые упоминания о заболевании, передающемся через укус собаки и весьма напоминающем по описанию бешенство, встречаются в клинописных глиняных табличках Древней Месопотамии, относящихся к III тысячелетию до н. э. Вирус был выделен и аттенуирован путем пассажей на мозге кролика в 1882 г.

Л. Пастером.

Везикулярный стоматит – заболевание лошадей, крупного рогатого скота и свиней, иногда людей, протекающее у них доброкачественно, – также вызывается рабдовирусом. Для человека этот вирус слабо патогенен. Он изучен лучше всех рабдовирусов.

Рабдовирусы – семейство, в котором насчитывается 3 рода: Vesiculovirus (10 вирусов млекопитающих, типовой – вирус везикулярного стоматита, или ВВС); Lyssavirus (6 серологически родственных вирусов, типовой – вирус бешенства);

Sigmavirus (единственный представитель – вирус сигма-дрозофил). Неклассифицированными остаются 6 вирусов, вызывающих заболевания рыб, и 13 вирусов, поражающих растения. Для рабдовирусов характерна палочковидная или пулевидная форма вириона (см. рис. 78.8): длина 60 – 400 нм, ширина 60 – 85 нм. Частицы окружены двухслойной липидной мембраноподобной оболочкой с выступающими шипами длиной 10 нм и шириной 3 нм. Под оболочкой находится рибонуклеокапсид, имеющий спиральный тип симметрии, в котором при электронной микроскопии видны полосы. Геном рабдовирусов представлен негативной однонитевой линейной нефрагментированной молекулой РНК с молекулярной массой 3,8 МД; обнаружены пять генов, кодирующих синтез структурных белков, и определен порядок их расположения. На 3'-конце располагается ген нуклеокапсидного белка N (50 кД). За ним следует ген белка NSV (30 кД) – одного из компонентов вирусной транскриптазы, входящего в состав нуклеокапсида. Следующий ген кодирует матриксный белок М (30 кД) и выстилающий двуслойную липидную мембрану с внутренней стороны. Далее идет ген белка G (65 кД) – внешнего гликопротеида вирусного суперкапсида. На 5'-конце находится ген высокомолекулярного компонента вирусной транскриптазы – белка L (160 кД).

Взаимодействие рабдовирусов с клетками и их репродукция идут по следующей схеме: адсорбция вируса на клетке (гликопротеид G) – проникновение в клетку путем эндоцитоза – слияние с мембраной лизосомы – депротеинизация вируса. Под действием вирионной транскриптазы (РНК-полимеразы) образуется кРНК, служащая матрицей для синтеза вРНК и выполняющая функцию мРНК. Далее синтезируются вирусспецифические белки на рибосомах клетки-хозяина. Белки М и G встраиваются в плазматическую мембрану. Образующийся при взаимодействии вРНК с белками N, L и NS нуклеокапсид, проходя через мембрану, обволакивается суперкапсидом. Созревший вирион отделяется от клетки путем почкования.

Вирус бешенства по строению и особенностям внутриклеточной репродукции очень сходен с вирусом везикулярного стоматита. Важной особенностью этих вирусов является выраженное угнетение процессов биосинтеза белка в клетке-хозяине за счет блокирования инициации трансляции.

Существует несколько серовариантов вирусов везикулярного стоматита, которые различаются по белку G, являющемуся также протективным антигеном.

Вирусы хорошо размножаются в куриных эмбрионах, клетках почек новорожденных хомячков и в культурах диплоидных клеток человека. В культурах клеток вирус везикулярного стоматита обычно вызывает цитопатический эффект и гибель клеток, иногда – симпластообразование.

Вирус бешенства имеет широкий круг хозяев. Чувствительны к нему все теплокровные животные. Степень патогенности разных штаммов вирусов бешенства для различных животных не одинакова. У некоторых видов летучих мышей вирус адаптировался только к слюнным железам, не вызывая признаков заболевания; заражение других животных всегда ведет к гибели.

Штаммы вирусов бешенства, циркулирующие в природе у животных, называются уличными. Они вызывают заболевания с довольно длительным инкубационным периодом и обычно образуют специфические тельца-включения в цитоплазме клеток. У зараженных животных может наблюдаться длительный период возбуждения и агрессивности. Вирус может проникать в слюнные железы и ЦНС. Последовательные пассажи в мозге кроликов приводят к образованию фиксированного вируса, не способного в дальнейшем размножаться в каких-либо клетках, кроме нервных. Фиксированный вирус размножается быстро, инкубационный период короткий, включения в клетках обнаруживаются редко. Этот вирус патогенен только для кроликов.

Вирус бешенства мало устойчив во внешней среде, быстро инактивируется при действии на него ультрафиолетовых лучей или солнечного света. При кипячении он погибает через 2 мин, при 60 °C – через 5 мин. Быстро инактивируется растворами лизола, хлорамина, фенола, жирорастворителями и трипсином. В трупах животных, особенно при низких температурах, сохраняется до 4 мес.

Эпидемиология. Бешенство – типичный зооантропоноз. Основным источником и резервуаром вируса являются дикие и домашние плотоядные животные: собаки, кошки, волки, шакалы, лисицы, скунсы, мангусты, летучие мыши. Заболевание обычно передается через укус или при ослюнении поврежденной кожи или слизистой оболочки, так как вирус размножается в слюнных железах животного. Больное животное заразно не только во время болезни, но и в инкубационном периоде за 2 – 3 дня, иногда больше, до появления первых признаков заболевания.

Патогенез и клиника. Первичное размножение вируса бешенства происходит в мышечной ткани вблизи входных ворот, затем возбудитель внедряется в рецепторы периферических чувствительных нервов и по эндоневрию шванновских клеток или по периневральным пространствам попадает в ЦНС. Там вирус размножается в нейронах гиппокампа, продолговатого мозга, черепных нервов, симпатических ганглиев, вызывая воспалительные, дистрофические и некротические изменения нервной системы. В этот период вирус также размножается в клетках слюнных желез. Наиболее короткий инкубационный период бывает при укусе головы и кистей рук, более длительный – при укусе нижних конечностей; в целом варьирует от 8 до 90 дней. В развитии заболевания выделяют три стадии: предвестников (депрессии), возбуждения, параличей. Сначала появляются беспокойство, страх, тревога, неприятные ощущения в области укуса. Через 1 – 3 дня наступают выраженное возбуждение, судороги дыхательной и глотательной мускулатуры, появляется выраженная водобоязнь (гидрофобия – второе название этой болезни). В этот период характерны агрессивность, слуховые и зрительные галлюцинации. Далее развиваются параличи, и через 5 – 7 дней от начала болезни наступает смерть от паралича сердечного или дыхательного центров.

Иммунитет. Поскольку заболевание бешенством заканчивается смертью, постинфекционный иммунитет не изучен. Установлено, что антитела могут образовываться во время заболевания и после вакцинации. Поствакцинальный иммунитет сохраняется до 1 года.

Лабораторная диагностика проводится с использованием вирусоскопического, биологического и серологического методов. У погибших животных и людей в гистологических срезах или мазках-отпечатках исследуют мозговую ткань (кору больших полушарий и мозжечка, аммонов рог, продолговатый мозг), а также ткань слюнных желез. В пирамидальных клетках мозговой ткани обнаруживают специфические эозинофильные включения (тельца Бабеша – Негри), располагающиеся в цитоплазме около ядра и являющиеся скоплениями вирусных нуклеокапсидов. Их появление обусловлено затрудненным созреванием вирионов в нервных клетках. Тельца Бабеша – Негри выявляют специальными методами окраски (по Романовскому – Гимзе, Манну, Туревичу, Муромцеву и др.). Они имеют характерную зернистую структуру с базофильными гранулами на ацидофильном фоне, размер их – 4 – 10 мкм (см. цв. вкл., рис. 89). Недостатком метода является то, что воспользоваться им можно только после смерти человека или животного.

Вирусный антиген может быть обнаружен в тех же препаратах с помощью прямой или непрямой реакции иммунофлуоресценции.

Выделить вирус бешенства удается из слюны больных людей или животных, а также из свежего секционного материала (мозговая ткань, ткань подчелюстных слюнных желез) путем внутримозгового заражения белых мышей и кроликов или хомячков – внутримышечно. У животных развиваются параличи с последующей гибелью. Мозг погибшего животного должен быть исследован для обнаружения телец Бабеша – Негри или вирусного антигена с помощью реакции иммунофлуоресценции.

Антитела могут быть выявлены у вакцинированных лиц с помощью реакций нейтрализации, связывания комплемента, иммунофлуоресценции, а также иммуносорбентных реакций (РИМ и ИФМ).

Специфическая профилактика и лечение. Профилактика заключается в борьбе с бешенством среди животных и предупреждении развития болезни у людей, подвергшихся укусам или ослюнению больным животным. Программу ликвидации бешенства наземных животных необходимо рассматривать в двух аспектах: 1) искоренение городского собачьего бешенства и 2) оздоровление природных очагов рабической инфекции. Опыт многих стран убедительно доказывает возможность контроля за эпизоотиями городского типа путем регистрации и иммунизации собак. Однако для полной ликвидации рабической инфекции необходимо оздоровление ее природных очагов, причем истребление диких плотоядных животных дает лишь временный и локальный результат и грозит развитием нежелательных экологических последствий. За рубежом уже имеется большой положительный опыт профилактики бешенства среди диких животных (лис, енотов) путем скармливания им приманок, содержащих вакцину. Весьма перспективными в этом плане считаются оральные антирабические вакцины: живая модифицированная цельновирионная вакцина из аттенуированных вакцинных штаммов (САД-Берн, Внуково-32) и рекомбинантная генно-инженерная оральная вакцина с использованием в качестве вектора вируса осповакцины, экспрессирующего ген G-протеина вируса бешенства.

При укусах или ослюнении необходимо тщательно промыть рану или кожу в месте попадания слюны мыльной водой, рану прижечь спиртовым раствором йода и начать проведение специфической профилактики антирабической вакциной и антирабическим гамма-глобулином. Вместо использовавшейся ранее весьма реактогенной вакцины Ферми (из мозговой ткани овец, зараженных фиксированным вирусом) сейчас для профилактики бешенства рекомендована антирабическая инактивированная культуральная вакцина, которая изготовлена на культуре клеток, инфицированных аттенуированным вирусом бешенства (штамм Внуково-32). Экстренная лечебно-профилактическая вакцинация проводится вакциной или вакциной в сочетании с антирабическим гамма-глобулином по схемам, указанным в наставлениях к их применению. Схема вакцинации определяется степенью тяжести укуса, его локализацией, временем, прошедшим после укуса, информацией об укусившем животном и другими обстоятельствами.

Филовирусы: вирусы Марбург и Эбола

Эти возбудители заболеваний, протекающих по типу геморрагических лихорадок, описаны сравнительно недавно и мало изучены. Они отнесены в отдельное семейство Filoviridae с единственным родом Filovirus. Вирусы имеют нитевидную или цилиндрическую форму и иногда внешне напоминают рабдовирусы. Геном их также представлен РНК. Хотя внешний вид и цитоплазматические включения в зараженных клетках слегка и напоминают таковые при бешенстве, по строению вирусы Марбург и Эбола отличаются от рабдовирусов, к которым их относили ранее, и не имеют антигенного родства ни с ними, ни с каким-либо другим из известных вирусов.

По морфологическим особенностям и размерам вирусы Марбург и Эбола во многом сходны. Это прямые (вирус Эбола) или извитые различным образом нити (вирус Марбург – спиральные, в виде цифры 6, V-образные); концы их закруглены. Иногда встречаются формы с нитевидными ответвлениями. Наружный диаметр вирионов – 70 – 100 нм, средняя длина – 665 нм, но в электронно-микроскопических препаратах встречаются частицы длиной до 1400 нм (вирус Эбола).

Геном вируса Эбола представлен одной молекулой одноцепочечной негативной РНК с молекулярной массой 4,0 – 4,2 МД. В центре вириона располагается тяж диаметром 20 нм, который составляет основу цилиндрического спирального рибонуклеопротеида вируса диаметром 30 нм. Между рибонуклеопротеидом и оболочкой вириона располагается промежуточный слой толщиной 3,3 нм. Вирион имеет наружную липопротеиновую мембрану толщиной 20 – 30 нм, на поверхности которой на расстоянии 10 нм друг от друга располагаются шипы длиной 7 – 10 нм. В составе вириона, так же как и у вируса Марбург, 7 структурных белков.

В материале от больного вирусы Марбург и Эбола достаточно устойчивы к нагреванию. В крови и плазме они инактивируются при температуре 60 °C в течение 30 мин, в 10 %-ной суспензии печени больных обезьян – при 56 °C в течение 1 ч, под действием УФ-лучей – в течение 1 – 2 мин. В суспензии печени под действием ацетона, метанола или формалина инактивируются в течение 1 ч. Чувствительны к действию жирорастворителей – этанола, хлороформа и дезоксихолата натрия. Хорошо сохраняются при – 70 °C, в лиофилизированном виде (более 1 года – срок наблюдения).

Вирусы Марбург и Эбола различаются по антигенным свойствам. Сыворотка реконвалесцентов и иммунные сыворотки морских свинок по-разному реагируют с этими вирусами. Углубленные исследования антигенных взаимоотношений между вирусами Марбург и Эбола подтвердили их различия. Антигены их могут быть выявлены при помощи реакций иммунофлуоресценции, связывания комплемента и нейтрализации на морских свинках. У вируса Эбола известны 2 сероварианта – суданский и заирский. Вирусы хорошо размножаются в культурах клеток обезьян, патогенны для морских свинок и в эксперименте вызывают у различных видов обезьян заболевание, патогенез и клиника которого напоминают заболевание у человека.

Марбургская лихорадка. Марбургский вирус впервые обнаружен в 1967 г. во время вспышки геморрагической лихорадки в Югославии и Германии среди людей, контактировавших с мартышками из Уганды (31 случай). Вирус передается и при прямом контакте от больных к здоровым людям. Болезнь эндемична для стран Восточной и Южной Африки (ЮАР, Кения, Зимбабве). Возможны также случаи заболевания в других странах при въезде лиц, находящихся в инкубационном периоде, который составляет 3 – 9 дней. Начало болезни острое: быстро наступает прострация, выраженная лихорадка (иногда двухволнового типа). В первые дни вирус обнаруживается в крови, моче и отделяемом носоглотки. Позже появляется сыпь, на мягком нёбе – везикулы, переходящие в язвочки. Повреждается печень, развиваются почечная недостаточность, иногда психические и нервные нарушения. Продолжительность заболевания – до 2 нед., выздоровления – до 3 – 4 нед.; в этот период отмечается сонливость, адинамия, выпадение волос. Летальность – 30 – 50 %. У переболевших мужчин вирус сохраняется в сперме до 3 мес.

Лихорадка Эбола. Вирус Эбола (по названию реки в Заире) был впервые выделен в 1976 г. в Судане и Заире при вспышке тяжелейшей геморрагической лихорадки. Заболело свыше 500 человек, 350 из них умерли. В последующие годы спорадические случаи заболевания регистрировались в этом же регионе. Антитела к вирусу обнаружены у жителей стран Центральной Африки. Природные очаги вируса не выявлены. Предполагается, что заболевание является зооантропонозом (резервуар вируса – дикие грызуны или летучие мыши). Предположение основано на периодическом появлении заболевания в результате заражения в джунглях, но заболеваемость прекращается до того, как достигнет эпидемического уровня. Заболевают в основном взрослые, они становятся источником заражения окружающих в семье и больнице. Болезнь передается при тесном контакте с больными, особенно с кровью или выделениями, содержащими кровь, а также с мокротой и спермой. Поэтому не исключен воздушно-капельный (особенно среди медицинских работников) или половой путь заражения. Инкубационный период 3 – 16 дней. Начало болезни острое: сильнейшая головная боль, лихорадка, миалгия, тошнота, боли в груди. Затем появляются сыпь, профузный понос с кровью, приводящий к обезвоживанию; развиваются кровотечения. Выздоровление медленное. Летальность – до 90 %.

Ранняя диагностика лихорадок Марбург и Эбола заключается в обнаружении вируса или его антигенов в крови, моче, геморрагическом экссудате при заражении культуры клеток обезьян или с помощью реакций нейтрализации, связывания комплемента, ИФМ, РИФ и др. В более поздних стадиях заболевания и в период реконвалесценции диагностическим признаком служит обнаружение комплементсвязывающих (со 2 – 3-й недели) или вируснейтрализующих антител.

Лечение симптоматическое: поддержание водно-солевого баланса, функции почек и печени, борьба с геморрагическим синдромом. Очень хороший эффект оказывает переливание плазмы реконвалесцентов, особенно в сочетании с введением интерферона.

Профилактика. Выявленных больных изолируют. Следует применять исключительные меры предосторожности для предупреждения контактов медицинского персонала с кровью, слюной, мокротой, мочой больных (работа с индивидуальными средствами защиты). Если однажды вирусы Марбург и Эбола были переданы людям при контакте с неизвестным резервуаром, не исключена возможность, что они смогут адаптироваться к прямой передаче от человека к человеку, в результате чего эти тяжелые инфекции смогут внедриться из природных очагов в регионы, где естественных хозяев не существует. Разработаны рекомендации ВОЗ по предупреждению завоза инфекции с обезьянами и другими животными в неэндемичные страны.

Специфическая профилактика. В США и в России созданы вакцины для профилактики лихорадки Эбола.

Семейство Poxviridae (англ. pox – оспа + вирусы) включает два подсемейства: Chordopoxvirinae, куда входят вирусы оспы позвоночных, и Entomopoxvirinae, объединяющее вирусы оспы насекомых. Подсемейство вирусов оспы позвоночных, в свою очередь, включает 6 самостоятельных родов и несколько неклассифицированных вирусов. Представители каждого рода имеют общие антигены и способны к генетической рекомбинации. Роды отличаются друг от друга по процентному содержанию и свойствам ДНК, расположению и форме нитеобразных структур на внешней оболочке вириона, устойчивости к эфиру, гемагглютинирующим свойствам и другим признакам.

Представители рода Orthopoxvirus – вирусы натуральной оспы, оспы обезьян и осповакцины. Вирус натуральной оспы вызывает особо опасную инфекцию человека, которая усилиями мирового сообщества ликвидирована в середине 70-х гг. ХХ в. Вирус оспы обезьян патогенен не только для приматов: описаны случаи заболевания у людей, по течению напоминающие натуральную оспу. Учитывая это обстоятельство, полезно иметь общие представления о микробиологии натуральной оспы.

Наиболее изученным представителем рода Orthopoxvirus является вирус осповакцины, который произошел либо от вируса коровьей оспы, либо от вируса натуральной оспы. Он адаптирован к организму человека и долгое время использовался как первая живая вирусная вакцина.

Вирус натуральной оспы и другие представители этого рода – самые крупные из всех известных вирусов животных. Это один из самых высокоорганизованных вирусов животных, приближающийся по строению некоторых структур к бактериям. Вирион имеет форму кирпича с несколько закругленными углами и размер 250 – 450 нм. Он состоит из хорошо различимой сердцевины (нуклеоида, или ядра), содержащей геномную двунитевую линейную молекулу ДНК с молекулярной массой 130 – 200 МД, ассоциированную с белками. По обе стороны от нуклеоида расположены овальные структуры, называемые белковыми телами. Сердцевина и боковые тела окружены четко различимой поверхностной оболочкой с характерной бороздчатой структурой. Стенка сердцевины состоит из внутренней гладкой мембраны толщиной 5 нм и наружного слоя из регулярно расположенных цилиндрических субъединиц. Вирус имеет химический состав, напоминающий бактериальный: он содержит не только белок и ДНК, но и нейтральные жиры, фосфолипиды, углеводы.

Поксвирусы – единственные из ДНК-содержащих вирусов, размножающиеся в цитоплазме клетки-хозяина. Цикл репродукции вируса складывается из следующих основных этапов. После адсорбции на поверхности чувствительной клетки вирус проникает в цитоплазму путем рецепторопосредованного эндоцитоза, и далее происходит двухэтапное «раздевание» вириона: сначала под действием протеаз клетки разрушается наружная оболочка, происходит частичная транскрипция и синтез сверхранних мРНК, кодирующих синтез белка, ответственного за дальнейшее раздевание. Параллельно с этим идет репликация вДНК. Дочерние копии ДНК транскрибируются, синтезируются поздние мРНК. Затем идет трансляция, и синтезируется около 80 вирусспецифических белков с молекулярной массой от 8 до 240 кД. Часть из них (около 30) является структурными белками, остальные – ферменты и растворимые антигены. Особенностью размножения поксвирусов можно считать модификацию ими клеточных структур, которые превращаются в специализированные «фабрики», где происходит постепенное созревание новых вирусных частиц. Созревшее вирусное потомство покидает клетку либо при ее лизисе, либо путем отпочковывания. Цикл репродукции вирусов оспы занимает около 6 – 7 ч.

Вирус оспы обладает гемагглютинирующими свойствами; гемагглютинин состоит из трех гликопротеидов. Важнейшими антигенами являются: NP-нуклеопротеидный, общий для всего семейства; термолабильный (Л) и термостабильный (С), а также растворимые антигены.

Поксвирусы выдерживают высушивание (особенно в патологическом материале) в течение многих месяцев при комнатной температуре, устойчивы к эфиру, в 50 % растворе этанола при комнатной температуре инактивируются в течение 1 ч, а в 50 % растворе глицерина при температуре 4 °C сохраняются в течение нескольких лет. Устойчивы к большинству дезинфицирующих веществ: 1 %-ный фенол или 0,2 %-ный формальдегид при комнатной температуре инактивируют их только в течение 24 ч, 5 %-ный хлорамин – в течение 2 ч.

К вирусу натуральной оспы восприимчивы человек, а также обезьяны. При экспериментальном заражении в мозг новорожденных мышей развивается генерализованная инфекция, заканчивающаяся летально; для взрослых мышей вирус непатогенен. Он хорошо размножается в куриных эмбрионах при заражении на хорион-ал-

лантоисную оболочку, в амнион, в желточный мешок и аллантоисную полость. На хорион-аллантоисной оболочке 10 – 12-дневных куриных эмбрионов вирус натуральной оспы дает мелкие белые бляшки; вирус осповакцины вызывает поражения больших размеров, с черной впадиной в центре, вызванной некрозом. Важным дифференциальным признаком вируса натуральной оспы является предельная температура размножения вируса в курином эмбрионе 38,5 °C.

К вирусу натуральной оспы чувствительны первичные и перевиваемые культуры клеток, полученные от человека, обезьян и других животных. На культуре клеток опухолевого происхождения (HeLa, Vero) вирус натуральной оспы образует мелкие бляшки пролиферативного типа, в то время как при заражении вирусом оспы обезьян клеток Vero выявляются круглые, с литическим центром бляшки. В клетках почки эмбриона свиньи вирус натуральной оспы способен вызывать четкий цитопатический эффект, которого не бывает при заражении этих клеток вирусом оспы обезьян. В клетках HeLa вирус натуральной оспы вызывает круглоклеточную дегенерацию, тогда как вирусы оспы обезьян и верблюдов вызывают дегенерацию с образованием многоядерных клеток.

Натуральная оспа

Эпидемиология. Источник инфекции – больной человек. Подавляющее большинство не привитых против оспы или непереболевших людей чувствительны к этой инфекции. Заболевание чаще всего передается воздушно-капельным путем, но не исключено заражение и контактным путем (через одежду, полотенце, постель, предметы обихода). Больной заразен для окружающих в течение всего периода развития сыпи, вплоть до отпадения последних корочек, но наиболее опасен в первые 8 – 10 дней, когда имеются поражения на слизистых оболочках.

Патогенез и клиника. Входные ворота инфекции – слизистая оболочка верхних дыхательных путей. Первичное размножение вируса происходит в лимфоидной ткани глоточного кольца, затем на короткое время вирус проникает в кровь и инфицирует клетки ретикулоэндотелиальной ткани (СМФ). Вирус там размножается, и опять возникает вирусемия, но более интенсивная и продолжительная. Дерматотропное действие вируса связано с его способностью проникать из кровяного русла в эпидермис, вызывать раннюю пролиферацию шиповидных клеток и характерную дегенерацию клеток мальпигиева слоя.

Инкубационный период составляет 8 – 18 дней. Заболевание начинается остро: головные боли, боли в мышцах, прострация, лихорадка. Через 2 – 4 дня на слизистой оболочке полости рта и коже появляется характерная сыпь – все элементы почти одновременно, локализуются больше на лице и конечностях. Сыпь проходит стадии макулы, папулы, пузырька и пустулы, затем образуется корочка (струп), после отпадения которой остается рубец. С появлением сыпи температура снижается и вновь повышается на стадии пустулы. От появления сыпи до отпадения корочек проходит около 3 нед. При таком классическом тяжелом течении (variola major) летальность во время эпидемий может достигать 40 %; при более легкой форме заболевания – алястрим (variola minor) – летальность не превышает 1 – 2 %.

Иммунитет. У людей, выздоровевших после оспы, иммунитет сохраняется пожизненно. Длительный стойкий иммунитет формируется и после вакцинации. Иммунитет в основном гуморальный, вируснейтрализующие антитела появляются уже через несколько дней после начала заболевания, однако не препятствуют прогрессирующему распространению кожных проявлений: больной может умереть на пустулезной стадии, имея высокий уровень антител в крови. За создаваемый путем вакцинации искусственный иммунитет также отвечают антитела, появляющиеся на 8 – 9-й день после иммунизации и достигающие максимальных титров через 2 – 3 нед.

Клеточный иммунитет играет не меньшую роль, чем циркулирующие антитела. Установлено, что у лиц с гипогаммаглобулинемией биосинтеза антител не происходит, но они становятся невосприимчивыми к вирусу оспы. В основе такого клеточного иммунитета лежит активность Т-цитотоксических лимфоцитов.

Лабораторная диагностика. Диагностика оспы может проводиться вирусоскопическим, вирусологическим и серологическим методами. Наиболее эффективным и быстрым методом является непосредственная электронная микроскопия материала, взятого из элементов сыпи до стадии пустул, так как количество вируса на этой стадии резко уменьшается. При световой микроскопии в препаратах из содержимого пузырьков обнаруживаются крупные клетки с тельцами Гварниери (см. цв. вкл., рис. 90.1), которые представляют собой цитоплазматические включения овальной формы около ядра клетки, обычно гомогенные и ацидофильные, реже гранулированные и с неправильными очертаниями. Тельца Гварниери – это «фабрики», где происходит размножение вируса оспы. В мазках, приготовленных из содержимого оспенных пузырьков и окрашенных по методу М. Морозова, обнаруживаются вирионы оспы – тельца Пашена (см. цв. вкл., рис. 90.2).

Для выделения и идентификации вируса используют заражение 12 – 14-дневных куриных эмбрионов на хорион-аллантоисную оболочку, где вирус образует мелкие белесые бляшки, а также заражают культуры клеток для обнаружения цитопатического эффекта, постановки реакции гемадсорбции или иммунофлуоресценции. Материал для заражения – кровь, отделяемое носоглотки, соскобы кожных элементов сыпи, корочки, а также секционный материал.

Специфический антиген вируса оспы может быть обнаружен в мазках-отпечатках из элементов сыпи и отделяемого носоглотки с помощью непрямой иммунофлуоресценции. В материале из элементов сыпи антиген может быть определен с помощью иммунодиффузии, РСК или ИФМ.

Уже после первой недели заболевания удается обнаруживать вируснейтрализующие, комплементсвязывающие антитела и гемагглютинины. Наличие комплементсвязывающих антител считается наиболее достоверным признаком оспы, так как они у вакцинированных редко сохраняются дольше 12 мес.

Специфическая профилактика и лечение. С целью специфического лечения и профилактики используется метисазон (марборан) – препарат, подавляющий внутриклеточную репродукцию вируса оспы. Он особенно эффективен на ранних стадиях заболевания и в инкубационном периоде.

История человеческой цивилизации помнит много эпидемий и пандемий натуральной оспы. Только в Европе до конца XVIII в. от оспы погибло не менее 150 млн человек. После получения Э. Дженнером (1796) вакцины против оспы началась активная борьба с этой болезнью, которая закончилась полной ее ликвидацией. В Советском Союзе оспа была ликвидирована в 1936 г., но за счет завозных случаев она регистрировалась до 1960 г. В 1958 г. по инициативе делегации СССР на ассамблее ВОЗ была принята резолюция об искоренении оспы во всем мире, а в 1967 г. ВОЗ приняла интенсифицированную программу искоренения оспы. Широкую материальную помощь этой программе оказали СССР, США, Швеция. СССР не только оказал помощь специалистами, работавшими во многих эндемичных странах, но и поставил безвозмездно около 1,5 млрд доз оспенной вакцины. Использовалась вакцина, представленная живым вирусом осповакцины, выращенным на коже теленка, затем очищенным и высушенным. Хорошие результаты также давали культуральная и эмбриональная (ововакцина) живые вакцины. Для профилактики и лечения осложнений, возникающих иногда при вакцинации, применяли противооспенный донорский иммуноглобулин (10 % раствор в физиологическом растворе гамма-глобулиновой фракции крови доноров, специально ревакцинированных против оспы) и иммуноглобулин крови человека, титрованный на содержание противооспенных антител.

Вирусы, относящиеся к этому семейству, обладают целым рядом следующих особенностей, свойственных только им.

1. Геном представлен однонитевой нефрагментированной позитивной РНК, состоящей из 9000 – 9700 нуклеотидов, но в виде двух идентичных молекул, которые связаны своими 5'-концами. Следовательно, геном их диплоидный. Ретровирусы – единственное семейство вирусов с диплоидным геномом.

2. В состав вириона входит обратная транскриптаза, т. е. РНК-зависимая ДНКполимераза, или ревертаза. По этому признаку семейство получило название (англ. retro – обратно, назад). Этот фермент, называемый полимеразным комплексом, состоит из нескольких доменов и обладает 3 видами активности: обратной транскриптазы, РНКазы Н и ДНК-зависимой ДНК-полимеразы.

3. Благодаря наличию обратной транскриптазы РНК-геном вируса в клетке превращается в ДНК-геном и в таком виде интегрируется в хромосому клетки-хозяина, в результате чего она либо погибает (ВИЧ), либо превращается в опухолевую (онковирусы).

4. В связи с тем что функция обратной транскриптазы не контролируется, фермент допускает много ошибок. Это влечет за собой высокую частоту мутаций в генах, кодирующих структурные белки вируса, т. е. его постоянную изменчивость, что создает трудности в создании эффективных вакцин.

5. По структуре нуклеокапсида и расположению его в вирионе ретровирусы подразделяют на 5 форм: A, B, C, D, E. У вирусов типа А шарообразный нуклеокапсид занимает бо́льшую часть вириона. У вируса типа В нуклеокапсид округлой формы расположен эксцентрично. У вируса типа С шарообразный нуклеокапсид расположен в центре вириона. У вируса типа D нуклеокапсид цилиндрической формы (типа снаряда) с центральным расположением в вирионе. Вирусы типа Е по морфологическим признакам близки к вирусам типа С, но по ряду других свойств отличаются от них.

6. Все ретровирусы имеют общие структурные гены: gag, pol, env, но антигенные связи между родами вирусов или отсутствуют, или крайне слабые.

Семейство Retroviridae включает три подсемейства.

А. Spumavirinae – «пенящие» вирусы; такое название дано потому, что при размножении в культуре клеток происходит интенсивное симпластообразование, которое придает культуре «вспененный» вид. Связи этих вирусов с какими-либо патологическими процессами не установлено.

Б. Oncovirinae – онкогенные вирусы, т. е. вирусы, ответственные за превращение нормальной клетки в опухолевую.

В. Lentivirinae – вирусы – возбудители медленных инфекций. К этому подсемейству относится вирус, вызывающий СПИД.

Вирус иммунодефицита человека

Синдром приобретенного иммунодефицита был выделен в качестве особого заболевания в 1981 г. в США, когда у ряда молодых людей тяжелые заболевания были вызваны микроорганизмами, непатогенными или слабопатогенными для здоровых людей. Исследование иммунного статуса больных выявило у них резкое уменьшение количества лимфоцитов вообще и Т-хелперов в особенности. Это состояние получило название AIDS (англ. Acquired Immune Deficiency Syndrome – синдром приобретенного иммунодефицита, или СПИД). Способ заражения (половой контакт, через кровь и ее препараты) указывал на инфекционный характер заболевания.

Возбудитель СПИДа был открыт в 1983 г. независимо друг от друга французом Л. Монтанье, который назвал его LAV (Lymphoadenopathy Associated Virus), так как обнаружил у больного лимфоаденопатией; и американцем Р. Галло, который назвал вирус HTLV-III (англ. Human T-lymphotropic Virus III – Т-лимфотропный вирус человека III): ранее им были обнаружены лимфотропные вирусы I и II.

Сопоставление свойств вирусов LAV и HTLV-III показало их идентичность, поэтому во избежание путаницы вирус получил в 1986 г. название HIV (англ. Human Immunodeficiency Virus – вирус иммунодефицита человека, или ВИЧ).

ВИЧ шаровидной формы, его диаметр 110 нм. Оболочка вируса имеет форму многогранника, составленного из 12 пятиугольников и 20 шестиугольников. В центре и углах каждого шестиугольника расположена молекула гликозилированного протеина gp120 (число 120 означает молекулярную массу белка в килодальтонах). Всего на поверхности вириона располагаются в виде своеобразных шипов 72 молекулы gp120, каждая из которых связана с внутримембранным белком gp41. Эти белки вместе с двойным липидным слоем образуют суперкапсид (мембрану) вириона (рис. 91).

Белки gp120 и gp41 образуются в результате нарезания клеточной протеазой белка-предшественника Env. Белок gp41 формирует «ножку» шипа, связываясь цитоплазматическим доменом с располагающимся непосредственно под оболочкой матриксным белком р17МА. Молекулы р17, взаимодействуя при созревании вириона, образуют икосаэдр, подстилающий оболочку.

В центральной части вириона белок р24 образует конусообразный капсид. Суженная часть капсида при участии белка р6 связана с оболочкой вириона. Внутри капсида заключены две идентичные молекулы вирусной геномной РНК. Они связаны своими 5'-концами с нуклеокапсидным белком p7NC. Этот белок интересен тем, что имеет два аминокислотных остатка (мотива), богатых цистеином и гистидином и содержащих атом Zn, – их называют «цинковыми пальцами», так как они захватывают молекулы геномной РНК для включения в формирующиеся вирионы. В состав капсида входят также три фермента. Ревертаза (RT), или роl-комплекс, включает в себя обратную транскриптазу, РНК-азу Н и ДНК-зависимую ДНК-полимеразу. Ревертаза присутствует в виде гетеродимера р66/р51. Протеаза (PR) – р10, запускает и реализует процесс созревания вириона. Интеграза (IN) – p31, или эндонуклеаза, обеспечивает включение провирусной ДНК в геном клетки-хозяина. В капсиде содержится также молекула затравочной РНК (тРНК^лиз).

РНК-геном в клетке с помощью обратной транскриптазы превращается в ДНКгеном (ДНК-провирус), состоящий из 9283 нуклеотидных пар. Он ограничен слева и справа так называемыми длинными концевыми повторами, или LTR (англ. long terminal repeat): 5'-LTR – слева и 3'-LTR – справа. LTR содержат по 638 нуклеотидных пар.

Геном ВИЧ состоит из 9 генов, часть из которых перекрывается концами (имеет несколько рамок считывания) и имеет экзон-интронную структуру. Они контролируют синтез 9 структурных и 6 регуляторных белков.

Рис. 91. Геном и схема строения вириона ВИЧ-1 (из обзора С. Н. Иорданского [и др.].

Успехи соврем. биол., 1998, т. 118, в. 1. С. 50):

а – геном ВИЧ-1 (tat, rev, vpu – регуляторные гены, LTR – повторяющиеся концевые последовательности, остальные объяснения в тексте); б – схема строения вириона [по Нермуту (1994), с изменениями];

в – строение капсида.

IN – интеграза; LB – липидный бислой; MHC – белки главного комплекса гистосовместимости и другие клеточные трансмембранные белки; RNA – вирусная геномная РНК; RT – ревертаза; gp41, gp120 – оболочечные гликопротеины; p7NC – нуклеокапсидный белок; р24СА – капсидный белок;

p17MA – матриксный белок

Схематически структура генома ВИЧ выглядит так:

5'-LTR – gag pol vif vpr tat rev vpu env nef – 3'-LTR.

Структурные гены и белки

Регуляторные гены и белки

Значение LTR для вирусного генома заключается в том, что в них расположены следующие регуляторные элементы, контролирующие его работу:

а) сигнал транскрипции (область промотора);

б) сигнал добавления поли-А;

в) сигнал кэпирования;

г) сигнал интеграции;

д) сигнал позитивной регуляции (TAR для белка ТАТ);

е) элемент негативной регуляции (NRЕ для белка NEF);

ж) участок прикрепления затравочной РНК (тРНК^лиз) для синтеза минус-цепи ДНК на 3'-конце; сигнал на 5'-конце LTR, который служит затравкой для синтеза плюс-цепи ДНК.

Кроме того, в LTR имеются элементы, участвующие в регуляции сплайсинга мРНК, упаковки молекул вРНК в капсид (элемент Psi). Наконец, при транскрипции генома в длинных мРНК образуются два сигнала для белка REV, которые переключают синтез белков: CAR – для регуляторных белков и CRS – для структурных белков. Если белок REV связывается с CAR, синтезируются структурные белки; если он отсутствует, синтезируются только регуляторные белки.

В регуляции работы генома вируса особенно важную роль играют следующие гены-регуляторы и их белки: 1) белок ТАТ, который осуществляет позитивный контроль размножения вируса и действует через регуляторный участок TAR; 2) белки NEV и VPU, осуществляющие негативный контроль размножения через участок NRE; 3) белок REV, осуществляющий позитивно-негативный контроль. Белок REV контролирует работу генов gag, pol, env и осуществляет негативную регуляцию сплайсинга. Таким образом, размножение ВИЧ находится под тройным контролем – позитивным, негативным и позитивно-негативным.

Белок VIF определяет инфекционность вновь синтезированного вируса. Он связан с капсидным белком р24 и присутствует в вирионе в количестве 60 молекул. Белок NEF представлен в вирионе небольшим числом молекул (5 – 10), возможно, связанных с оболочкой.

Белок VPR тормозит клеточный цикл на фазе G2, участвует в транспорте преинтеграционных комплексов в ядро клетки, активирует некоторые вирусные и клеточные гены, повышает эффективность репликации вируса в моноцитах и макрофагах. Место расположения белков VPR, TAT, REV, VPU в вирионе не установлено.

Помимо собственных белков в состав оболочки вириона могут входить некоторые белки клетки-хозяина. Белки VPU и VPR участвуют в регуляции репродукции вируса.

Гнойно-воспалительные заболевания относятся к числу наиболее распространенных. Ими ежегодно болеют многие миллионы людей. Одна из причин этого – наличие большого количества возбудителей. Способностью вызывать гнойные и серозно-гнойные воспаления у человека и животных обладают многие патогенные и условно-патогенные бактерии, но громадное большинство острых и подострых нагноений вызывают кокки. На втором месте стоят грамотрицательные бактерии – факультативные анаэробы: Esсherichia, Proteus, Klebsiella, Pseudomonas и др., а также строгие анаэробы, не образующие спор, из семейства Bacteroidaceae (Bacteroides и Fusоbacterium). Однако репутация гноеродных (пиогенных) укоренилась прежде всего за кокками, так как они вызывают 70 – 80 % всех гнойных заболеваний.

Грамположительные кокки относятся к семействам Micrococcaceae (Staphylococcus) и Streptococcaceae (роды Streptococcus, Enterococcus, Aerococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus); грамотрицательные кокки – к роду Neisseria.

Грамположительные кокки

Стафилококки

Стафилококк был обнаружен в 1878 г. Р. Кохом и в 1880 г. Л. Пастером в гнойном материале. Л. Пастер, заразив кролика, окончательно доказал роль стафилококка как возбудителя гнойного воспаления. Название «стафилококк» дал в 1881 г. А. Огстон (из-за характерного расположения клеток), а подробно описал его свойства в 1884 г. Ф. Розенбах. Стафилококки – грамположительные, правильной геометрической формы шаровидные клетки диаметром 0,5 – 1,5 мкм, располагающиеся обычно в виде гроздьев (см. цв. вкл., рис. 92), каталазопозитивны, восстанавливают нитраты в нитриты, активно гидролизуют белки и жиры, сбраживают в анаэробных условиях глюкозу с образованием кислоты без газа. Обычно могут расти в присутствии 15 %-ного NaCl и при температуре 45 °C. Содержание Г + Ц в ДНК – 30 – 39 мол %. Стафилококки не имеют жгутиков, не образуют спор. Они широко распространены в природе. Их главным резервуаром являются кожные покровы человека и животных и их слизистые оболочки, сообщающиеся с внешней средой. Стафилококки – факультативные анаэробы, лишь один вид (Staphylococcus saccharolyticus) – строгий анаэроб. Стафилококки не требовательны к питательным средам, хорошо растут на обычных средах, температурный оптимум для роста 35 – 37 °C, рН 6,2 – 8,4. Колонии круглые, 2 – 4 мм в диаметре, с ровными краями, выпуклые, непрозрачные, окрашены в цвет образуемого пигмента. Рост в жидкой культуре сопровождается равномерным помутнением, со временем выпадает рыхлый осадок. При росте на обычных средах стафилококки не образуют капсулы, однако при посеве уколом в полужидкий агар с плазмой или сывороткой большинство штаммов S. aureus образует капсулу. Бескапсульные штаммы в полужидком агаре растут в виде компактных колоний, капсульные – образуют диффузные колонии.

Стафилококки обладают высокой биохимической активностью: ферментируют с выделением кислоты (без газа) глицерин, глюкозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, маннит; образуют различные ферменты (плазмокоагулазу, фибринолизин, лецитиназу, лизоцим, щелочную фосфатазу, ДНКазу, гиалуронидазу, теллуритредуктазу, протеиназу, желатиназу и др.). Указанные ферменты играют важную роль в метаболизме стафилококков и во многом определяют их патогенность. Такие ферменты, как фибринолизин и гиалуронидаза, обусловливают высокую инвазивность стафилококков. Плазмокоагулаза является главным фактором их патогенности: она защищает от фагоцитоза и переводит протромбин в тромбин, который вызывает свертывание фибриногена, в результате чего каждая клетка покрывается белковой пленкой, защищающей от фагоцитов.

Классификация. Род Staphylococcus включает в себя более 20 видов, которые подразделяются на две группы – коагулазоположительные и коагулазоотрицательные стафилококки. Для дифференциации видов используют различные признаки (табл. 22).

Таблица 22

Дифференциальные признаки основных видов стафилококков

Примечание. (+) – признак положительный; ( – ) – признак отрицательный; + ( – ) – признак непостоянный;? – неизвестно.

I. Коагулазоположительные стафилококки:

1. S. aureus***.

2. S. intermedius**.

3. S. hyicus^a.

II. Коагулазоотрицательные стафилококки:

* Патогенные только для человека.

** Патогенные только для животных.

*** Патогенные для человека и животных.

^a Не все штаммы S. hyicus имеют коагулазу.

Патогенными для человека являются, главным образом, коагулазоположительные стафилококки, но многие коагулазоотрицательные также способны вызывать заболевания, особенно у новорожденных детей (конъюнктивит новорожденных, эндокардит, сепсис, заболевания мочевыводящих путей, острый гастроэнтерит и др.). S. aureus в зависимости от того, кто является его основным носителем, разделяется на 10 эковаров (hominis, bovis, ovis и др.).

У стафилококков обнаружено более 50 типов антигенов, к каждому из них в организме образуются антитела, многие из антигенов обладают аллергенными свойствами. По специфичности антигены подразделяют на родовые (общие для всего рода Staphylococcus); перекрестно реагирующие – антигены, общие с изоантигенами эритроцитов, кожи и почек человека (с ними связаны аутоиммунные заболевания); видовые и типоспецифические антигены. По типоспецифическим антигенам, выявляемым в реакции агглютинации, стафилококки разделяют более чем на 30 серовариантов. Однако серологический метод типирования стафилококков не получил еще широкого применения. К числу видоспецифических относят белок А, который образует S. aureus. Этот белок располагается поверхностно, он ковалентно связан с пептидогликаном, его м. м. составляет около 42 кД. Белок А особенно активно синтезируется в логарифмической фазе роста при температуре 41 °C, термолабилен, не разрушается трипсином; уникальным его свойством является способность связываться с Fc-фрагментом иммуноглобулинов IgG (IgG₁, IgG₂, IgG₄), в меньшей степени с IgM и IgA. На поверхности белка А выявлено несколько участков, способных соединяться с участком полипептидной цепи иммуноглобулина, расположенным на границе доменов СН₂ и СН₃. Это свойство нашло широкое применение в реакции коагглютинации: стафилококки, нагруженные специфическими антителами, у которых остаются свободными активные центры, при взаимодействии с антигеном дают быструю реакцию агглютинации.

Взаимодействие белка А с иммуноглобулинами приводит к нарушениям функций систем комплемента и фагоцитов в организме больного. Он обладает антигенными свойствами, является сильным аллергеном и индуцирует размножение Т– и В-лимфоцитов. Его роль в патогенезе стафилококковых заболеваний выяснена еще не полностью.

Штаммы S. aureus различаются по чувствительности к стафилококковым фагам. Для типирования S. aureus используют международный набор из 23 умеренных фагов, которые разделены на четыре группы:

1-я группа – фаги 29, 52, 52А, 79, 80;

2-я группа – фаги 3А, 3С, 55, 71;

3-я группа – фаги 6, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 83А, 84, 85;

4-я группа – фаги 94, 95, 96;

вне групп – фаг 81.

Отношение стафилококков к фагам своеобразное: один и тот же штамм может лизироваться либо одним фагом, либо одновременно несколькими. Но поскольку чувствительность их к фагам является признаком относительно стабильным, фаготипирование стафилококков имеет важное эпидемиологическое значение. Недостаток этого метода состоит в том, что типированию поддается не более 65 – 70 % S. aureus. В последние годы получены наборы специфических фагов и для типирования S. epidermidis.

Факторы патогенности стафилококков. Стафилококк – уникальный микроорганизм. Он может вызывать более 100 различных заболеваний, относящихся к одиннадцати классам по Международной классификации 1968 г. Стафилококки могут поражать любую ткань, любой орган. Это свойство стафилококков обусловлено наличием у них большого комплекса факторов патогенности.

1. Факторы адгезии – прикрепление стафилококков к клеткам тканей обусловлено их гидрофобностью (чем она выше, тем сильнее проявляются адгезивные свойства), а также адгезивными свойствами полисахаридов, возможно также белка А, и способностью связывать фибронектин (рецептор некоторых клеток).

2. Разнообразные ферменты, играющие роль факторов «агрессии и защиты»: плазмокоагулаза (главный фактор патогенности), гиалуронидаза, фибринолизин, ДНКаза, лизоцимоподобный фермент, лецитиназа, фосфатаза, протеиназа и т. д.

3. Комплекс секретируемых экзотоксинов:

а) мембраноповреждающие токсины – α, β, δ и γ. Ранее их описывали как гемолизины, некротоксины, лейкоцидины, летальные токсины, т. е. по характеру их действия: гемолиз эритроцитов, некроз при внутрикожном введении кролику, разрушение лейкоцитов, смерть кролика при внутривенном введении. Однако оказалось, что такой эффект вызывает один и тот же фактор – мембраноповреждающий токсин. Он обладает цитолитическим действием в отношении различных типов клеток, которое проявляется следующим образом. Молекулы этого токсина сначала связываются с неизвестными пока рецепторами мембраны клетки-мишени или неспецифически абсорбируются липидами, содержащимися в мембране, а затем формируют из 7 молекул грибовидный гептамер, состоящий из 3 доменов. Домены, формирующие «шляпку» и «край», расположены на внешней поверхности мембран, а домен «ножки» служит трансмембранным каналом-порой. Через нее и происходит вход и выход небольших молекул и ионов, что ведет к набуханию и гибели клеток, имеющих ядро, и осмотическому лизису эритроцитов. Обнаружено несколько типов мембраноповреждающих (порообразующих) токсинов: α-, β-, δ– и γ-гемолизины (α-, β-, δ– и γ-токсины). Они различаются по ряду свойств. Гемолизин α чаще обнаруживается у стафилококков, выделенных от человека, он лизирует эритроциты человека, кроликов и баранов. Летальный эффект у кроликов вызывает при внутривенном введении через 3 – 5 мин. Гемолизин β обнаруживают чаще у стафилококков животного происхождения, он лизирует человеческие и бараньи эритроциты (лучше при более низкой температуре). Гемолизин δ лизирует эритроциты человека и многих видов животных. Летальное действие на кролика при внутривенном введении вызывает через 16 – 24 – 48 ч. Очень часто у стафилококков обнаруживаются α– и δ-токсины одновременно;

б) эксфолиативные токсины А и В различают по антигенным свойствам, отношению к температуре (А – термостабилен, В – термолабилен), локализации генов, контролирующих их синтез (А контролируется хромосомным геном, В – плазмидным). Нередко у одного и того же штамма S. aureus синтезируются оба эксфолиатина. С этими токсинами связана способность стафилококков вызывать пузырчатку у новорожденных, буллезное импетиго, скарлатиноподобную сыпь;

в) истинный лейкоцидин – токсин, отличающийся от гемолизинов по антигенным свойствам, избирательно действует на лейкоциты, разрушая их;

г) экзотоксин, вызывающий синдром токсического шока (СТШ). Он обладает свойствами суперантигена. Для СТШ характерны повышение температуры, снижение артериального давления, кожные высыпания с последующим шелушением на кистях и стопах, лимфоцитопения, иногда диарея, поражение почек и др. К продукции и секреции этого токсина способны более 50 % штаммов S. aureus.

4. Сильные аллергизирующие свойства, которыми обладают как компоненты структуры клеток, так и экзотоксины и другие секретируемые бактериями продукты жизнедеятельности. Стафилококковые аллергены способны вызывать реакции гиперчувствительности как замедленного типа (ГЧЗ), так и немедленного типа (ГЧН). Стафилококки являются главными виновниками кожных и респираторных аллергий (дерматиты, бронхиальная астма и т. п.). Особенность патогенеза стафилококковой инфекции и ее тенденция к переходу в хроническую форму коренятся в эффекте ГЧЗ.

5. Перекрестно реагирующие антигены (с изоантигенами эритроцитов А и В, почек и кожи – индукция аутоантител, развитие аутоиммунных заболеваний).

6. Факторы, угнетающие фагоцитоз. Наличие их может проявляться в угнетении хемотаксиса, защите клеток от поглощения фагоцитами, в обеспечении стафилококкам возможности размножаться в фагоцитах и блокировке «окислительного взрыва». Фагоцитоз угнетают капсула, белок А, пептидогликан, тейхоевые кислоты, токсины. Кроме того, стафилококки индуцируют синтез некоторыми клетками организма (например, спленоцитами) супрессоров фагоцитарной активности. Угнетение фагоцитоза не только препятствует очищению организма от стафилококков, но и нарушает функцию процессинга и представления антигенов Т– и В-лимфоцитам, что ведет к снижению силы иммунного ответа.

Наличие капсулы у стафилококков повышает их вирулентность для белых мышей, делает устойчивыми к действию фагов, не позволяет типировать агглютинирующими сыворотками и маскирует белок А.

Тейхоевые кислоты не только защищают стафилококки от фагоцитоза, но, очевидно, играют существенную роль в патогенезе стафилококковых инфекций. Установлено, что у детей, страдающих эндокардитом, в 100 % случаев обнаруживаются антитела к тейхоевым кислотам.

7. Митогенное действие стафилококков в отношении лимфоцитов (этим действием обладают белок А, энтеротоксины и другие продукты, секретируемые стафилококками).

8. Энтеротоксины A, B, C1, C2, C3, D, E. Они характеризуются антигенной специфичностью, термостабильностью, устойчивостью к действию формалина (не превращаются в анатоксины) и пищеварительных ферментов (трипсина и пепсина), устойчивы в диапазоне рН от 4,5 до 10,0. Энтеротоксины являются низкомолекулярными белками с м. м. от 26 до 34 кД со свойствами суперантигенов.

Установлено также, что существуют генетически обусловленные различия в чувствительности к стафилококковой инфекции и характеру ее течения у людей. В частности, тяжелые стафилококковые гнойно-септические заболевания чаще обнаруживаются у людей с группами крови А и АВ, реже – у лиц 0 и В групп.

С синтезом энтеротоксинов связана способность стафилококков вызывать пищевые отравления типа интоксикации. Чаще всего они вызываются энтеротоксинами A и D. Механизм действия этих энтеротоксинов мало изучен, но он отличается от действия других бактериальных энтеротоксинов, которые нарушают функцию аденилатциклазной системы. Все типы стафилококковых энтеротоксинов вызывают сходную картину отравления: тошнота, рвота, боли в поджелудочной области, диарея, иногда головная боль, повышение температуры, мышечный спазм. Эти особенности стафилококковых энтеротоксинов обусловлены их суперантигенными свойствами: они индуцируют избыточный синтез интерлейкина-2, который и вызывает интоксикацию. Энтеротоксины возбуждают гладкую мускулатуру кишечника и повышают моторику желудочно-кишечного тракта. Отравление чаще всего связано с употреблением инфицированных стафилококком молочных продуктов (мороженого, пирожных, тортов, сыра, творога и т. п.) и консервов с маслом. Инфицирование молочных продуктов может быть связано с маститами у коров или с гнойно-воспалительными заболеваниями людей, имеющих отношение к производству продуктов.

Таким образом, обилие различных факторов патогенности у стафилококков и их высокие аллергизующие свойства обусловливают особенности патогенеза стафилококковых заболеваний, их характер, локализацию, тяжесть течения и клинические проявления. Авитаминоз, диабет, снижение иммунитета способствуют развитию стафилококковых заболеваний.

Резистентность стафилококков. Среди не образующих спор бактерий стафилококки, как и микобактерии, обладают наибольшей устойчивостью к внешним факторам. Они хорошо переносят высыхание и остаются жизнеспособными и вирулентными неделями и месяцами в сухой мельчайшей пыли, являясь источником пылевой инфекции. Прямой солнечный свет убивает их лишь в течение многих часов, а рассеянный действует очень слабо. Они устойчивы и к высокой температуре: нагревание до 80 °C выдерживают около 30 мин, сухой жар (110 °C) убивает их в течение 2 ч; низкие температуры переносят хорошо. Чувствительность к химическим дезинфектантам сильно варьирует, например, 3 %-ный раствор фенола убивает их в течение 15 – 30 мин, а 1 %-ный водный раствор хлорамина – за 2 – 5 мин.

Особенности эпидемиологии. Поскольку стафилококки являются постоянными обитателями кожи и слизистых оболочек, заболевания, вызываемые ими, могут иметь характер либо аутоинфекции (при различных повреждениях кожи и слизистых оболочек, в том числе и при микротравмах), либо экзогенной инфекции, обусловленной контактно-бытовым, воздушно-капельным, воздушно-пылевым или алиментарным (при пищевых отравлениях) способами заражения.

Особое значение имеет носительство патогенных стафилококков, так как носители, особенно в медицинских учреждениях (различные хирургические клиники, родильные дома и т. п.) и в закрытых коллективах, могут стать причиной стафилококковых инфекций. Носительство патогенных стафилококков может иметь временный или перемежающийся характер, но особую опасность для окружающих представляют лица, у которых оно является постоянным (резидентные носители). У таких людей стафилококки длительное время и в большом количестве персистируют на слизистых оболочках носа и зева. Причина длительного носительства не совсем ясна. Оно может быть следствием ослабления местного иммунитета (недостаток секреторных IgA), нарушения функций слизистой оболочки, повышения адгезивных свойств стафилококка или обусловлено какими-либо другими его свойствами.

Особенности патогенеза и клиники. Стафилококки легко проникают в организм через мельчайшие повреждения кожи и слизистых оболочек и могут вызвать самые различные заболевания – от юношеских угрей (acne) до тяжелейшего перитонита, эндокардита, сепсиса или септикопиемии, при которых летальность достигает 80 %. Стафилококки вызывают фурункулы, гидрадениты, абсцессы, флегмоны, остеомиелиты; в военное время – частые виновники гнойных осложнений ран; стафилококки играют ведущую роль в гнойной хирургии. Обладая аллергенными свойствами, они могут стать причиной псориаза, геморрагического васкулита, рожистого воспаления, неспецифического полиартрита. Инфицирование стафилококками пищевых продуктов – частая причина пищевых отравлений. Стафилококки – главные виновники сепсиса, в том числе у новорожденных. В отличие от бактериемии (бактерии в крови), которая является симптомом болезни и наблюдается при многих бактериальных инфекциях, сепсис (септицемия – гнилокровие) представляет собой самостоятельную болезнь с определенной клинической картиной, в основе которой лежит поражение органов ретикулоэндотелиальной системы (системы мононуклеарных фагоцитов – СМФ). При сепсисе имеется гнойный очаг, из которого в кровь периодически поступает возбудитель, разносится по организму и поражает ретикулоэндотелиальную систему (СМФ), в клетках которой он размножается, выделяя токсины и аллергены. При этом клиническая картина сепсиса слабо зависит от вида возбудителя, а определяется поражением тех или иных органов.

Септикопиемия – форма сепсиса, при котором возбудитель вызывает гнойные очаги в различных органах и тканях, т. е. это сепсис, осложненный гнойными метастазами.

Бактериемия при сепсисе и септикопиемии может быть кратковременной и длительной.

Постинфекционный иммунитет существует, он обусловлен как гуморальными, так и клеточными факторами. Важную роль в нем играют антитоксины, антимикробные антитела, антитела против ферментов, а также Т-лимфоциты и фагоциты. Напряженность и длительность иммунитета против стафилококков изучены недостаточно, так как у них слишком разнообразна антигенная структура, а перекрестного иммунитета нет.

Лабораторная диагностика. Основной метод – бактериологический; разработаны и внедрены серологические реакции. В случае необходимости (при интоксикациях) прибегают к биологической пробе. Материалом для бактериологического исследования служат кровь, гной, слизь из зева, носа, отделяемое ран, мокрота (при стафилококковой пневмонии), испражнения (при стафилококковом колите), в случае пищевых интоксикаций – рвотные массы, испражнения, промывные воды желудка, подозрительные продукты. Материал засевают на кровяной агар (гемолиз), на молочно-солевой (молочно-желточно-солевой) агар (угнетается рост посторонних бактерий за счет NaCl, лучше выявляются пигмент и лецитиназа). Выделенную культуру идентифицируют по видовым признакам, определяют у нее наличие основных признаков и факторов патогенности (золотистый пигмент, сбраживание маннита, гемолиз, плазмокоагулаза), обязательно проверяют чувствительность к антибиотикам, в случае необходимости проводят фаготипирование. Из числа серологических реакций для диагностики гнойно-септических заболеваний применяют РПГА и ИФМ, в частности для определения антител к тейхоевой кислоте или к видоспецифическим антигенам.

Для определения энтеротоксигенности стафилококков используют три метода:

1) серологический – с помощью специфических антитоксических сывороток в реакции преципитации в геле обнаруживают энтеротоксин и устанавливают его тип;

2) биологический – внутривенное введение фильтрата бульонной культуры стафилококка кошкам в дозе 2 – 3 мл на 1 кг веса. Токсины вызывают у кошек рвоту и понос;

3) непрямой бактериологический метод – выделение из подозрительного продукта чистой культуры стафилококка и определение у него факторов патогенности (образование энтеротоксина коррелирует с наличием других факторов патогенности, в частности РНК-азы).

Наиболее простым и чувствительным является серологический метод обнаружения энтеротоксина.

Лечение. Для лечения стафилококковых заболеваний используют главным образом бета-лактамные антибиотики, к которым прежде всего следует определять чувствительность. При тяжелых и хронических стафилококковых инфекциях положительный эффект дает специфическая терапия – применение аутовакцины, анатоксина, противостафилококкового иммуноглобулина (человеческого), антистафилококковой плазмы.

Специфическая профилактика. Для создания искусственного иммунитета против стафилококковой инфекции применяют стафилококковый анатоксин (жидкий и таблетированный), но он создает антитоксический иммунитет только против стафилококков, лизируемых главным образом фагами I группы. Применение вакцин из убитых стафилококков или их антигенов хотя и приводит к появлению антимикробных антител, но только против тех серовариантов, из которых изготовлена вакцина. Проблема изыскания высокоиммуногенной вакцины, эффективной против многих видов патогенных стафилококков, – одна из важнейших проблем современной микробиологии.

Стрептококки

Стрептококки относятся к семейству Streptococcaceae (род Streptococcus). Впервые были обнаружены Т. Бильротом в 1874 г. при роже; Л. Пастером – в 1878 г. при послеродовом сепсисе; выделены в чистой культуре в 1883 г. Ф. Фелейзеном.

Стрептококки (греч. streptos – цепочка и coccus – зерно) – грамположительные, цитохромнегативные, каталазонегативные клетки шаровидной или овоидной формы диаметром 0,6 – 1,0 мкм, растут в виде цепочек различной длины (см. цв. вкл., рис. 92) или в виде тетракокков; неподвижны (кроме некоторых представителей серогруппы Д); содержание Г + Ц в ДНК – 32 – 44 мол % (для семейства). Спор не образуют. Патогенные стрептококки образуют капсулу. Стрептококки – факультативные анаэробы, но имеются и строгие анаэробы. Температурный оптимум 37 °C, оптимальная рН 7,2 – 7,6. На обычных питательных средах патогенные стрептококки или не растут, или растут очень скудно. Для их культивирования обычно используют сахарный бульон и кровяной агар, содержащий 5 % дефибринированной крови. Среда не должна содержать восстанавливающих сахаров, так как они угнетают гемолиз. На бульоне рост придонно-пристеночный в виде крошковатого осадка, бульон прозрачен. Стрептококки, образующие короткие цепочки, вызывают помутнение бульона. На плотных средах стрептококки серогруппы А образуют колонии трех типов: а) мукоидные – крупные, блестящие, напоминают каплю воды, но имеют вязкую консистенцию. Такие колонии образуют свежевыделенные вирулентные штаммы, имеющие капсулу;

б) шероховатые – более крупные, чем мукоидные, плоские, с неровной поверхностью и фестончатыми краями. Такие колонии образуют вирулентные штаммы, имеющие М-антигены;

в) гладкие, менее крупные колонии с ровными краями; образуют невирулентные культуры.

Стрептококки ферментируют глюкозу, мальтозу, сахарозу и некоторые другие углеводы с образованием кислоты без газа (кроме S. kefir, который образует кислоту и газ), молоко не свертывают (кроме S. lactis), протеолитическими свойствами не обладают (кроме некоторых энтерококков).

Классификация стрептококков. Род стрептококков включает около 50 видов. Среди них выделяют 4 патогенных (S. pyogenes, S. pneumoniae, S. agalactiаe и S. equi), 5 условно-патогенных и более 20 оппортунистических видов. Для удобства весь род подразделяют на 4 группы, используя следующие признаки: рост при температуре 10 °C; рост при 45 °C; рост на среде, содержащей 6,5 % NaCl; рост на среде с рН 9,6;

рост на среде, содержащей 40 % желчи; рост в молоке с 0,1 %-ным метиленовым синим; рост после прогревания при температуре 60 °C в течение 30 мин.

Большинство патогенных стрептококков относится к первой группе (все перечисленные признаки, как правило, отрицательны). Энтерококки (серогруппа Д), которые также вызывают различные заболевания человека, относятся к третьей группе (все перечисленные признаки, как правило, положительны).

В основе наиболее простой классификации лежит отношение стрептококков к эритроцитам. Различают:

– β-гемолитические стрептококки – при росте на кровяном агаре вокруг колонии четкая зона гемолиза (см. цв. вкл., рис. 93а);

– α-гемолитические стрептококки – вокруг колонии зеленоватое окрашивание и частичный гемолиз (позеленение обусловлено превращением оксигемоглобина в метгемоглобин, см. цв. вкл., рис. 93б);

– α1-гемолитические стрептококки по сравнению с β-гемолитическими стрептококками образуют менее выраженную и мутноватую зону гемолиза;

– α– и α1-стрептококки называют S. viridans (зеленящими стрептококками);

– γ-негемолитические стрептококки не вызывают гемолиза на плотной питательной среде.

Большое практическое значение получила серологическая классификация. Стрептококки имеют сложное антигенное строение: у них имеется общий для всего рода антиген и различные другие антигены. Среди них особое значение для классификации имеют группоспецифические полисахаридные антигены, локализованные в клеточной стенке. По этим антигенам по предложению Р. Лансфельд стрептококки разделены на серологические группы, обозначаемые буквами A, B, C, D, F, G и т. д. Сейчас известны 20 серологических групп стрептококков (от А до V). Патогенные для человека стрептококки относятся к группе А, к группам B и D, реже – к C, F и G. В связи с этим определение групповой принадлежности стрептококков является решающим моментом в диагностике вызываемых ими болезней. Групповые полисахаридные антигены определяются с помощью соответствующих антисывороток в реакции преципитации.

Помимо групповых антигенов у гемолитических стрептококков обнаружены типоспецифические антигены. У стрептококков группы А ими являются белки М, Т и R. Белок М термоустойчив в кислой среде, но разрушается трипсином и пепсином. Его обнаруживают после соляно-кислого гидролиза стрептококков с помощью реакции преципитации. Белок Т разрушается при нагревании в кислой среде, но устойчив к действию трипсина и пепсина. Его определяют с помощью реакции агглютинации. R-антиген обнаружен также у стрептококков серогрупп B, C и D. Он чувствителен к пепсину, но не к трипсину, разрушается при нагревании в присутствии кислоты, но устойчив при умеренном нагревании в слабом щелочном растворе. По М-антигену гемолитические стрептококки серогруппы А подразделяют на большое количество серовариантов (около 100), их определение имеет эпидемиологическое значение. По Т-белку стрептококки серогруппы А также подразделяют на несколько десятков серовариантов. В группе В различают 8 серовариантов.

Стрептококки также имеют перекрестно реагирующие антигены, общие для антигенов клеток базального слоя эпителия кожи и эпителиальных клеток корковой и медуллярной зон тимуса, что, возможно, является причиной аутоиммунных нарушений, вызываемых этими кокками. В клеточной стенке стрептококков обнаружен антиген (рецептор II), с которым связана их способность, как и стафилококков, имеющих белок А, взаимодействовать с Fc-фрагментом молекулы IgG.

Болезни, вызываемые стрептококками, распределены по 11 классам. Основные группы этих болезней таковы: а) различные нагноительные процессы – абсцессы, флегмоны, отиты, перитониты, плевриты, остеомиелиты и др.;

б) рожистое воспаление – раневая инфекция (воспаление лимфатических сосудов кожи и подкожной клетчатки);

в) гнойные осложнения ран (особенно в военное время) – абсцессы, флегмоны, сепсис и др.;

г) ангины – острые и хронические;

д) сепсисы: острый сепсис (острый эндокардит); хронический сепсис (хронический эндокардит); послеродовый (пуэрперальный) сепсис;

е) ревматизм;

ж) пневмонии, менингиты, ползучая язва роговицы (пневмококк);

з) скарлатина;

и) кариес зубов – возбудителем его чаще всего является S. mutans. Выделены и изучаются гены кариесогенных стрептококков, ответственные за синтез ферментов, которые обеспечивают колонизацию этими стрептококками поверхности зубов и десен.

Хотя бо́льшая часть патогенных для человека стрептококков относится к серогруппе А, важную роль в патологии человека играют и стрептококки серогрупп D и B. Стрептококки серогруппы D (энтерококки) признаны возбудителями раневых инфекций, различных гнойных хирургических заболеваний, гнойных осложнений у беременных, родильниц и гинекологических больных, инфицируют почки, мочевой пузырь, вызывают сепсис, эндокардит, пневмонии, пищевые токсикоинфекции (протеолитические варианты энтерококков). Стрептококки серогруппы В (S. agalactiae) часто вызывают заболевания новорожденных – инфекции дыхательных путей, менингит, септицемию. Эпидемиологически они связаны с носительством этого вида стрептококков у матери и персонала родильных домов.

Анаэробные стрептококки (Peptostreptococcus), которые обнаруживаются у здоровых людей в составе микрофлоры дыхательных путей, рта, носоглотки, кишечника и влагалища, также могут быть виновниками гнойно-септических заболеваний – аппендицита, послеродового сепсиса и др.

Основные факторы патогенности стрептококков.

1. Белок М – главный фактор патогенности. М-белки стрептококка представляют собой фибриллярные молекулы, которые образуют фимбрии на поверхности клеточной стенки стрептококков группы А. М-белок определяет адгезивные свойства, угнетает фагоцитоз, определяет антигенную типоспецифичность и обладает свойствами суперантигена. Антитела к М-антигену обладают защитными свойствами (антитела к Т– и R-белкам такими свойствами не обладают). М-подобные белки обнаружены у стрептококков групп С и G и, возможно, являются факторами их патогенности.

2. Капсула. Она состоит из гиалуроновой кислоты, аналогичной той, которая входит в состав ткани, поэтому фагоциты не распознают стрептококки, имеющие капсулу, как чужеродные антигены.

3. Эритрогенин – скарлатинозный токсин, суперантиген, вызывает СТШ. Различают три серотипа (А, В, С). У больных скарлатиной он вызывает появление ярко-красной сыпи на коже и слизистой оболочке. Обладает пирогенным, аллергенным, иммуносупрессивным и митогенным действием, разрушает тромбоциты.

4. Гемолизин (стрептолизин) О разрушает эритроциты, обладает цитотоксическим, в том числе лейкотоксическим и кардиотоксическим, действием, его образуют большинство стрептококков серогрупп А, С и G.

5. Гемолизин (стрептолизин) S обладает гемолитическим и цитотоксическим действием. В отличие от стрептолизина О, стрептолизин S является очень слабым антигеном, его также продуцируют стрептококки серогрупп А, С и G.

6. Стрептокиназа – фермент, который превращает преактиватор в активатор, а он – плазминоген в плазмин, последний и гидролизует фибрин. Таким образом, стрептокиназа, активируя фибринолизин крови, повышает инвазивные свойства стрептококка.

7. Фактор, угнетающий хемотаксис (аминопептидаза), подавляет подвижность нейтрофильных фагоцитов.

8. Гиалуронидаза – фактор инвазии.

9. Фактор помутнения – гидролиз липопротеидов сыворотки крови.

10. Протеазы – разрушение различных белков; возможно, с ними связана тканевая токсичность.

11. ДНКазы (A, B, C, D) – гидролиз ДНК.

12. Способность взаимодействовать с Fc-фрагментом IgG с помощью рецептора II – угнетение системы комплемента и активности фагоцитов.

13. Выраженные аллергенные свойства стрептококков, которые обусловливают сенсибилизацию организма.

Резистентность стрептококков. Стрептококки хорошо переносят низкие температуры, довольно устойчивы к высыханию, особенно в белковой среде (кровь, гной, слизь), сохраняют жизнеспособность в течение нескольких месяцев на предметах и пыли. При нагревании до температуры 56 °C погибают через 30 мин, кроме стрептококков группы D, которые выдерживают нагревание до 70 °C в течение 1 ч 3 – 5 % раствор карболовой кислоты и лизола убивает их в течение 15 мин.

Особенности эпидемиологии. Источником экзогенной стрептококковой инфекции служат больные острыми стрептококковыми болезнями (ангина, скарлатина, пневмония), а также реконвалесценты после них. Основной способ заражения – воздушно-капельный, в других случаях – прямой контакт и очень редко алиментарный (молоко и другие пищевые продукты).

Особенности патогенеза и клиники. Стрептококки являются обитателями слизистых оболочек верхних дыхательных путей, пищеварительного и мочеполового трактов, поэтому вызываемые ими заболевания могут быть эндогенного или экзогенного характера, т. е. вызываются либо собственными кокками, либо в результате заражения извне. Проникнув через поврежденную кожу, стрептококки распространяются из местного очага через лимфатическую и кровеносную системы. Заражение воздушно-капельным или воздушно-пылевым путем приводит к поражению лимфоидной ткани (тонзиллиты), в процесс вовлекаются регионарные лимфатические узлы, откуда возбудитель распространяется по лимфатическим сосудам и гематогенно.

Способность стрептококков вызывать различные заболевания зависит от:

а) места входных ворот (раневые инфекции, пуэрперальный сепсис, рожистое воспаление и др.; инфекции дыхательных путей – скарлатина, ангины);

б) наличия у стрептококков различных факторов патогенности;

в) состояния иммунной системы: при отсутствии антитоксического иммунитета заражение токсигенными стрептококками серогруппы А приводит к развитию скарлатины, а при наличии антитоксического иммунитета возникает ангина;

г) сенсибилизирующих свойств стрептококков; они во многом определяют особенность патогенеза стрептококковых заболеваний и являются основной причиной таких осложнений, как нефрозонефриты, артриты, поражение сердечно-сосудистой системы и др.;

д) гноеродных и септических функций стрептококков;

е) наличия большого количества серовариантов стрептококков серогруппы А по М-антигену.

Антимикробный иммунитет, который обусловлен антителами к белку М, имеет типоспецифический характер, а поскольку серовариантов по М-антигену очень много, возможны повторные заболевания ангиной, рожей и другими стрептококковыми болезнями. Более сложный характер имеет патогенез хронических инфекций, обусловленных стрептококками: хронический тонзиллит, ревматизм, нефрит. Подтверждением этиологической роли в них стрептококков серогруппы А служат следующие обстоятельства:

1) эти заболевания, как правило, возникают после перенесения острых стрептококковых инфекций (ангина, скарлатина);

2) у таких больных часто обнаруживают стрептококки или их L-формы и антигены в крови, особенно при обострениях, и, как правило, гемолитические или зеленящие стрептококки на слизистой зева;

3) постоянное обнаружение антител к различным антигенам стрептококков. Особенно ценное диагностическое значение имеет обнаружение у больных ревматизмом во время обострения в крови анти-О-стрептолизинов и антигиалуронидазных антител в высоких титрах;

4) развитие сенсибилизации к различным стрептококковым антигенам, в том числе к термостабильному компоненту эритрогенина. Возможно, что в развитии ревматизма и нефрита играют роль аутоантитела к соединительной и почечной ткани соответственно;

5) очевидный терапевтический эффект от применения антибиотиков против стрептококков (пенициллина) во время ревматических атак.

Постинфекционный иммунитет. Основную роль в его формировании играют антитоксины и типоспецифические М-антитела. Антитоксический иммунитет после скарлатины носит прочный длительный характер. Антимикробный иммунитет также прочный и длительный, но его эффективность ограничивается типоспецифичностью М-антител.

Лабораторная диагностика. Основным методом диагностики стрептококковых заболеваний является бактериологический. Материалом для исследования служат кровь, гной, слизь из зева, налет с миндалин, отделяемое ран. Решающим этапом исследования выделенной чистой культуры является определение ее серогруппы. Для этой цели используют два метода.

А. Серологический – определение группового полисахарида с помощью реакции преципитации. Для этой цели используют соответствующие группоспецифические сыворотки. Если штамм является бета-гемолитическим, его полисахаридный антиген экстрагируют HCl и испытывают с антисыворотками серогрупп A, B, C, D, F и G. Если штамм не вызывает бета-гемолиза, его антиген экстрагируют и проверяют с антисыворотками только групп B и D. Антисыворотки групп A, C, F и G часто дают перекрестные реакции с альфа-гемолитическими и негемолитическими стрептококками. Стрептококки, которые не вызывают бета-гемолиза и не принадлежат к группам B и D, идентифицируют по другим физиологическим тестам (табл. 20). Стрептококки группы D выделены в самостоятельный род Enterococcus.

Б. Метод группирования – основан на способности аминопептидазы (фермент, который продуцируют стрептококки серогрупп A и D) гидролизовать пирролидин-нафтиламид. С этой целью выпускают коммерческие наборы необходимых реагентов, предназначенных для определения стрептококков группы А в кровяных и бульонных культурах. Однако специфичность этого метода составляет менее 80 %. Серотипирование стрептококков серогруппы А производят с помощью реакции либо преципитации (определяют М-серотип), либо агглютинации (определяют Т-серотип) только в эпидемиологических целях.

Из числа серологических реакций для обнаружения стрептококков серогрупп A, B, C, D, F и G используют реакции коагглютинации и латекс-агглютинации. Определение титра антигиалуронидазных и анти-О-стрептолизиновых антител используют как вспомогательный метод диагностики ревматизма и для оценки активности ревматического процесса.

Для обнаружения стрептококковых полисахаридных антигенов может быть использован также ИФМ.

ПНЕВМОКОККИ

Особое положение в роде Streptococcus занимает вид S. pneumoniae, играющий очень важную роль в патологии человека. Обнаружен он был Л. Пастером в 1881 г. Его роль в этиологии крупозной пневмонии установили в 1886 г. А. Френкель и А. Вейксельбаум, вследствие чего S. pneumoniae называют пневмококком. Морфология его своеобразна: кокки имеют форму, напоминающую пламя свечи: один ко-

Таблица 20

Дифференциация некоторых категорий стрептококков

Примечание: + – положительный, – негативный, ( – ) – очень редкие признаки, (±) – признак непостоянный; ^b аэрококки – Aerococcus viridans, обнаруживается приблизительно у 1 % больных, страдающих стрептококковыми заболеваниями (остеомиелит, подострый эндокардит, инфекции мочевых путей). Выделены в самостоятельный вид в 1976 г., изучены недостаточно.

нец клетки заострен, другой – уплощен; располагаются обычно парами (плоские концы обращены друг к другу), иногда в виде коротких цепочек (см. цв. вкл., рис. 94б). Жгутиков не имеют, спор не образуют. В организме человека и животных, а также на средах, содержащих кровь или сыворотку, образуют капсулу (см. цв. вкл., рис. 94а). Грамположительны, но в молодых и старых культурах нередко грамотрицательны. Факультативные анаэробы. Температурный оптимум для роста 37 °C, при температуре ниже 28 °C и выше 42 °C не растут. Оптимальная рН для роста 7,2 – 7,6. Пневмококки образуют перекись водорода, но у них нет каталазы, поэтому для роста они требуют добавления субстратов, содержащих этот фермент (кровь, сыворотка). На кровяном агаре мелкие круглые колонии окружены зеленой зоной, образующейся в результате действия экзотоксина гемолизина (пневмолизина). Рост на сахарном бульоне сопровождается помутнением и выпадением небольшого осадка. Помимо О-соматического антигена, пневмококки имеют капсульный полисахаридный антиген, отличающийся большим разнообразием: по полисахаридному антигену пневмококки разделяют на 83 сероварианта, 56 из них разбиты на 19 групп, 27 представлены самостоятельно. От всех остальных стрептококков пневмококки отличаются морфологией, антигенной специфичностью, а также тем, что ферментируют инулин и проявляют высокую чувствительность к оптохину и желчи. Под влиянием желчных кислот у пневмококков активируется внутриклеточная амидаза. Она разрывает связь между аланином и мураминовой кислотой пептидогликана, клеточная стенка разрушается, и наступает лизис пневмококков.

Главным фактором патогенности пневмококков является капсула полисахаридной природы. Бескапсульные пневмококки утрачивают вирулентность.

Пневмококки являются основными возбудителями острых и хронических воспалительных заболеваний легких, которые занимают одно из ведущих мест в заболеваемости, инвалидизации и смертности населения всего мира.

Пневмококки наряду с менингококками являются главными виновниками менингита. Кроме того, они вызывают ползучую язву роговицы, отиты, эндокардиты, перитониты, септицемии и ряд других заболеваний.

Постинфекционный иммунитет типоспецифический, обусловлен появлением антител против типового капсульного полисахарида.

Лабораторная диагностика основана на выделении и идентификации S. pneumoniae. Материалом для исследования служат мокрота и гной. К пневмококкам очень чувствительны белые мыши, поэтому нередко для выделения пневмококков пользуются биологической пробой. У погибших мышей пневмококки обнаруживаются в препарате-мазке из селезенки, печени, лимфатических узлов, а при посеве из этих органов и из крови выделяют чистую культуру. Для определения серотипа пневмококков используют реакцию агглютинации на стекле с типовыми сыворотками или феномен «набухания капсул» (в присутствии гомологичной сыворотки капсула пневмококков резко набухает).

Специфическая профилактика пневмококковых заболеваний осуществляется с помощью вакцин, приготовленных из высокоочищенных капсульных полисахаридов тех 12 – 14 серовариантов, которые чаще всего вызывают заболевания (1, 2, 3, 4, 6A, 7, 8, 9, 12, 14, 18C, 19, 25). Вакцины высокоиммуногенны.

МИКРОБИОЛОГИЯ СКАРЛАТИНЫ

Скарлатина (позднелат. scarlatium – ярко-красный цвет) – острое инфекционное заболевание, которое клинически проявляется ангиной, лимфаденитом, мелкоточечной ярко-красной сыпью на коже и слизистой оболочке с последующим шелушением, а также общей интоксикацией организма и наклонностью к гнойно-септическим и аллергическим осложнениям.

Возбудителями скарлатины являются бета-гемолитические стрептококки группы А, имеющие М-антиген и продуцирующие эритрогенин. Этиологическую роль при скарлатине приписывали разным микроорганизмам – простейшим, анаэробным и другим коккам, стрептококкам, фильтрующимся формам стрептококка, вирусам. Решающий вклад в выяснение истинной причины скарлатины был сделан русскими учеными Г. Н. Габричевским, И. Г. Савченко и американскими учеными супругами Дик (G. F. Dick и G. H. Dick). И. Г. Савченко еще в 1905 – 1906 гг. показал, что скарлатинозный стрептококк вырабатывает токсин, а полученная им антитоксическая сыворотка обладает хорошим лечебным действием. Исходя из работ И. Г. Савченко, супруги Дик в 1923 – 1924 гг. показали, что:

1) введение внутрикожно небольшой дозы токсина лицам, не болевшим скарлатиной, вызывает у них положительную местную токсическую реакцию в виде покраснения и припухлости (реакция Дика);

2) у лиц, переболевших скарлатиной, эта реакция отрицательна (токсин нейтрализуется имеющимся у них антитоксином);

3) введение больших доз токсина подкожно лицам, не болевшим скарлатиной, вызывает у них симптомы, характерные для скарлатины.

Наконец, путем заражения добровольцев культурой стрептококка они смогли воспроизвести скарлатину. В настоящее время стрептококковая этиология скарлатины общепризнана. Своеобразие здесь заключается в том, что скарлатину вызывает не один какой-либо серотип стрептококков, а любой из бета-гемолитических стрептококков, обладающий М-антигеном и продуцирующий эритрогенин. Однако в эпидемиологии скарлатины в разных странах, в разных их регионах и в разное время основную роль играют стрептококки, имеющие разные серотипы М-антигена (1, 2, 4 или другой) и продуцирующие эритрогенины разных серотипов (A, B, C). Возможна смена этих серотипов.

В качестве главных факторов патогенности стрептококков при скарлатине выступают экзотоксин (эритрогенин), гноеродно-септические и аллергенные свойства стрептококка и его эритрогенина. Эритрогенин состоит из двух компонентов – термолабильного белка (собственно токсин) и термостабильной субстанции, обладающей аллергенными свойствами.

Заражение при скарлатине происходит в основном воздушно-капельным путем, однако входными воротами могут быть и любые раневые поверхности. Инкубационный период 3 – 7, иногда 11 дней. В патогенезе скарлатины находят свое отражение 3 основных момента, связанные со свойствами возбудителя:

1) действие скарлатинозного токсина, который обусловливает развитие токсикоза – первый период болезни. Он характеризуется поражением периферических кровеносных сосудов, появлением мелкоточечной сыпи ярко-красного цвета, а также повышением температуры и общей интоксикацией. Развитие иммунитета связано с появлением и накоплением в крови антитоксина;

2) действие самого стрептококка. Оно неспецифично и проявляется в развитии различных гнойно-септических процессов (отиты, лимфадениты, нефриты появляются на 2 – 3-й нед. болезни);

3) сенсибилизация организма. Она находит свое отражение в виде различных осложнений типа нефрозонефритов, полиартритов, сердечно-сосудистых заболеваний и т. п. на 2 – 3-й нед. болезни.

В клинике скарлатины также различают I (токсикоз) и II стадию, когда наблюдаются гнойно-воспалительные и аллергические осложнения. В связи с применением для лечения скарлатины антибиотиков (пенициллин) частота и тяжесть осложнений значительно снизились.

Постинфекционный иммунитет прочный, длительный (повторные заболевания наблюдаются в 2 – 16 % случаев), обусловлен антитоксинами и клетками иммунной памяти. У переболевших сохраняется и аллергическое состояние к скарлатинозному аллергену. Оно выявляется с помощью внутрикожного введения убитых стрептококков. У переболевших на месте введения – покраснение, припухлость, болезненность (проба Аристовского – Фанкони). Для проверки наличия антитоксического иммунитета у детей используют реакцию Дика. С ее помощью установлено, что пассивный иммунитет у детей 1-го года жизни сохраняется в течение первых 3 – 4 мес.

Лабораторная диагностика. В типичных случаях клиническая картина скарлатины так ясна, что бактериологическая диагностика не проводится. В иных случаях она заключается в выделении чистой культуры бета-гемолитического стрептококка, который у всех больных скарлатиной обнаруживается на слизистой оболочке зева. Аэробные грамположительные кокки, отнесенные к родам Aerococcus, Leuconostoc, Pediococcus и Lactococcus, характеризуются слабой патогенностью. Заболевания, которые они вызывают у человека, наблюдаются редко и преимущественно у лиц с нарушениями иммунной системы.

Грамотрицательные кокки

Микробиология гонореи

Гонорея (греч. gonos – семя и rhoe – истечение) – инфекционное заболевание человека, вызываемое гонококком и характеризующееся воспалительным поражением преимущественно слизистых оболочек мочеполовых органов.

Возбудитель – Neisseria gonorrhoeae, открытый в 1879 г. А. Нейссером, представляет собой кокк, имеющий сходство с кофейным зерном или почкой, располагается парами, вогнутые стороны клеток обращены друг к другу. Размеры 0,7 – 0,8, иногда 1,25 – 1,60 мкм. Деление кокков происходит в одной плоскости. При электронно-микроскопическом исследовании вокруг гонококка обнаруживают слизистое капсулоподобное образование толщиной 0,35 – 0,40 мкм, благодаря ему кокки не соприкасаются между собой: между ними сохраняется щель. Гонококки грамотрицательны, они хорошо воспринимают основные анилиновые красители. Для окрашивания препаратов из гонорейного гноя чаще используют метиленовый синий, так как при этом лучше выявляется бобовидная форма гонококков, а для отличия от других сходных диплококков обязательна окраска по Граму. Фагоцитоз гонококков имеет незавершенный характер (см. рис. 60), завершенный фагоцитоз наблюдается в моноцитах и гистиоцитах. Гонококки не имеют жгутиков, капсул, спор и пигмента не образуют. Содержание в ДНК Г + Ц 49,5 – 49,6 мол %. На мясо-пептонном агаре они растут плохо, лучше размножаются на средах, содержащих сыворотку, асцитическую жидкость или кровь. Гемолиза не вызывают. Для роста гонококков необходимо наличие в среде железа. Добавление к плотным питательным средам крахмала, холестерола, альбумина или частичек угля способствует росту, а добавление ионов Ca⁺⁺ повышает жизнеспособность. Оптимальная температура для роста 35 – 36 °C, но рост происходит в диапазоне 30 – 38,5 °C, оптимальная рН 7,2 – 7,6. Гонококки – строгие аэробы, но при первичных посевах лучше вырастают при некотором повышении содержания СО₂.

Д. Келлог [и др.] выявили зависимость между вирулентностью гонококков и характером образуемых ими колоний. Вирулентные для человека гонококки, выделенные от больных острой гонореей, обладают пилями и образуют мелкие, в виде капель, блестящие колонии, обозначаемые как Т₁ и Т₂. Колонии больших размеров, плоские и тусклые (Т₃ и Т₄), образуют невирулентные и не содержащие пилей гонококки. Из углеводов гонококки ферментируют только глюкозу с образованием кислоты без газа. Среди гонококков существуют различные антигенные популяции. Это подтверждается отсутствием у людей иммунитета к повторному заражению. В соответствии с этим предпринимались попытки разработать универсальную серологическую классификацию гонококков. В частности, по белковым антигенам наружной мембраны гонококки распределены на 16 серотипов. Кроме того, гонококки различаются и по своим липополисахаридным антигенам. Обнаружено антигенное родство гонококков с другими видами нейссерий, наиболее близко оно с менингококками. Гонококки синтезируют бактериоцины, которые также могут быть использованы для их типирования. Дифференциальные признаки, отличающие гонококков от других видов рода Neisseria, представлены в табл. 24.

Факторы патогенности. Экзотоксины у гонококков не обнаружены. Основными факторами патогенности являются пили, с помощью которых гонококки осуществляют адгезию и колонизацию эпителиальных клеток слизистой оболочки мочеполовых путей, и освобождающийся при разрушении гонококков эндотоксин (липополисахарид).

Резистентность. Гонококки обладают слабой устойчивостью к внешним воздействиям: они быстро погибают под влиянием прямых солнечных лучей, УФ-света, высушивания, высокой температуры (при 40 °C быстро утрачивают жизнеспособность). Различные химические вещества, как например соли серебра, ртути, и обычные дезинфектанты убивают их в течение короткого времени. Так, нитрат серебра в разведении 1: 5000 убивает гонококки в течение 1 мин, а в разведении 1: 10 000 – через 10 мин.

Таблица 24

Дифференциальные признаки отдельных видов рода Neisseria

Примечание. (+) – признак положительный более чем у 90 % штаммов; d – у некоторых штаммов признак положительный, у некоторых – отрицательный; v – признак непостоянный, у одного штамма может быть иногда положительным, иногда отрицательным; vi – очень важно; i – важно; ( – ) – признак отсутствует.

Эпидемиология, патогенез и клиника гонореи. Для животных гонококк не патогенен. Единственным источником инфекции является человек, инфицированный гонококками. Заражение происходит главным образом половым путем, иногда через предметы обихода. Основным местом обитания гонококков является поверхность слизистой оболочки мочеполовых путей, реже – прямой кишки и глотки. Местом входных ворот у мужчин является слизистая оболочка уретры, у женщин – чаще всего слизистая оболочка преддверия влагалища, уретры и шейки матки. В случае проникновения через эпителиальный барьер гонококки могут распространяться в окружающие ткани: в железы уретры и шейки матки, предстательную железу, семенные пузырьки, матку и фаллопиевы (маточные) трубы, поступать в кровь, проникать в синовиальные оболочки суставов, сердце и другие органы, вызывая воспалительные процессы, а иногда и септицемию. В определенных условиях гонококки могут проникать в конъюнктиву и вызывать офтальмию (воспаление слизистой глаза – бленнорею). Это наблюдается чаще всего у детей, рожденных инфицированными гонококками матерями. Инкубационный период варьирует от одного дня до 2 – 3 нед. и больше, но чаще всего составляет 3 – 4 дня. Клинически различают две основные формы гонореи – острую и хроническую. Типичным симптомом острой гонореи является острое гнойное воспаление уретры, желез нижнего отдела половых органов и шейки матки у женщин, сопровождающееся болевыми ощущениями, а также обильными гнойными выделениями из уретры. Для хронической гонореи типично более вялое проявление клинических симптомов, связанных с местом локализации возбудителя.

Постинфекционный иммунитет. Перенесенное заболевание не оставляет иммунитета к повторному заражению, но это обстоятельство, вероятно, связано с тем, что иммунитет имеет типоспецифический характер, так как в крови переболевших обнаруживают антитела в достаточно высоких титрах.

Методы диагностики: бактериоскопический – материалом для исследования является гнойное отделяемое уретры, влагалища, шейки матки, предстательной железы и других органов, пораженных гонококком, а также осадок и нити мочи. Как правило, мазки окрашивают по Граму и метиленовым синим. Гонококки обнаруживают по трем характерным для них признакам: грамотрицательная окраска, бобовидные диплококки, внутриклеточное расположение (см. рис. 60). Для обнаружения гонококков в мазке применяют также метод прямой и непрямой иммунофлуоресценции. Однако под влиянием химио– и антибиотикотерапии, а также при хронической гонорее морфология и окраска по Граму у гонококков могут изменяться, кроме того, их в мазке может быть очень мало. Нередко при хронической гонорее в мазках обнаруживают гонококки типа Аша: клетки диплококка имеют неодинаковую величину и форму. В таких случаях используют бактериологический метод. С этой целью исследуемый материал засевают на специальные питательные среды. Выделенную культуру идентифицируют с учетом характерных для гонококка признаков (см. табл. 21). Следует учитывать, что если в мазках из гнойного материала гонококки окрашивались по Граму положительно, то в мазках из выросшей культуры у них восстанавливается грамотрицательная окраска. Все гонококки в 24-часовой культуре имеют почти одинаковую величину, форму диплококков или кокков, но через 72 – 96 ч культура становится полиморфной и клетки окрашиваются по Граму неравномерно. При хронической гонорее для диагностики могут быть использованы РСК или аллергическая кожная проба со специальным гонококковым аллергеном.

Лечение гонореи проводят антибиотиками и сульфаниламидными препаратами. Хорошие результаты дает применение различных пенициллинов, тетрациклиновых препаратов и других антибиотиков. Поскольку у гонококков к ним появляется устойчивость, следует определять, к каким антибиотикам выделенные от больного гонококки чувствительны.

Профилактика. Специфическая профилактика не разработана. Общая профилактика такая же, как при других венерических болезнях, поскольку заражение происходит главным образом половым путем. Для предупреждения бленнореи у новорожденных детей им в конъюнктивальный мешок вводят 1 – 2 капли 2 % раствора нитрата серебра или (особенно у недоношенных детей) 2 капли 3 %-ного масляного раствора пенициллина, к которому гонококки очень чувствительны и быстро от него погибают (через 15 – 30 мин).

Грамотрицательные бактерии – наиболее частые возбудители гнойных воспалений

Род Pseudomonas

Род Pseudomonas относится к семейству Pseudomonadaceae (класс Gammaproteobacteria, тип Proteobacteria) и содержит более 20 видов. Одни из них являются естественными обитателями почвы и воды и поэтому играют огромную роль в круговороте веществ в природе. Другие виды играют значительную роль в патологии человека (см. также раздел «Возбудители сапа и мелиоидоза»), животных и растений. Исследования, проведенные в последние 10 – 20 лет, показали, что для человека патогенны не только давно известная и хорошо изученная синегнойная палочка – P. aeruginosa (открыта в 1862 г. А. Люкке, выделена и описана в 1872 г. Дж. Шретером), но и целый ряд других псевдомонад (P. putida, P. fluorescens, P. cepacia и др.).

Для P. aeruginosa характерны следующие признаки: грамотрицательная прямая или слегка изогнутая палочка с закругленными концами, размером 0,5 – 0,7 × 1 – 3 мкм, хорошо окрашивается всеми анилиновыми красителями. В мазках располагается одиночно, парами или короткими цепочками. Обычно подвижна (монотрих или лофотрих). Спор не образует, капсулы не имеет, но продуцирует слизь, которая тонким слоем окружает микробную клетку.

Синегнойная палочка является аэробом и обладает необходимым для дыхания набором ферментов (дегидразы, цитохромы, цитохромоксидаза). Хемоорганотроф, растет в широких интервалах температуры, от 6 до 45 °C, диапазон рН от 4,5 до 9,0. Оптимальная температура роста 37 °C, рН 7,2 – 7,5, но так же хорошо растет и при температуре 42 °C. К питательным средам нетребовательна, хорошо растет на МПА и МПБ. При выращивании в бульоне в течение суток синегнойная палочка образует равномерное помутнение с сероватой пленкой на поверхности и осадком на дне. На МПА через сутки образуются довольно крупные (3 – 5 мм) полупрозрачные колонии сероватого цвета с перламутровым оттенком. Центр колонии более темный, чем периферия, края ровные, четкие. На скошенном агаре культура синегнойной палочки дает тонкий блестящий налет. Культура часто имеет специфический запах жасмина. Характерным свойством ее является появление уже к концу первых суток сине-зеленого окрашивания культуры с последующим проникновением пигмента (пиоцианина) в питательную среду. Псевдомонады других видов могут образовывать пигменты иного цвета, например: P. fluorescens и P. putida (впрочем, как и сама синегнойная палочка) образуют желтый пигмент, который флуоресцирует с зеленоватым оттенком; некоторые штаммы образуют красный (пиорубин) или коричнево-черный (пиомеланин) пигмент.

Синегнойная палочка обладает слабой сахаролитической активностью: она обычно расщепляет только глюкозу с образованием кислоты без газа. Более выражена протеолитическая активность: разжижает желатин и свернутую кровяную сыворотку, гидролизует казеин. Свертывает лакмусовое молоко и затем расщепляет сгусток. Восстанавливает нитраты в нитриты и далее до азота. Не образует индола иH₂S, дает отрицательную реакцию Фогеса – Проскауэра. Проба на оксидазу положительная. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 67 мол %.

Другие патогенные для человека виды псевдомонад отличаются от синегнойной палочки и друг от друга по следующим биохимическим свойствам: флуоресценции в УФ-свете, наличию аргининдигидролазы, желатиназы, амилазы, лизиндекарбоксилазы, способности расти при температуре 42 °C, образованию сероводорода и другим тестам (табл. 25).

Таблица 25

Биохимические отличия некоторых видов и биоваров рода Pseudomonas

Примечание. (+) – положительный признак; ( – ) – отрицательный признак; (±) – непостоянный признак; (?) – неизвестно.

Синегнойная палочка имеет соматический О-антиген, по которому были предприняты попытки делить ее на серогруппы, и жгутиковый Н-антиген. У штаммов, продуцирующих слизь и имеющих капсулоподобную оболочку, имеется М-антиген. Факторы патогенности. Одним из главных факторов патогенности синегнойной палочки и других псевдомонад является О-антиген – липополисахарид клеточной стенки, механизм действия которого такой же, как у других грамотрицательных бактерий. Помимо этого, псевдомонады могут продуцировать различные экзотоксины: гемотоксин, лейкоцидин, гистотоксины, энтеротоксин. Синтез их часто контролируется плазмидами широкого круга хозяев, которые псевдомонады могут приобретать при обмене генетическим материалом с бактериями других родов и семейств.

Важнейший из всех экзотоксинов – экзотоксин А, по молекулярной структуре и механизму действия весьма схожий с дифтерийным экзотоксином: это белок, состоящий из двух субъединиц примерно с такой же молекулярной массой, как у дифтерийного токсина, чувствителен к трипсину, повышенной температуре, кислой рН среды. В основе летального действия экзотоксина А также лежит специфическая инактивация белкового фактора элонгации EF-2, приводящая к нарушению биосинтеза белка на рибосомах. Существуют и другие типы токсинов, синтезируемых синегнойной палочкой, которые иммунологически отличны от экзотоксина А. К таким токсинам можно отнести экзофермент S, который, в отличие от экзотоксина А, рибозилирует не EF-2, а другие белки, в частности EF-1.

Синегнойная палочка продуцирует ряд ферментов, усиливающих ее патогенные свойства: коллагеназу, разрушающую строму соединительной ткани и способствующую распространению возбудителя; протеазы, некоторые из них блокируют систему комплемента; лецитиназу, нейраминидазу и др.

Эпидемиология. Псевдомонады широко распространены в природе: встречаются в почве, воде, воздухе, постоянно обитают в кишечнике человека и животных, обнаруживаются на коже и слизистых оболочках.

Синегнойная палочка устойчива к ультрафиолетовому облучению, а также антисептикам, традиционно применяемым в хирургии (фурацилин, риванол и др.). В пыли больничных палат сохраняется 2 нед., в кусочках ожоговых корочек – до 8 нед. При температуре 60 °C погибает в течение 15 мин, при 55 °C – в течение 1 ч. Быстро гибнет под действием 2 % раствора фенола.

Заражение происходит либо извне (например, инфицирование раны), когда псевдомонада попадает с почвой, водой, воздухом, нестерильным инструментарием, перевязочным материалом, пищей; либо при активации эндогенной микрофлоры, составной частью которой может быть псевдомонада, т. е. как проявление дисбактериоза. В последнем случае заболевание чаще наблюдается у детей, пожилых лиц и людей со сниженной по разным причинам общей резистентностью.

Патогенез и клиника. Синегнойная палочка может вызывать у человека самые различные заболевания: сепсис, менингит, остеомиелит, артрит, отит, пневмонию, плеврит, абсцессы печени, мозга, воспаления мочеполового тракта и др. Огромную роль играет она также в гнойно-воспалительных осложнениях операционных ран и ожогов, которые сводят на нет лечение и приводят нередко к летальному исходу. Немаловажное значение синегнойная палочка имеет как возбудитель пищевых токсикоинфекций. Заболевания, вызванные ею, протекают довольно тяжело; отмечается чрезвычайная устойчивость к лечению. Это связано, с одной стороны, с разнообразием факторов патогенности, с другой стороны – с наличием R-плазмид, определяющих устойчивость к 6 – 10 и более антибиотикам одновременно. Нередко заболевание протекает вяло, не поддается лечению, приобретает хронический характер (уретрит, цистит, плеврит, остеомиелит и т. д.).

Лабораторная диагностика. Единственным эффективным методом диагностики является бактериологический. Материал для посева может быть различным, но чаще всего это гной, экссудат, пунктаты из органов, моча. Большую роль в идентификации культуры играет обнаружение пигмента пиоцианина, присутствие которого в жидкой культуре определяют добавлением в среду нескольких капель хлороформа: наблюдается сине-зеленое окрашивание. Видовая идентификация в пределах рода Pseudomonas ведется по биохимическим и культуральным свойствам.

Лечение и специфическая профилактика. Лечение антибиотиками должно назначаться только после изучения чувствительности штамма-возбудителя к химиопрепаратам. При пищевых токсикоинфекциях и дисбактериозах кишечника, вызванных синегнойной палочкой, весьма эффективен комплексный интести-бактериофаг, в состав которого входит псевдомонадный фаг. При хронических вялотекущих процессах, вызванных синегнойной палочкой, особенно в случае безуспешности проводимого лечения, весьма эффективным может оказаться использование аутовакцины.

Плановая специфическая профилактика не проводится. Общая профилактика сводится к недопущению попадания возбудителя в раны, на ожоговую поверхность, т. е. к правильной организации работы в отделениях и строжайшему соблюдению санитарно-гигиенических норм.

Род Klebsiella

Род Klebsiella относится к семейству Enterobacteriaceae. В отличие от подавляющего большинства родов этого семейства, бактерии рода Klebsiella обладают способностью образовывать капсулу. К роду Klebsiella относится несколько видов. Основную роль в патологии человека из них играет вид Klebsiella pneumoniae, которая подразделяется на три подвида: K. pneumoniae subsp. pneumoniae, K. pneumoniae subsp. ozaenae и K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis. Однако за последние годы выявлены новые виды клебсиелл (K. oxytoca, K. mobilis, K. planticola, K. terrigena), которые пока мало изучены и роль их в патологии человека уточняется. Название рода дано в честь немецкого бактериолога Э. Клебса. Клебсиеллы постоянно обнаруживают на коже и слизистых оболочках человека и животных. K. pneumoniae – частый возбудитель внутрибольничных инфекций, в том числе смешанных.

Клебсиеллы – грамотрицательные эллипсоидные бактерии, имеют форму толстых коротких палочек с закругленными концами, размером 0,3 – 0,6 × 1,5 – 6,0 мкм, капсульная форма имеет размеры 3 – 5 × 5 – 8 мкм. Размеры подвержены сильным колебаниям, особенно у клебсиелл пневмонии. Жгутики отсутствуют, бактерии спор не образуют, у части штаммов имеются реснички. Обычно видна толстая полисахаридная капсула; бескапсульные формы могут быть получены при воздействии на бактерии низкой температуры, сыворотки, желчи, фагов, антибиотиков и при мутациях. Расположены попарно или поодиночке.

Клебсиеллы хорошо растут на простых питательных средах, факультативные анаэробы, хемоорганотрофы. Оптимальная температура роста 35 – 37 °C, рН 7,2 – 7,4, но могут расти при 12 – 41 °C. Способны расти на среде Симмонса, т. е. использовать цитрат натрия в качестве единственного источника углерода (кроме K. rhinoscleromatis). На плотных питательных средах образуют мутные слизистые колонии, причем в молодых 2 – 4-часовых колониях бактерии озены располагаются рассеянно-концентрическими рядами, риносклеромы – концентрическими, пневмонии – петлеобразно, что легко определяется при микроскопии колонии с малым увеличением и может быть использовано для их дифференциации. При росте в МПБ клебсиеллы вызывают равномерное помутнение, иногда со слизистой пленкой на поверхности; на полужидких средах рост более обилен в верхней части среды.

Содержание в ДНК Г + Ц – 52 – 56 мол %.

Клебсиеллы ферментируют углеводы с образованием кислоты или кислоты и газа, восстанавливают нитраты в нитриты. Желатин не разжижают, индола и сероводорода не образуют. Обладают уреазной активностью, не всегда створаживают молоко. Менее всего биохимическая активность выражена у возбудителя риносклеромы (табл. 26).

Таблица 26

Биохимические признаки клебсиелл

Примечание. (+) – признак положительный; ( – ) – признак отсутствует; d – признак непостоянный.

Антигены. У клебсиелл имеются О– и К-антигены. По О-антигену клебсиеллы подразделяют на 11 серотипов, а по капсульному К-антигену – на 82. Серологическое типирование клебсиелл основано на определении К-антигенов. Группоспецифический антиген обнаружен почти у всех штаммов клебсиелл. Некоторые К-антигены родственны К-антигенам стрептококков, эшерихий и сальмонелл. Обнаружены О-антигены, родственные О-антигенам E. coli.

Основными факторами патогенности клебсиелл являются К-антиген, подавляющий фагоцитоз, и эндотоксин. Помимо них, K. pneumoniae может продуцировать термолабильный энтеротоксин – белок, по механизму действия подобный токсину энтеротоксигенной кишечной палочки. Клебсиеллы обладают выраженными адгезивными свойствами.

Эпидемиология. Клебсиеллез является чаще всего внутрибольничной инфекцией. Источником служит больной человек и бактерионоситель. Возможно как экзогенное, так и эндогенное заражение. Наиболее частые пути передачи – пищевой, воздушно-капельный и контактно-бытовой. Факторами передачи чаще всего являются пищевые продукты (особенно мясные и молочные), вода, воздух. В последние годы частота клебсиеллезов возросла, одна из причин этого – повышение патогенности возбудителя в связи со снижением резистентности организма человека. Этому способствует также широкое использование антибиотиков, изменяющих нормальное соотношение микроорганизмов в естественном биоценозе, иммунодепрессантов и т. д. Следует отметить высокую степень резистентности клебсиелл к различным антибиотикам.

Клебсиеллы чувствительны к действию различных дезинфицирующих веществ, при температуре 65 °C погибают в течение 1 ч. Довольно устойчивы во внешней среде: слизистая капсула предохраняет возбудителя от высыхания, поэтому клебсиеллы могут сохраняться в почве, пыли палат, на оборудовании, мебели при комнатной температуре неделями и даже месяцами.

Патогенез и клиника. K. pneumoniae чаще всего вызывают заболевание, протекающее по типу кишечной инфекции и характеризующееся острым началом, тошнотой, рвотой, болями в животе, диареей, лихорадкой и общей слабостью. Продолжительность болезни – 1 – 5 дней. Клебсиеллы могут вызывать поражение органов дыхания, суставов, мозговых оболочек, конъюнктивы, мочеполовых органов, а также сепсис и гнойные послеоперационные осложнения. Наибольшей тяжестью отличается генерализованное септико-пиемическое течение болезни, приводящее нередко к летальному исходу.

K. ozaenae поражает слизистую оболочку носа и его придаточных пазух, вызывает их атрофию, воспаление сопровождается выделением вязкого зловонного секрета. K. rhinoscleromatis поражает не только слизистую оболочку носа, но и трахею, бронхи, глотку, гортань, при этом в пораженной ткани развиваются специфические гранулемы с последующим склерозированием и развитием хрящевидных инфильтратов. Течение заболевания хроническое, смерть может наступить на фоне обтурации трахеи или гортани.

Постинфекционный иммунитет непрочный, носит в основном клеточный характер. При хроническом заболевании иногда развиваются признаки ГЧЗ.

Лабораторная диагностика. Основным методом диагностики является бактериологический. Материал для посева может быть различным: гной, кровь, ликвор, испражнения, смывы с предметов и др. Его сеют на дифференциально-диагностическую среду К-2 (с мочевиной, рафинозой, бромтимоловым синим), через сутки вырастают крупные блестящие слизистые колонии с окраской от желтой или зеленожелтой до голубой. Далее у бактерий определяют подвижность посевом в среду Пешкова и наличие орнитиндекарбоксилазы. Эти признаки не свойственны клебсиеллам. Окончательная идентификация заключается в изучении биохимических свойств и определении серогруппы с помощью реакции агглютинации живой культуры с К-сыворотками. Выделенная чистая культура проверяется на чувствительность к антибиотикам.

Иногда для диагностики клебсиеллезов может быть использована реакция агглютинации или РСК со стандартным О-клебсиеллезным антигеном или с аутоштаммом.

Диагностическое значение имеет четырехкратное нарастание титров антител.

Профилактика и лечение. Специфическая профилактика не разработана. Общая профилактика сводится к строгому соблюдению санитарно-гигиенических норм при хранении пищевых продуктов, строгому соблюдению асептики и антисептики в лечебных учреждениях, а также соблюдению правил личной гигиены.

Лечение клебсиеллезов по клиническим показаниям проводится в условиях стационара. При поражении кишечника антибиотики не показаны. При явлениях обезвоживания (наличие у возбудителя энтеротоксина) перорально или парентерально вводят солевые растворы. При генерализованных и вялотекущих хронических формах применяют антибиотики (в соответствии с результатами проверки на чувствительность к ним), аутовакцины; проводят мероприятия, стимулирующие иммунитет (аутогемотерапия, пирогенотерапия и т. д.).

Род Proteus

Род Proteus относится к семейству Enterobacteriaceae и включает в себя три вида. Важную роль в патологии человека, особенно в качестве возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний и пищевых токсикоинфекций, играют два вида: P. vulgaris и P. mirabilis.

Все представители рода Proteus – грамотрицательные палочки с закругленными концами, размером 0,4 – 0,6 × 1 – 3 мкм, спор и капсул не образуют, являются перитрихами. Склонны к полиморфизму, наблюдаются кокковидные и нитевидные формы. Иногда встречаются и неподвижные варианты, лишенные жгутиков (О-форма).

Факультативные анаэробы, хемоорганотрофы. Температурный оптимум 37 °C, рН 7,2 – 7,4; температурные пределы роста от 20 до 38 °C. К питательным средам нетребовательны, хорошо растут на простых средах. Н-форма (жгутиковая) протея дает на МПА характерный ползучий рост в виде нежной вуали голубовато-дымчатого цвета (феномен роения). Ползучим ростом протея пользуются для выделения чистой культуры при посеве по методу Шукевича (посев производят в конденсационную влагу свежескошенного МПА, культура протея постепенно поднимается в виде вуали вверх по поверхности среды). О-форма протея дает на МПА крупные с ровными краями колонии. На МПБ отмечается диффузное помутнение среды с густым белым осадком на дне и нежной пленкой на поверхности. О-форма протея растет на определенных питательных средах, содержащих желчные кислоты (среда Плоскирева); 0,1 – 0,2 % карболовой кислоты; 5 – 6 % этанола, красители, борную кислоту, детергенты. На среде Плоскирева протей дает прозрачные, нежные, блестящие колонии с характерным запахом, слегка щелочащие среду, которая окрашивается вокруг них в желтоватый цвет. С возрастом колонии мутнеют, их центр принимает бурую окраску. Колонии протея в О-форме мало отличаются от колоний сальмонелл, что затрудняет их идентификацию. В качестве сред обогащения используют среды Кауфмана, Мюллера, 5 %-ный желчный бульон.

Представители рода Proteus ферментируют глюкозу с образованием кислоты и небольшого количества газа, не ферментируют лактозу и маннит, устойчивы к цианиду, образуют уреазу и фенилаланиндезаминазу. Виды дифференцируют по дополнительным биохимическим тестам (табл. 27).

Как и у других жгутиковых представителей семейства энтеробактерий, у протея различают термостабильный соматический О-антиген (49 серотипов) и жгутиковый термолабильный Н-антиген (19 серотипов). Следует отметить родство соматического антигена протея с антигенами риккетсий (штаммы протея серии ОХ). По антигенным свойствам P. vulgaris и P. mirabilis подразделяют на 110 серотипов.

Таблица 27

Биохимические признаки протеев

Примечание. (+) – признак положительный; ( – ) – признак отсутствует;

d – признак непостоянный.

ЛПС клеточной стенки протея является важнейшим фактором патогенности, выполняющим роль эндотоксина.

Эпидемиология. Протеи обычно являются сапрофитами гниющих отбросов, в небольших количествах присутствуют в кишечнике животных и человека, обнаруживаются в сточных водах и почве. Чаще всего заражение происходит алиментарным путем, когда в организм человека с пищей попадает большое количество протея. Нередко протей может выступать как возбудитель дисбактериоза (эндогенная инфекция) или как типичный возбудитель госпитальной инфекции.

Протей сравнительно устойчив во внешней среде, хорошо переносит замораживание. При температуре 60 °C погибает в течение 1 ч, при 80 °C – в течение 5 мин, в 1 %-ном растворе фенола гибнет через 30 мин. Может быть устойчив одновременно ко многим антибиотикам и дезинфицирующим веществам.

Патогенез и клиника. Протей может вызывать у человека различные заболевания, чаще протекающие по типу пищевой токсикоинфекции. В ассоциации с другими условно-патогенными микроорганизмами протей вызывает различные формы гнойно-воспалительных и септических заболеваний: цистит, пиелит, гнойные осложнения ран и ожоговых поверхностей, флегмоны, абсцессы, плеврит, пневмонию, остеомиелит, менингит, сепсис. Патогенез пищевой токсикоинфекции связан с массовым разрушением протея в желудочно-кишечном тракте и всасыванием в кровь освобождающегося при этом эндотоксина. Степень тяжести заболевания находится в прямой зависимости от количества попавшего в организм протея.

Лабораторная диагностика. Используется бактериологический метод. Материалом для посева являются гной, моча, рвотные массы, промывные воды, кровь, ликвор, мокрота, плевральный экссудат, которые засевают на дифференциально-диагностические среды (среда Плоскирева), среды обогащения и МПА по методу Шукевича. Выделенная чистая культура идентифицируется по биохимическим свойствам, серовар определяют в реакции агглютинации живой и гретой культуры с поливалентными и монорецепторными О– и Н-сыворотками. Можно также определять нарастание титров О– и Н-антител в реакции агглютинации с аутоштаммами.

Лечение. При пищевой токсикоинфекции, вызванной протеем, проводят неспецифическое лечение, направленное на дезинтоксикацию (промывание желудка, обильное питье и т. д.). В случае заболевания, сопровождающегося нагноением или сепсисом, используют антибиотики с учетом результатов антибиотикограммы. При колите, связанном с дисбактериозом кишечника, когда протей присутствует в больших количествах, целесообразно пероральное использование интестибактериофага, в состав которого входит протейный фаг, а также протейного или колипротейного бактериофага. Последние препараты эффективны и при местных воспалительных процессах (гнойные осложнения ран, мочеполовых органов), когда они назначаются в виде примочек, орошений, тампонирования, обкалывания. При вялотекущих воспалительных процессах, трудно поддающихся антибиотикотерапии, целесообразно применение аутовакцины.

Специфическая профилактика не разработана.

К категории особо опасных инфекций бактериальной природы относятся чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва, сап и холера. Первые пять болезней – зооантропонозы, а холерой болеют только люди. Эти болезни относятся к особо опасным потому, что их возбудители:

1) обладают высокой заразительностью (к чуме, туляремии, бруцеллезу восприимчивы все люди);

2) способны вызывать не только эпидемии, но и пандемии (чума, холера);

3) вызывают тяжело протекающие заболевания.

Микробиология чумы

Чума (pestis) – острое инфекционное заболевание, протекающее по типу геморрагической септицемии. В прошлом чума была грозным бичом для человечества. Известны три пандемии чумы, которые унесли миллионы человеческих жизней.

Первая пандемия была в VI в. н. э. От нее погибло с 531 по 580 г. около 100 млн человек – половина населения Восточной Римской империи («юстинианова» чума). Вторая пандемия разразилась в XIV веке. Она началась в Китае и поразила многие страны Азии и Европы. В Азии от нее погибло 40 млн человек, а в Европе из 100 млн человек погибло 25 млн. Вот как описывает эту пандемию Н. М. Карамзин в «Истории государства Российского»: «Болезнь обнаруживалась железами в мягких впадинах тела, человек харкал кровью и на второй или третий день умирал. Нельзя, говорят летописцы, вообразить зрелища более ужасного… От Пекина до берегов Евфрата и Ладоги недра земли наполнились миллионами трупов, и государства опустели… В Глухове и Белозерске не осталось ни одного жителя… Сия жестокая язва несколько раз приходила и возвращалась. В Смоленске она свирепствовала 3 раза, наконец, в 1387 г. осталось в нем только 5 человек, которые, по словам летописи, вышли и затворили город, наполненный трупами». Третья пандемия чумы началась в 1894 г. и закончилась в 1938 г., унеся 13 – 15 млн человеческих жизней.

Возбудитель чумы был открыт в 1894 г. французским ученым А. Иерсеном, в честь которого и получил название Yersinia pestis. Род Yersiniа относится к семейству Enterobacteriaceae и включает 11 видов, из них патогенными для человека являются три: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica; патогенность остальных пока еще не ясна.

Y. pestis имеет длину 1 – 2 мкм и толщину 0,3 – 0,7 мкм. В мазках из организма больного и из трупов погибших от чумы людей и грызунов выглядит как короткая овоидная (яйцевидная) палочка с биполярной окраской. В мазках из бульонной культуры палочка располагается цепочкой, в мазках из агаровых культур – беспорядочно (см. цв. вкл., рис. 95). Биполярная окраска в том и другом случае сохраняется, но в мазках из агаровых культур несколько слабее. Возбудитель чумы по Граму окрашивается отрицательно, лучше красится щелочными и карболовыми красителями (синькой Леффлера), спор не образует, жгутиков не имеет. Содержание Г + Ц в ДНК – 45,8 – 46,0 мол % (для всего рода). При температуре 37 °C образует нежную капсулу белковой природы, которая выявляется на влажных и слегка кислых питательных средах. Y. pestis – аэроб, дает хороший рост на обычных питательных средах. Оптимальная для роста температура 27 – 28 °C (диапазон – от 0 до 45 °C), рН = 6,9 – 7,1. Палочка чумы дает характерный рост на жидких и плотных питательных средах: на бульоне он проявляется образованием рыхлой пленки, от которой спускаются нити в виде сосулек, напоминающих сталактиты, на дне – рыхлый осадок, бульон остается прозрачным. Развитие колоний на плотных средах проходит через три стадии: через 10 – 12 ч под микроскопом рост в виде бесцветных пластинок (стадия «битого стекла»); через 18 – 24 ч – стадия «кружевных платочков», при микроскопировании заметна светлая кружевная зона, расположенная вокруг выступающей центральной части, желтоватой или слегка буроватой окраски. Через 40 – 48 ч наступает стадия «взрослой колонии» – буровато-очерченный центр с выраженной периферической зоной (см. цв. вкл., рис. 95.3). Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica стадии «битого стекла» не имеют. На средах с кровью колонии Y. pestis зернистые со слабо выраженной периферической зоной. С целью быстрейшего получения характерного для Y. pestis роста на средах к ним рекомендуется добавлять стимуляторы роста: сульфит натрия, кровь (или ее препараты) или лизат культуры сарцины. Палочке чумы свойствен выраженный полиморфизм, особенно на средах с повышенной концентрацией NaCl, в старых культурах, в органах разложившихся чумных трупов (см. цв. вкл., рис. 95.2). Чумная палочка не имеет оксидазы, не образует индола и H₂S, обладает каталазной активностью и ферментирует глюкозу, мальтозу, галактозу, маннит с образованием кислоты без газа.

Резистентность. В мокроте палочка чумы может сохраняться до 10 дней; на белье и одежде, испачканных выделениями больного, сохраняется неделями (белок и слизь охраняют ее от губительного действия высыхания). В трупах людей и животных, погибших от чумы, выживает с начала осени до зимы; низкая температура, замораживание и оттаивание не убивают ее. Солнце, высыхание, высокая температура губительны для Y. pestis. Нагревание до 60 °C убивает через 1 ч, при температуре 100 °C погибает через несколько минут; 70° спирт, 5 % раствор фенола, 5 % раствор лизола и некоторые другие химические дезинфектанты убивают за 5 – 10 – 20 мин.

Антигенный состав. У Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica обнаружено до 18 сходных соматических антигенов. Для Y. pestis характерно наличие капсульного антигена (фракция I), антигенов T, V – W, белков плазмокоагулазы, фибринолизина, белков наружной мембраны и pH6-антигена. Однако в отличие от Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, Y. pestis в антигенном отношении более однородна;

серологической классификации этого вида нет.

Факторы патогенности. Y. pestis является самой патогенной и агрессивной среди бактерий, поэтому и вызывает наиболее тяжелое заболевание. У всех чувствительных к нему животных и у человека возбудитель чумы подавляет защитную функцию фагоцитарной системы. Он проникает в фагоциты, подавляет в них «окислительный взрыв» и беспрепятственно размножается. Неспособность фагоцитов осуществить свою киллерную функцию в отношении Y. pestis – основная причина восприимчивости к чуме. Высокая инвазивность, агрессивность, токсигенность, токсичность, аллергенность и способность подавлять фагоцитоз обусловлены наличием у Y. pestis целого арсенала факторов патогенности, которые перечислены ниже.

1. Способность клеток сорбировать экзогенные красители и гемин. Она связана с функцией системы транспорта железа и обеспечивает Y. pestis возможность размножаться в тканях организма.

2. Зависимость роста при температуре 37 °C от наличия в среде ионов Ca²⁺.

3. Синтез V – W-антигенов. Антиген W расположен в наружной мембране, а V – в цитоплазме. Эти антигены обеспечивают размножение Y. pestis внутри макрофагов. 4. Синтез «мышиного» токсина. Токсин блокирует процесс переноса электронов в митохондриях сердца и печени чувствительных животных, поражает тромбоциты и сосуды (тромбоцитопения) и нарушает их функции.

5. Синтез капсулы (фракции I – FraI). Капсула угнетает активность макрофагов.

6. Синтез пестицина – видовой признак Y. pestis.

7. Синтез фибринолизина.

8. Синтез плазмокоагулазы. Оба эти белка локализованы в наружной мембране и обеспечивают высокие инвазивные свойства Y. pestis.

9. Синтез эндогенных пуринов.

10. Синтез термоиндуцибельных белков наружной мембраны – Yop-белков (англ. Yersinia outer proteins). Белки YopA, YopD, YopE, YopH, YopK, YopM, YopN подавляют активность фагоцитов.

11. Синтез нейраминидазы. Она способствует адгезии (высвобождает рецепторы для Y. pestis).

12. Синтез аденилатциклазы. Предполагается, что она подавляет «окислительный взрыв», т. е. блокирует киллерное действие макрофагов.

13. Синтез пилей адгезии. Они угнетают фагоцитоз и обеспечивают внедрение Y. pestis, как внутриклеточного паразита, в макрофаги.

14. Синтез аминопептидаз широкого спектра действия.

15. Эндотоксин (ЛПС) и другие компоненты клеточной стенки, обладающие токсическим и аллергенным действием.

16. pH6-антиген. Он синтезируется при температуре 37 °C и низкой рН, подавляет фагоцитоз и обладает цитотоксическим действием на макрофаги.

Значительная часть факторов патогенности Y. pestis контролируется генами, носителями которых являются следующие 3 класса плазмид, обнаруживаемых обычно вместе у всех патогенных штаммов:

1) рYP (9,5 т. п. н.) – плазмида патогенности. Несет 3 гена:

pst – кодирует синтез пестицина;

pim – определяет иммунитет к пестицину;

pla – определяет фибринолитическую (активатор плазминогена) и плазмокоагулазную активность.

2) рYТ (65 МД) – плазмида токсигенности. Несет гены, определяющие синтез «мышиного» токсина (сложный белок, состоящий из двух фрагментов А и В, с м. м. 240 и 120 кД соответственно), и гены, контролирующие белковый и липопротеиновый компоненты капсулы. Третий ее компонент контролирует гены хромосомы. Ранее плазмида имела название pFra.

3) pYV (110 т. п. н.) – плазмида вирулентности. Она определяет зависимость роста Y. pestis при 37 °C от присутствия в среде ионов Ca²⁺, поэтому имеет другое название – Lcr-плазмида (англ. low calcium response). Гены этой, особенно важной, плазмиды кодируют также синтез антигенов V и W и термоиндуцируемых белков Yop. Их синтез осуществляется под сложным генетическим контролем при температуре 37 °C и в отсутствие в среде Ca²⁺. Все типы Yop-белков, кроме YopM и YopN, гидролизуются за счет активности активатора плазминогена (ген pla плазмиды pYP). Белки Yop во многом определяют вирулентность Y. pestis. YopE-белок обладает антифагоцитарным и цитотоксическим действием. YopD обеспечивает проникновение YopE в клетку-мишень; YopH обладает антифагоцитарной и протеин-тирозин-фосфатазной активностью; белок YopN – свойствами кальциевого сенсора; YopM связывается с α-тромбином крови человека.

Эпидемиология. Круг теплокровных носителей чумного микроба чрезвычайно обширен и включает более 200 видов 8 отрядов млекопитающих. Основным же источником чумы в природе являются грызуны и зайцеобразные. Естественная зараженность установлена у более чем 180 их видов, свыше 40 из них входят в состав фауны России и сопредельных территорий (в пределах бывшего СССР). Из 60 видов блох, для которых в экспериментальных условиях установлена возможность переноса возбудителя чумы, на этой территории обитают 36.

Чумной микроб размножается в просвете пищеварительной трубки блох. В ее переднем отделе образуется пробка («чумной блок»), содержащая большое количество микробов. При укусе млекопитающих c обратным током крови в ранку с пробки смывается часть микробов, что и ведет к заражению. Кроме того, выделяемые блохой при питании экскременты при попадании в ранку также могут вызывать заражение.

Основные (главные) носители Y. pestis на территории России и Средней Азии – суслики, песчанки и сурки, в некоторых очагах также пищухи и полевки. С ними связано существование следующих очагов чумы:

1) 5 очагов, в которых основным носителем чумного микроба выступает малый суслик (Северо-Западный Прикаспий; Терско-Сунженское междуречье; Приэльбрусский очаг; Волго-Уральский и Зауральский полупустынные очаги).

2) 5 очагов, в которых носители – суслики и сурки (на Алтае – пищухи): Забайкальский, Горно-Алтайский, Тувинский и высокогорные Тянь-Шанский и ПамироАлайский очаги.

3) Волго-Уральский, Закавказский и Среднеазиатский пустынные очаги, где основные носители – песчанки.

4) Высокогорные Закавказский и Гиссарский очаги с основными носителями – полевками.

Разные классификации Y. pestis основываются на разных группах признаков – биохимических особенностях (глицерин-позитивные и глицерин-негативные варианты), области распространения (океанические и континентальные варианты), видах основных носителей (крысиный и сусликовый варианты). По одной из наиболее распространенных классификаций, предложенной в 1951 г. французским исследователем чумы Р. Девинья (R. Devignat), в зависимости от географического распространения возбудителя и его биохимических свойств различают три внутривидовые формы (биовара) Y. pestis (табл. 28).

По классификации отечественных ученых (Саратов, 1985), вид Y. pestis разделен на 5 подвидов: Y. pestis subsp. pestis (основной подвид; он включает все три биовара классификации Р. Девинья), Y. pestis subsp. altaica (алтайский подвид), Y. pestis subsp. caucasica (кавказский подвид), Y. pestis subsp. hissarica (гиссарский подвид) и Y. pestis subsp. ulegеica (улэгейский подвид).

Заражение человека происходит через укус блох, при прямом контакте с заразным материалом, воздушно-капельным, редко алиментарным путем (например, при употреблении мяса верблюдов, больных чумой). В 1998 – 1999 гг. чумой в мире переболело 30 534 человека, из них 2 234 умерли.

Дифференциальные признаки биоваров Y. pestis

Таблица 28

Примечание. (+) – признак положительный; ( – ) – признак отсутствует.

Патогенез и клиника. В зависимости от способа заражения различают бубонную, легочную, кишечную форму чумы; редко септическую и кожную (гнойные пузырьки на месте укуса блохи). Инкубационный период при чуме варьирует от нескольких часов до 9 сут. (у лиц, подвергнутых серопрофилактике, до 12 сут.). Возбудитель проникает через мельчайшие повреждения кожи (укус блохи), иногда через слизистую оболочку или воздушно-капельным путем, достигает регионарных лимфатических узлов, в которых начинает бурно размножаться. Болезнь начинается внезапно: сильная головная боль, высокая температура с ознобом, лицо гиперемировано, затем оно темнеет, под глазами темные круги («черная смерть»). Бубон (увеличенный воспаленный лимфатический узел) появляется на второй день. Иногда болезнь развивается столь стремительно, что больной погибает раньше, чем появится бубон. Особенно тяжело протекает легочная чума. Она может возникнуть и как результат осложнения бубонной чумы, и при заражении воздушно-капельным путем. Болезнь развивается также очень бурно: озноб, высокая температура и уже в первые часы присоединяются боли в боку, кашель, вначале сухой, а потом с мокротой кровянистого характера; появляется бред, цианоз, коллапс, и наступает смерть. Больной легочной чумой представляет исключительную опасность для окружающих, так как выделяет с мокротой огромное количество возбудителя. В развитии болезни основную роль играет подавление активности фагоцитов: нейтрофильных лейкоцитов и макрофагов. Ничем не сдерживаемое размножение и распространение возбудителя через кровь по всему организму полностью подавляет иммунную систему и приводит (при отсутствии эффективного лечения) к гибели больного.

Постинфекционный иммунитет прочный, пожизненный. Повторные заболевания наблюдаются крайне редко. Природа иммунитета клеточная. Хотя антитела появляются и играют определенную роль в приобретенном иммунитете, он опосредуется главным образом Т-лимфоцитами и макрофагами. У лиц, переболевших чумой или вакцинированных, фагоцитоз имеет завершенный характер. Он и обусловливает приобретенный иммунитет.

Лабораторная диагностика. Используются бактериоскопический, бактериологический, серологический и биологический методы, а также аллергическая проба с пестином (для ретроспективной диагностики). Материалом для исследования служат: пунктат из бубона (или его отделяемое), мокрота, кровь, при кишечной форме – испражнения. Y. pestis идентифицируют на основании морфологии, культуральных, биохимических признаков, пробы с чумным фагом и с помощью биологической пробы. Простым и надежным методом определения антигенов чумной палочки в исследуемом материале является применение РПГА, особенно с использованием эритроцитарного диагностикума, сенсибилизированного моноклональными антителами к капсульному антигену, и ИФМ. Эти же реакции могут быть использованы для обнаружения антител в сыворотке больных.

Биологический метод диагностики заключается в заражении исследуемым материалом (когда он очень загрязнен сопутствующей микрофлорой) морской свинки накожно, подкожно или, реже, внутрибрюшинно.

При работе с материалом, содержащим возбудителя чумы, требуется соблюдение строгого режима, поэтому все исследования проводятся только хорошо обученным персоналом в специальных противочумных учреждениях.

Профилактика. Постоянный контроль за природными очагами чумы и организация мероприятий по предупреждению заболеваний людей в стране осуществляется специальной противочумной службой. Она включает в себя пять противочумных институтов и десятки противочумных станций и отделений.

Несмотря на наличие природных очагов, с 1930 г. на территории России в них не было ни одного случая заболевания людей чумой. Для специфической профилактики чумы используется живая ослабленная вакцина из штамма EV. Она вводится накожно, внутрикожно или подкожно. Кроме того, предложена сухая таблетированная вакцина для перорального применения. Поствакцинальный иммунитет формируется к 5 – 6-му дню после прививки и сохраняется в течение 11 – 12 мес. Для его оценки и ретроспективной диагностики чумы предложена внутрикожная аллергическая проба с пестином. Реакция считается положительной, если на месте введения пестина через 24 – 48 ч образуется уплотнение не менее 10 мм в диаметре и появляется краснота. Аллергическая проба положительна и у лиц, имеющих постинфекционный иммунитет.

Большой вклад в изучение чумы и организацию борьбы с ней внесли русские ученые: Д. С. Самойлович (первый не только в России, но и в Европе «охотник» за микробом чумы еще в XVIII в., он же первым предложил делать прививки против чумы), Д. К. Заболотный, Н. П. Клодницкий, И. А. Деминский (изучение природных очагов чумы, носителей возбудителя ее в очагах и т. п.) и др.

Иерсинии – возбудители псевдотуберкулеза (Y. pseudotuberculosis) и кишечного иерсиниоза (Y. enterocolitica)

Эти два вида иерсиний не относятся к категории особо опасных, но они тоже играют значительную роль в патологии человека. Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica представляют собой полиморфные, не образующие спор грамотрицательные палочки, имеющие часто овоидную форму, клетки в старых культурах окрашиваются неравномерно. Бактерии псевдотуберкулеза, взятые с влажного агара, могут иметь биполярную окраску, образуют капсулу, но с различной степенью выраженности. Оба вида бактерий обладают, в отличие от Y. pestis, подвижностью, обусловленной наличием перитрихиальных жгутиков. Подвижность выявляется посевом в столбик полужидкого агара уколом, но только при 18 – 20 °C, при 37 °C она отсутствует. Иерсинии нетребовательны к питательным средам, хорошо растут на обычных универсальных средах, способны активно размножаться в почве и воде. Оптимальная для роста температура 30 °C, верхняя и нижняя температурные границы роста составляют 43 °C и 0 – 2 °C соответственно, диапазон рН 6,6 – 7,8. На среде Эндо через сутки колонии имеют диаметр 0,1 – 0,2 мм, круглые, выпуклые, блестящие, с ровными краями, бесцветны (не ферментируют лактозу), через несколько суток размер колоний 0,5 – 3 мм. Колонии возбудителя псевдотуберкулеза, находящиеся в R-форме, почти не отличаются от колоний Y. pestis (пигментированный центр и фестончатый «кружевной» край), но не имеют стадии «битого стекла».

Основные различия между возбудителями чумы, псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза представлены в табл. 29.

Все три вида иерсиний отличаются и по антигенным свойствам.

Возбудитель псевдотуберкулеза по О-антигенам разделяется на восемь групп (I – VIII) с 20 О-факторными антигенами (1 – 20). По О– и Н-антигенам (а – е) этот вид подразделяют на 13 сероваров и подсероваров (Ia, Ib, IIa, IIb, IIc, III, IVa, IVb, Va, Vb, VI, VII, VIII).

Y. enterocolitica характеризуется неоднородностью по О-антигену. Различают 34 серовара этого вида. Большинство из них адаптированы к некоторым видам животных или широко распространены во внешней среде. Подавляющее большинство штаммов, выделенных от человека, принадлежит к сероварам О3 и О9, реже встречаются серовары О6, О8, О5 и очень редко серовары О1, О2, О10, О11, О13 – О17.

От больных псевдотуберкулезом чаще всего выделяются штаммы сероваров I (Ib), III и IV.

Таблица 29

Основные различия между возбудителями чумы, псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза

Примечание. (+) – признак положительный; ( – ) – признак отсутствует;? – не известно.

В ходе эволюции у иерсиний закрепилась необходимость существования в двух средах обитания – внешней (сапрофитическая фаза) и в организме теплокровных животных и человека (паразитическая фаза). Для осуществления паразитической фазы иерсинии должны проникнуть в организм теплокровного животного. Заражение возбудителем псевдотуберкулеза чаще всего происходит при употреблении в пищу инфицированных иерсиниями продуктов, хранившихся при пониженной температуре (4 – 12 °C) в холодильниках и овощехранилищах. В этих условиях в силу своей психрофильности бактерии могут размножаться и накапливаться в пищевых субстратах. Примером такого способа заражения является заболевание в 1988 г. псевдотуберкулезом 106 человек в Краснодарском крае, связанное с употреблением капусты, инфицированной Y. pseudotuberculosis. Основным резервуаром ее служит почва. Иерсинии при пониженной температуре обладают высоким потенциалом клеточной и тканевой инвазивности и способны сохранять высокий уровень вирулентности, однако возбудитель может проникнуть в организм человека и через любые слизистые оболочки, вероятно, за счет неспецифических механизмов. Источником иерсиниозов являются также дикие и синантропные грызуны, домашние и сельскохозяйственные животные. Возможно заражение человека от человека.

Штаммы Y. pseudotuberculosis выделены от 175 видов млекопитающих, 124 видов птиц, 7 видов рыб. Зараженные грызуны, животные и люди выделяют возбудителя с испражнениями и мочой, загрязняя воду, растения и другие объекты внешней среды, а через них заражается и человек. Таким образом, пищевой путь в передаче возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза является ведущим: заражение происходит в результате употребления в пищу сырых или недостаточно термически обработанных продуктов (мяса, мясных продуктов, молока, овощей, фруктов, зелени). Оба вида возбудителя способны размножаться не только на растениях, но и внутри них (салата, гороха, овса и т. п.).

Заболевания, вызываемые иерсиниями, характеризуются полиморфностью клинических проявлений, поражением желудочно-кишечного тракта, тенденцией к генерализации, септикопиемии и поражению различных органов и систем.

Y. enterocolitica вызывает у человека гастроэнтерит с повреждением стенок тонкого кишечника. Нередко после перенесенной болезни наблюдаются аутоиммунные спондилоартриты типа синдрома Рейтера и реактивного артрита. Полагают, что эти последствия связаны с наличием у Y. enterocolitica суперантигенов. Свойствами суперантигенов обладают мембранные белки этих бактерий.

Псевдотуберкулез людей на Дальнем Востоке описан как Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка. Она протекает тяжелее, чем псевдотуберкулез в западных областях, и характеризуется более сильными аллергическими и токсическими проявлениями, особенно на 2-й стадии болезни.

Патогенные свойства иерсиний обоих видов, как и возбудителя чумы, определяются не только хромосомными, но и плазмидными генами. У них обнаружены плазмиды, очень сходные с плазмидами Y. pestis, которые кодируют синтез антигенов V – W и наружных белков (Yop), таких же, как у Y. pestis, и других факторов вирулентности. Они имеют общий с Y. pestis кластер генов, связанных с системой транспорта железа. Установлено, что Y. pseudotuberculosis синтезирует термостабильный токсин, вызывающий гибель морских свинок при внутрибрюшинном заражении. Важную роль в патогенезе псевдотуберкулеза играет способность возбудителя к адгезии и колонизации слизистой кишечника.

Микробиологическая диагностика иерсиниозов включает использование бактериологических методов и серологических реакций. При бактериологическом методе исследуемый материал от больного (испражнения, кровь, слизь из зева), а также подозрительные продукты или воду засевают на среды Эндо, Плоскирева, Серова (индикаторную и дифференциальную) и инкубируют при 37 °C в течение 48 – 72 ч. Подозрительные колонии (мелкие бесцветные на средах Эндо и Плоскирева и окрашенные колонии двух различных форм на средах Серова) пересевают для получения чистых культур, которые идентифицируют по биохимическим признакам и окончательно типируют с помощью диагностических агглютинирующих сывороток.

Для серологической диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза используют развернутую реакцию агглютинации (по типу реакции Видаля) с соответствующими диагностикумами или РПГА с антигенным эритроцитарным диагностикумом. Положительными считают реакции при титре антител 1: 400 и выше. Реакции рекомендуется ставить с парными сыворотками с интервалом в несколько дней. Нарастание титра антител свидетельствует о специфичности инфекционного процесса.

Микробиология бруцеллеза

Бруцеллез – своеобразное заболевание людей и животных, вызываемое бактериями рода Brucella. В России ежегодно регистрируется около 500 первичных заболеваний людей бруцеллезом.

Человек заражается бруцеллезом главным образом от домашних животных (овцы, козы, коровы, свиньи, северные олени – главный резервуар возбудителя в природе). Болезнь существует давно и была описана под названиями, определяемыми ее географическим распространением (мальтийская, неаполитанская, гибралтарская, средиземноморская лихорадка).

Возбудитель открыт в 1886 г. Д. Брюсом, который обнаружил его в препарате из селезенки солдата, умершего от мальтийской лихорадки, и назвал мальтийским микрококком – Micrococcus melitensis. Было установлено, что основным носителем его являются козы и овцы, а заражение происходит при употреблении сырого молока от них. В 1897 г. Б. Банг и Б. Стрибольт обнаружили возбудителя инфекционного аборта коров – Bacterium abortus bovis, а в 1914 г. Дж. Траум открыл возбудителя инфекционного аборта свиней – B. abortus suis. Проведенное в 1916 – 1918 гг. А. Ивенс сравнительное изучение свойств M. melitensis и B. abortus bovis показало, что они почти не отличаются друг от друга по многим свойствам. В связи с этим было предложено объединить их в одну группу, названную в честь Брюса – Brucella. В 1929 г. И. Хеддльсон включил в эту группу B. abortus suis и предложил род Brucella разделить на 3 вида: Brucella melitensis (Micrococcus melitensis), Brucella abortus (B. abortus bovis) и Brucella suis (B. abortus suis).

Заболевание людей и животных, вызываемое бруцеллами, было решено называть бруцеллезом. В последующем род Brucella пополнился еще тремя видами: B. ovis выделен от баранов, страдающих эпидидимитами (1953), B. neotomae – от кустарниковых крыс (1957) и B. canis – от гончих собак (1966). По классификации Берджи (2001), бруцеллы относятся к классу Alphaproteobacteria.

Бруцеллы обладают сходными морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами. Они представляют собой грамотрицательные мелкие кокковидные клетки диаметром 0,5 – 0,7 мкм и длиной 0,6 – 1,5 мкм (см. цв. вкл., рис. 96.1), располагаются беспорядочно, иногда парами, не имеют жгутиков, не образуют спор и капсул. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 56 – 58 мол %. Бруцеллы являются аэробами или микроаэрофилами, в анаэробных условиях не растут. Температурный оптимум для роста 36 – 37 °C; рН 7,0 – 7,2; хорошо растут на обычных питательных средах, но лучше – с добавлением сыворотки или крови. Рекомендуемые среды: питательный агар с добавлением сыворотки (5 %) и глюкозы; агар, приготовленный на картофельном настое, с добавлением 5 % сыворотки; кровяной агар; мясо-пептонный бульон. Особенностью B. abortus является потребность ее в повышенном содержании CO₂ (5 – 10 %) в атмосфере роста. Очень характерен для бруцелл медленный рост, особенно в первых генерациях: при высеве от человека и животных рост иногда появляется через 2 – 4 нед. Колонии бруцелл бесцветны, выпуклые, круглые – S-формы, или шероховатые – R-формы, нежные и прозрачные вначале, с возрастом мутнеют.

Колонии B. canis, B. ovis и 5-го биотипа B. suis всегда имеют R-форму. Рост бруцелл в бульонных средах сопровождается равномерным помутнением. Для роста бруцелл необходимы тиамин, биотин, ниацин. Бруцеллы ферментируют глюкозу и арабинозу с образованием кислоты без газа, не образуют индола, восстанавливают нитраты в нитриты. Образование сероводорода наиболее сильно выражено у B. suis.

В общей сложности у бруцелл с помощью иммуноэлектрофореза экстрактов, приготовленных из разрушенных ультразвуком клеток, обнаружено 10 – 14 антигенных фракций. Бруцеллы имеют общий родоспецифический антиген, различные другие соматические антигены, в том числе видоспецифические М (преобладает у B. melitensis), А (преобладает у B. abortus) и R (у шероховатых форм). Антигены М и А обнаруживаются также и у других видов (биоваров) бруцелл, но в разных соотношениях, что необходимо учитывать при их идентификации (табл. 26). Обнаружены антигены, общие с Francisella tularensis, Bordetella bronchiseptica и Y. enterocolitica (серотип 09). В связи с тем, что некоторые признаки у бруцелл варьируют, вид B. melitensis подразделяют на 3 биовара, вид B. abortus – на 9 и B. suis – на 5 биоваров. Для их дифференциации на виды и биотипы и идентификации используют комплекс признаков, включающий в себя, помимо морфологических и тинкториальных свойств, также потребность в CO₂ для роста, способность расти на средах в присутствии некоторых красителей (основной фуксин, тионин, сафранин), выделять H₂S, образовывать уреазу, фосфатазу, каталазу (активность этих ферментов наиболее сильно выражена у B. suis, они же не растут на среде с сафранином), чувствительность к тбилисскому бактериофагу, агглютинация моноспецифическими сыворотками (табл. 30). В случае необходимости используют дополнительные метаболические тесты: способность окислять некоторые аминокислоты (аланин, аспарагин, глутаминовую кислоту, орнитин, цитруллин, аргинин, лизин) и углеводы (арабинозу, галактозу, рибозу, D-глюкозу, L-эритритол, D-ксилозу).

Четвертый биовар B. suis, поскольку его основным носителем являются не свиньи, а северные олени, и с учетом других его особенностей целесообразно выделять в качестве самостоятельного вида Brucella rangiferis.

К пятому биовару B. suis относят культуры, выделенные от абортировавших коров и овец и имеющие стойкую R-форму бруцелл.

Отношение бруцелл к тбилисскому фагу: в обычном рабочем разведении фаг лизирует только B. abortus. Однако в дозе, равной десяти рабочим, фаг лизирует, хотя и слабо, штаммы B. suis и B. neotomae.

Резистентность бруцелл. Бруцеллы обладают относительно высокой устойчивостью во внешней среде. Они сохраняются во влажной почве и в воде до 2 – 3, а при температуре 11 – 13 °C – до 4,5 мес.; в непроточных водоемах – до 3 мес.; в молоке – до 273 дней; в масле – до 142 дней; в сыре – до 1 года; в брынзе – до 72 дней; в кислом молоке – до 30 дней; в кефире – до 11 дней. Однако они очень чувствительны к высокой температуре – при 70 °C погибают через 10 мин, а при кипячении – за несколько секунд. Пастеризация молока при 80 – 90 °C вызывает их гибель через 5 мин. Бруцеллы чувствительны также к различным химическим дезинфектантам.

Таблица 30

Дифференциация бруцелл на виды и биовары

Примечание.а – концентрация в мкг/мл среды 1: 25 000; b – концентрация в мкг/мл среды 1: 50 000; РД – рабочая доза фага (стандартное тест-разведение).

Факторы патогенности. Бруцеллы не образуют экзотоксина. Их патогенность обусловлена эндотоксином и способностью подавлять фагоцитоз, предотвращать «окислительный взрыв». Конкретные факторы, подавляющие фагоцитоз, изучены недостаточно. Патогенность бруцелл связана также с гиалуронидазой и другими ферментами. Существенно важным является то, что бруцеллы обладают сильнейшим аллергенным свойством, которое во многом определяет патогенез и клинику бруцеллеза.

Особенности эпидемиологии. Основными носителями бруцелл являются овцы, козы (B. melitensis), крупный рогатый скот (B. abortus), свиньи (B. suis) и северные олени (B. rangiferis). Однако они могут переходить и на многие другие виды животных (яки, верблюды, буйволы, волки, лисицы, грызуны, ламы, сайгаки, бизоны, лошади, зайцы, ежи, куры и др.). Особенно большую эпидемиологическую опасность представляет переход Brucella melitensis на крупный рогатый скот, так как в этом случае она сохраняет свою высокую патогенность для человека. Из всех видов наиболее патогенным для человека в нашей стране является B. melitensis. Он служит причиной заболевания людей более чем в 95 – 97 % всех случаев бруцеллеза. B. abortus, как правило, вызывает латентную форму болезни, и только в 1 – 3 % отмечаются клинические проявления. Еще реже заболевание вызывает B. suis (менее 1 %). Патогенность бруцелл варьирует в зависимости не только от вида, но и от биовара. В частности, биовары 3, 6, 7, 9 B. abortus по вирулентности не уступают B. melitensis. Американские варианты B. suis являются также высоковирулентными, поэтому в разных странах этиологическая роль отдельных видов бруцелл проявляется по-разному. Например, в Мексике основную роль в эпидемиологии бруцеллеза играет B. melitensis, в США – B. suis, а в Канаде и некоторых европейских странах – B. abortus. Не исключено, что биовары 3, 6, 7, 9 B. abortus возникли в результате миграции на крупный рогатый скот Brucella melitensis и ее трансформации.

У животных бруцеллез протекает в виде общего заболевания, картина которого бывает различной. Для крупного и мелкого рогатого скота наиболее характерные проявления болезни – инфекционные аборты, особенно если они носят массовый характер. У свиней аборты отмечаются реже, болезнь протекает как хронический сепсис с поражением суставов, яичек и других органов. От больных животных возбудитель выделяется с молоком, мочой, испражнениями, гноем и особенно обильно – в период выкидыша с плодом, околоплодными оболочками и истечениями из родовых путей, которые представляют наиболее заразительный материал. Обильное размножение бруцелл в оболочках плода связывают с наличием в них многоатомного спирта – эритритола, который служит важным фактором роста для бруцелл всех видов, кроме B. ovis.

Человек заражается от животных (от больного человека крайне редко) главным образом контактным или контактно-бытовым путем (80 – 90 % всех заболеваний). Алиментарный способ заражения наблюдается в основном при употреблении непастеризованного молока от больных животных или молочных продуктов, приготовленных из него, а также воды. Контактным или контактно-бытовым способом могут заразиться все лица, постоянно или временно имеющие дело с животными или животным сырьем в силу своей профессии (пастухи, скотники, доярки, ветеринарные работники и другие лица). Бруцеллы при этом проникают в организм человека через кожу или, значительно чаще, через слизистые оболочки полости рта, носа, глаза (заносятся грязными руками).

Особенности патогенеза и клиники. Инкубационный период при бруцеллезе варьирует от 1 нед. до нескольких месяцев.

По лимфатическим путям возбудитель попадает в лимфатические узлы; размножаясь, образует «первичный бруцеллезный комплекс», локализация которого зависит от места входных ворот, но чаще всего это лимфатический аппарат ротовой полости, заглоточные, шейные, подчелюстные железы и лимфатический аппарат кишечника. Из лимфатических узлов возбудитель проникает в кровь и распространяется по всему организму, избирательно поражая ткани лимфо-гемопоэтической системы. Бактериемия и генерализация процесса приводят к сильной аллергизации организма. Бруцеллез протекает как хрониосепсис. Это обусловлено незавершенным характером фагоцитоза. Находясь и размножаясь внутри клеток, в том числе фагоцитов, бруцеллы оказываются не доступными ни для антител, ни для химиопрепаратов. Кроме того, они могут превращаться внутри клеток в L-формы и в таком виде длительно персистировать в организме, а возвращаясь в исходную форму, вызывать рецидив болезни.

Клиника бруцеллеза очень многообразна и сложна. Она зависит прежде всего от аллергизации и интоксикации организма и от того, какие органы и ткани вовлечены в инфекционный процесс. Чаще всего страдают лимфатическая, сосудистая, гепатолиенальная, нервная, и особенно опорно-двигательная системы. Бруцеллезу свойственно длительное течение (иногда до 10 мес.), в тяжелых случаях он может приводить к длительной потере трудоспособности и временной инвалидности, но все же болезнь, как правило, заканчивается полным выздоровлением.

Постинфекционный иммунитет длительный, прочный, но возможны повторные заболевания. Иммунитет перекрестный (против всех видов бруцелл) и обусловлен Т-лимфоцитами и макрофагами. У иммунных людей и животных фагоцитоз носит завершенный характер. Роль антител в иммунитете заключается в стимуляции фагоцитарной активности. Положительная аллергическая реакция свидетельствует не только о сенсибилизации организма, но и о наличии иммунитета. Прорыв иммунитета может произойти при инфицировании большими дозами возбудителя или при его высокой вирулентности.

Лабораторная диагностика бруцеллеза осуществляется с помощью биологической пробы, бактериологического метода, серологических реакций, аллергической пробы Бюрне и метода ДНК – ДНК гибридизации. Материалом для исследования служат кровь, костный мозг, конъюнктивальный секрет, моча, грудное молоко (у кормящих матерей), реже – испражнения, околосуставная жидкость. Поскольку основным местом пребывания возбудителя в организме являются клетки гемо– или лимфопоэтической систем, предпочтение следует отдавать выделению гемо– или миелокультуры. При бактериологическом исследовании необходимо обеспечить условия для роста B. abortus (потребность в CO₂). Идентификацию выделенных культур бруцелл проводят на основании указанных в табл. 30 признаков. К биологической пробе (заражение морских свинок) прибегают в том случае, когда материал сильно загрязнен посторонней микрофлорой и получить непосредственно из него чистую культуру возбудителя трудно. Серологические реакции могут быть использованы либо для обнаружения антигенов возбудителя, либо для выявления антител к нему. Для обнаружения бруцеллезных антигенов, которые могут циркулировать в крови либо в свободном виде, либо в виде комплексов антиген + антитело (ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы), используют следующие реакции: РПГА (особенно с использованием эритроцитарных диагностикумов с моноклональными антителами к родоспецифическому антигену бруцелл); реакцию агрегат-гемагглютинации (РАГА); эритроциты несут антитела к бруцеллезным антигенам; реакции коагглютинации, преципитации и ИФМ. Для обнаружения антител в сыворотке больного используют: реакцию агглютинации Райта, реакцию Кумбса (для выявления неполных антител), реакцию иммунофлуоресценции в непрямом варианте, РПГА, ИФМ, РСК, ОФР, а также ускоренные реакции на стекле: Хеддльсона, розбенгал, латекс-агглютинации, непрямую реакцию гемолиза (эритроциты, сенсибилизированные ЛПС бруцелл, в присутствии антител и комплемента лизируются).

Специфическая профилактика осуществляется с помощью живой вакцины, приготовленной из штамма B. abortus (живая бруцеллезная вакцина – ЖБВ), только в очагах козье-овечьего бруцеллеза. Вакцина применяется накожно, однократно. Ревакцинацию проводят только лицам, у которых проба Бюрне и серологические реакции отрицательны. Поскольку ЖБВ обладает сильным аллергенным действием, вместо нее предложена химическая бруцеллезная вакцина (ХБВ), приготовленная из антигенов клеточной стенки бруцелл. Она обладает высокой иммуногенностью, но менее аллергенна. Взвесь убитых бруцелл (убитая лечебная вакцина) или ХБВ могут быть использованы для лечения хронического бруцеллеза (стимулируют формирование постинфекционного иммунитета).

Микробиология туляремии

Туляремия – первичная болезнь животных (грызунов), у человека протекает в виде острого инфекционного заболевания с разнообразной клинической картиной и медленным восстановлением трудоспособности. Возбудитель – Francisella tularensis – открыт Г. Мак-Коем и Ш. Чепином в 1912 г. во время эпизоотии среди земляных белок в местности с озером Туляре (Калифорния), подробно изучен Э. Френсисом, в честь которого и назван род. Это очень маленькие (см. цв. вкл., рис. 96.2), размерами 0,2 – 0,7 мкм кокковидные или эллипсоидные полиморфные палочки, которые очень часто при специальных методах окрашивания дают биполярную окраску;

неподвижны, грамотрицательны, спор не образуют; каталазонегативны, образуют H₂S, строгие аэробы, температурный оптимум для роста 37 °C, рН 6,7 – 7,2. Вирулентные штаммы имеют капсулу, образуют кислоту без газа при ферментации некоторых углеводов (глюкоза, мальтоза, манноза, фруктоза, декстрин), степень ферментации у разных штаммов варьирует, содержание Г + Ц в ДНК – 33 – 36 мол %. F. tularensis на обычных средах не растет. Г. Мак-Кой и Ш. Чепин использовали свернутую желточную среду. На ней туляремийная палочка растет в виде нежных мелких колоний, напоминающих капельки росы, затем культура приобретает характер нежного шагреневого налета со слабо выраженной слизистой консистенцией. Э. Френсис предложил для выращивания туляремийной палочки питательный агар, содержащий 0,05 – 0,1 % цистина, 1 % глюкозы и 5 – 10 % крови. На такой среде рост более пышный и грубый: колонии круглые с гладкой поверхностью, молочного цвета, влажные, со слизистой консистенцией, окружены характерным зеленым ореолом. Рост медленный, максимального размера колонии достигают на 3 – 5-й день (1 – 4 мм). Туляремийные бактерии хорошо размножаются в желточном мешке куриного эмбриона, вызывая его гибель на 3 – 4-й день.

Для роста F. tularensis необходимы следующие аминокислоты: аргинин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, пролин, треонин, гистидин, валин, цистин, для некоторых подвидов – серин, тирозин, аспарагиновая кислота; кроме того, для роста они нуждаются также в пантотеновой кислоте, тиамине и ионах Mg²⁺. С учетом этих особенностей для культивирования F. tularensis можно использовать синтетические среды.

Род Francisella отнесен к классу Gammaproteobacteria, тип Proteobacteria. К этому же роду относится F. novicida, патогенность которой для человека не установлена.

Возбудитель туляремии является внутриклеточным паразитом. Его вирулентность обусловлена капсулой, угнетающей фагоцитоз; нейраминидазой, которая способствует адгезии; эндотоксином; аллергенными свойствами клеточной стенки, а также способностью размножаться в фагоцитах и подавлять их киллерный эффект. Механизмы вирулентности пока не расшифрованы. Кроме того, у туляремийной палочки обнаружены рецепторы, способные взаимодействовать с Fc-фрагментами иммуноглобулинов класса IgG. В результате такого связывания нарушается активность систем комплемента и макрофагов.

F. tularensis в S-форме (вирулентный) имеет два антигена – О и Vi (капсульный антиген). О-антиген обнаруживает родство с антигенами бруцелл. Диссоциация S→SR→R приводит к утрате капсулы, вирулентности и иммуногенности. Вид F. tularensis подразделяют на три географические расы (подвида):

1) голарктическую (слабопатогенная для домашних кроликов, не ферментирует глицерина и не имеет фермента цитруллинуреидазы, встречается в странах северного полушария);

2) среднеазиатскую (малопатогенная для кроликов, имеет цитруллинуреидазу и ферментирует глицерин);

3) неарктическую (американскую), более патогенна для кроликов, ферментирует глицерин, имеет цитруллинуреидазу.

Кроме того, штаммы американского и среднеазиатского подвидов обладают фосфатазной активностью, отсутствующей у штаммов голарктического подвида.

Резистентность. F. tularensis довольно устойчива во внешней среде, особенно если содержится в патологическом материале. В фураже, зерне, загрязненных выделениями больных грызунов, выживает до 4 мес.; в воде – до 3 мес.; во льду – более 1 мес. Чувствительна к прямым солнечным лучам (погибает за 30 мин), высокой температуре (при 60 °C гибнет через 10 мин), под действием 3 % раствора лизола, 50 %-ного спирта, формалина и других антисептиков погибает через 5 – 10 мин.

Эпидемиология. Основным резервуаром туляремии в природе являются грызуны, среди которых в естественных условиях наблюдаются эпизоотии. Человек заражается только от животных, от человека к человеку возбудитель не передается. Возбудитель обнаружен у 82 видов грызунов и зайцеобразных, наиболее часто встречается у представителей 4 семейств: мышевидных (Muridae), заячьих (Leporidae), беличьих (Sciuridae) и тушканчиковых (Dipodidae). На территории России основными носителями являются мышевидные грызуны: водяные крысы, обыкновенные полевки, домовые мыши и ондатры.

По чувствительности к туляремии животные могут быть разбиты на четыре группы:

1-я группа – наиболее восприимчивы (полевки, водяные крысы, домовые мыши, белые мыши, морские свинки и некоторые другие). Минимальная смертельная доза составляет одну микробную клетку;

2-я группа – менее чувствительны (серые крысы, суслики и др.). Минимальная смертельная доза – 1 млрд микробных клеток, однако для заражения некоторых из них достаточно одной микробной клетки;

3-я группа (хищники – кошки, лисицы, хорьки). Устойчивы к высоким заражающим дозам, заболевание протекает без видимых проявлений;

4-я группа – невосприимчивы к туляремии (копытные животные, холоднокровные, птицы).

Для человека минимальная инфицирующая доза – одна микробная клетка. Заражение человека происходит всеми возможными способами: прямым и непрямым контактом с больными грызунами, их трупами или с предметами, зараженными грызунами; алиментарным (при употреблении пищевых продуктов и воды, инфицированных грызунами), воздушно-пылевым и трансмиссивным путем. Зараженность туляремийными бактериями установлена у 77 видов кровососущих членистоногих. Особенно большое значение имеют иксодовые клещи, у которых возбудитель сохраняется в течение всей жизни и даже передается трансовариально потомству. Эти обстоятельства способствуют укоренению болезни в природе. Заражение человека клещами происходит не путем укуса, а в результате попадания возбудителя на кожу вместе с испражнениями клеща.

На территории России различают 7 основных ландшафтных типов природных очагов туляремии: пойменно-болотный, луго-полевой, степной, лесной, предгорноручьевой, тундровый и тугайный (пойменно-пустынный).

Особенности патогенеза и клиники. F. tularensis проникает в организм через наружные покровы (поврежденную и неповрежденную кожу и слизистые). На месте внедрения нередко образуются язвочки. Через лимфатические сосуды бактерии попадают в регионарный лимфатический узел и беспрепятственно размножаются в нем; воспалительный процесс приводит к формированию бубона. Отсюда возбудитель проникает в кровь, бактериемия обусловливает генерализацию процесса, в него вовлекаются различные органы и ткани, размножение в которых бактерий приводит к образованию гранулем и некротических язв. С бактериемией и генерализацией связана аллергическая перестройка организма. Инкубационный период при туляремии варьирует от 2 до 8 дней. Болезнь начинается остро: появляются лихорадка, головная боль, боли в мышцах, гиперемия лица. Дальнейшее течение зависит от места входных ворот, в соответствии с которым различают следующие клинические формы туляремии: язвенно-железистую (бубонную), глазо-железистую, ангинозножелезистую, абдоминальную и легочную. Летальность при туляремии не превышает 1 – 2 %.

Постинфекционный иммунитет прочный, стойкий, в большинстве случаев пожизненный, имеет клеточную природу, обусловлен главным образом Т-лимфоцитами и макрофагами, в меньшей степени – антителами. Фагоцитоз у лиц, имеющих иммунитет, имеет завершенный характер.

Лабораторная диагностика. В связи с полиморфной клинической картиной туляремии в ее диагностике решающее значение имеют лабораторные методы: бактериологический, биологический, серологические реакции и аллергическая проба. Бактериологический метод имеет существенную особенность: выделить возбудителя от больного человека непосредственно не удается. Поэтому исследуемым материалом (пунктат бубона, гной из конъюнктивы, пленка из зева, мокрота, испражнения, кусочки органов из трупов грызунов) вначале заражают подкожно белых мышей или морских свинок, а затем уже делают посев крови или материала из органов для получения чистой культуры, которую идентифицируют по морфологическим, культуральным (не растет на обычных средах) свойствам, по реакции агглютинации со специфической сывороткой и окончательно – биологической пробой на белых мышах.

F. tularensis можно выделить также путем заражения в желточный мешок куриных эмбрионов. Возбудитель легко в нем обнаруживается с помощью метода иммунной флуоресценции. Однако биологические пробы и бактериологические исследования по туляремии возможно проводить только в специальных лабораториях. В обычных клинических условиях для диагностики туляремии применяют только серологические реакции (со 2-й нед. развернутая пробирочная агглютинация, РПГА и др.) и аллергическую пробу с тулярином. Последняя является наиболее ранним методом специфической диагностики. При внутрикожной постановке она бывает положительной с 3 – 5-го дня болезни, при накожной – с 6 – 8-го дня. В природных очагах туляремии для контроля эпизоотий среди грызунов используют РПГА и ее варианты (РНАг, РТПГА), а также ИФМ с целью обнаружения антигенов туляремийной палочки в трупах грызунов, погадках хищных птиц, помете хищников.

Специфическая профилактика. Основным методом предупреждения заболевания людей, проживающих на территории природных очагов туляремии, является вакцинация, осуществляемая с помощью живой (ослабленной) сухой накожной вакцины. Вакцину вводят однократно, иммунитет не менее 5 – 7 лет.

Микробиология сибирской язвы

Сибирская язва является острым инфекционным заболеванием человека и животных (домашних и диких).

Русское название болезни дал С. С. Андриевский в связи с крупной эпидемией на Урале в конце XVIII в. В 1788 г. героическим опытом самозаражения он доказал идентичность сибирской язвы человека и животных и окончательно подтвердил ее нозологическую самостоятельность. Возбудитель – Bacillus anthracis – был неоднократно описан разными авторами (Поллендер А., 1849; Дален К., 1850; Браун Ф., 1854), однако его этиологическая роль была окончательно установлена Р. Кохом (1876) и Л. Пастером (1881).

B. anthracis (род Bacillus) относится к семейству Bacillaceae (класс Bacilli). Это крупная палочка длиной 5 – 8, иногда до 10 мкм, диаметром 1,0 – 1,5 мкм. Концы у живых палочек слегка закруглены, у убитых они как бы обрублены и слегка вогнуты. Палочки в мазках располагаются парами и очень часто – цепочками (см. цв. вкл., рис. 97.1), особенно длинными на питательных средах, напоминая бамбуковую трость. Сибиреязвенная палочка хорошо красится всеми анилиновыми красителями, грамположительна. Жгутиков не имеет, образует споры, но только вне организма человека или животного при наличии кислорода и определенной влажности. Температурный оптимум для спорообразования 30 – 35 °C (ниже 12 °C и выше 43 °C спорообразования не происходит). Споры располагаются центрально, их диаметр не превышает диаметра бактериальной клетки. Образование спор происходит в тех случаях, когда бактерии испытывают дефицит либо источников энергии, либо аминокислот или оснований. Поскольку в крови и тканях эти источники питания бактерий имеются, спорообразования в организме не происходит. Возбудитель сибирской язвы образует капсулу, но только в организме животного или человека (см. рис. 97.2), на питательных средах она наблюдается редко (на средах, содержащих кровь или сыворотку). Капсулообразование патогенных бактерий – защитный механизм. Оно индуцируется факторами, содержащимися в крови и тканях, поэтому капсулы образуются, когда бактерии находятся в организме или при выращивании на средах с кровью, плазмой или сывороткой. Содержание Г + Ц в ДНК варьирует в пределах 32 – 62 мол % (для рода в целом).

Возбудитель сибирской язвы – аэроб или факультативный анаэроб. Температурный оптимум для роста 37 – 38 °C, рН среды 7,2 – 7,6. К питательным средам нетребователен. На плотных средах образует характерные крупные матовые шероховатые колонии R-формы. Структура колоний, благодаря цепочечному расположению палочек, которые образуют нити, отходящие от центра, имеет сходство с локонами или львиной гривой (рис. 98). На агаре, содержащем пенициллин (0,05 – 0,5 ЕД/мл), через 3 ч роста бациллы распадаются на отдельные шарики, располагающиеся в виде цепочки, образуя феномен «жемчужного ожерелья». В бульоне палочка, находящаяся в R-форме, растет на дне, образуя осадок в виде комочка ваты, бульон при этом остается прозрачным. B. anthracis вирулентна в R-форме, при переходе в S-форму она утрачивает свою вирулентность. Такие палочки на плотной среде образуют круглые гладкие колонии с ровными краями, а в бульоне – равномерное помутнение. При этом палочки утрачивают способность располагаться в мазках цепочками и приобретают вид коккобактерий, располагающихся скоплениями.

Рис. 98. Колония Bacillus anthracis

B. anthracis довольно активна в биохимическом отношении: ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, образует H₂S, свертывает молоко и пептонизирует его, каталазопозитивна, имеет нитратредуктазу. При посеве уколом в столбик 10 – 12 %-ного мясо-пептонного желатина вызывает послойное разжижение его (рост в виде елочки, опрокинутой вниз вершиной).

Для отличия B. anthracis от других видов Bacillus используют комплекс признаков (табл. 31).

Антигенное строение. Возбудитель сибирской язвы имеет соматические антигены и капсульный антиген белковой природы (состоит из D-глутаминовой кислоты), образуемый главным образом в организме животного и человека. Соматический антиген полисахаридной природы термостабилен, длительно сохраняется во внешней среде и в трупах животных. На его обнаружении основана диагностическая реакция термопреципитации Асколи. Сибиреязвенная палочка имеет также антигены, общие для рода Bacillus.

Факторы патогенности. Важнейшим фактором вирулентности сибиреязвенной палочки является капсула. Утрата капсулы приводит к потере вирулентности. Капсула предохраняет B. anthracis от фагоцитоза. Другим важным фактором вирулентности, который ответствен за смерть животных, является сложный комплекс токсина, содержащего 3 различных компонента: фактор I, состоящий из белка и углевода; и два фактора чисто белковой природы (факторы II и III). Синтез сложного токсина контролируется плазмидой pX01 c м. м. 110 – 114 МД. В составе плазмиды pX01 есть три гена, определяющих синтез основных компонентов экзотоксина:

ген cya – фактора отечности (ОФ);

ген pag – протективного антигена (ПА);

ген lef – летального фактора (ЛФ).

Продуктом гена cya (ОФ) является аденилатциклаза, катализирующая накопление в клетках эукариот цАМФ. Фактор отечности вызывает повышение проницаемости сосудов.

Протективный антиген индуцирует синтез защитных антител (однако наиболее иммуногенным является комплекс из всех трех компонентов обезвреженного токсина), летальный фактор вызывает смерть животных. Все три компонента токсина действуют синергидно.

Синтез капсулы сибиреязвенной палочки контролируется также плазмидой pX02 c м. м. 60 МД.

В связи со сложной структурой комплекса генов, контролирующих патогенность B. anthracis, уточняется локализация генов в геноме бактерии с применением различных методов генотипирования, в том числе сравнительного анализа MLVA и хромосомных VNTR (см. с. 27).

Таблица 31

Дифференциальные признаки B. anthracis и некоторых других видов рода Bacillus

Резистентность B. anthracis. В вегетативной форме возбудитель обладает такой же степенью устойчивости к воздействию факторов внешней среды и химических веществ, как и другие бесспоровые бактерии. Споры бактерии очень устойчивы, сохраняются в почве десятилетиями, в воде – годами, выдерживают кипячение в течение 45–60 мин, автоклавирование (110 °C) – 5 мин, сухой жар (140 °C) – до 3 ч, долго сохраняются в шкурах животных и засоленном мясе.

Особенности эпидемиологии. Основным источником сибирской язвы являются больные травоядные животные. Они в течение всего периода болезни выделяют возбудителя с мочой, испражнениями и слюной в почву, инфицируя ее, поэтому почва, особенно богатая органическими веществами, становится дополнительным резервуаром возбудителя. Заражение животных происходит главным образом алиментарным путем (через корм и питьевую воду, зараженные спорами), реже – трансмиссивным – через укусы мух, клещей, слепней, которые переносят возбудителя от больных животных, трупов и из инфицированных объектов внешней среды; очень редко – воздушным путем. При непосредственном контакте от больного животного к здоровому возбудитель не передается.

Заражение человека сибирской язвой происходит при непосредственном контакте с трупами животных, при разделке туш вынужденно убитых животных, при уходе за больными животными, при употреблении мяса или мясных продуктов, полученных от больных животных, при контакте с шерстью, шкурами, кожей, щетиной, зараженными возбудителем или его спорами. Заражение здорового человека от больного происходит крайне редко.

Входными воротами инфекции являются кожа и слизистые оболочки кишечного тракта и дыхательных путей. В соответствии с входными воротами заболевание человека сибирской язвой протекает в виде кожной (чаще всего, до 98 % всех случаев заболевания), кишечной или легочной форм. Инкубационный период варьирует от нескольких часов до 6 – 8 дней, чаще всего – 2 – 3 дня. Кожная форма проявляется в виде сибиреязвенного карбункула, который локализуется обычно на открытых частях тела (лицо, шея, верхние конечности), реже – на участках тела, закрытых одеждой. Карбункул – своеобразный очаг геморрагического некроза, на верхушке которого образуется пузырек с серозно-кровянистым содержимым или плотный черно-бурого цвета струп. Кожа и подкожная клетчатка карбункула и вокруг него отечны, пропитаны серозно-кровянистым экссудатом, но нагноения и абсцессов обычно не наблюдается. В воспаленных тканях и экссудате – большое количество бацилл, окруженных капсулой.

При кишечной форме наблюдается общая интоксикация с катаральными и геморрагическими проявлениями со стороны желудочно-кишечного тракта (тошнота, рвота с примесью крови, кровяной понос, боли в животе и пояснице). Болезнь длится 2 – 4 дня и чаще всего заканчивается смертью.

Легочная форма сибирской язвы встречается исключительно редко и протекает по типу бронхо-пневмонии с глубокой общей интоксикацией, болью в груди, общим недомоганием, высокой температурой, кашлем с выделением мокроты, вначале слизистой, затем кровянистой. Смерть наступает на 2 – 3-й день. Как правило, все формы сибирской язвы сопровождаются высокой температурой (39 – 40 °C). Наиболее тяжело протекает сибирская язва в септической форме, которая может быть как первичной, так и следствием осложнения другой формы болезни. Она характеризуется обилием геморрагических проявлений и наличием большого количества возбудителя в крови, ликворе и в ряде органов больного человека. Заболевания сибирской язвой среди людей носят спорадический характер.

Постинфекционный иммунитет связан с появлением антитоксинов и антимикробных (протективных) антител.

Лабораторная диагностика. Материалом для исследования служат: при кожной форме – содержимое пузырьков, отделяемое карбункула или язвы; при кишечной – испражнения и моча; при легочной – мокрота; при септической – кровь. Исследованию могут подвергаться различные объекты внешней среды (почва, вода), пищевые продукты, сырье животного происхождения и прочий материал. Для обнаружения возбудителя используют бактериоскопический метод: обнаружение грамположительных палочек, окруженных капсулой (в материале от животных или человека) или содержащих споры (объекты внешней среды). Основной метод диагностики – бактериологический – выделение чистой культуры и ее идентификация, с обязательной проверкой на патогенность для лабораторных животных. В случаях, когда исследуемый материал сильно загрязнен сопутствующей, особенно гнилостной, микрофлорой, используют биологическую пробу: подкожно заражают белых мышей или морских свинок. При наличии B. anthracis мыши и морские свинки погибают через 24 – 26 ч, кролики – через 2 – 3 сут., при явлениях общего сепсиса; селезенка резко увеличена, в месте введения материала – инфильтрат. В препаратахмазках из крови и органов – капсульные палочки.

Из числа серологических реакций с диагностической целью применяется главным образом реакция термопреципитации Асколи. Ее используют в тех случаях, когда трудно рассчитывать на выделение чистой культуры возбудителя (в частности, при исследовании шерсти, шкур, щетины и прочих предметов). Реакция Асколи основана на обнаружении термостабильных антигенов возбудителя, которые сохраняются гораздо дольше, чем жизнеспособные вегетативные клетки и споры сибиреязвенной палочки. Для ретроспективной диагностики сибирской язвы используют аллергическую пробу с антраксином.

Лечение больных сибирской язвой носит комплексный характер. Оно направлено на обезвреживание токсина и против возбудителя: применяют противосибиреязвенный иммуноглобулин и антибиотики (пенициллины, тетрациклины, эритромицин и др.).

Специфическая профилактика. Впервые вакцина против сибирской язвы была получена Л. Пастером в 1881 г., в нашей стране – Л. С. Ценковским в 1883 г. из ослабленных штаммов B. anthracis. В настоящее время в России для профилактики сибирской язвы у людей и животных применяют живую споровую бескапсульную вакцину СТИ, которая готовится из авирулентного штамма сибиреязвенной палочки. Вакцина высоко эффективна. Прививки проводят однократно накожно или внутрикожно тем лицам, у которых в силу их профессии существует возможность заражения сибирской язвой. Ревакцинацию проводят через год.

Микробиология сапа и мелиоидоза

Сап – острое инфекционное заболевание зоонозной природы, протекающее по типу септикопиемии в острой или хронической форме с образованием пустул, язв, множественных абсцессов в различных тканях и органах. Возбудитель сапа – Burkholderia mallei (по старой классификации – Pseudomonas mallei) был впервые выделен в чистой культуре Ф. Леффлером и Х. Шутцем в 1882 г.

Род Burkholderia отнесен к классу Betaproteobacteria. B. mallei – тонкая прямая или слегка изогнутая палочка с закругленными концами, имеет размеры 2 – 3 мкм в длину и 0,5 – 1,0 мкм в ширину. Жгутиков не имеет, спор и капсул не образует, грамотрицательна. При выращивании на питательных средах склонна к полиморфизму – в препарате могут встречаться колбовидные, нитевидные формы, контуры клеток могут быть неровными. Хорошо окрашивается всеми анилиновыми красителями, при этом часто выявляется биполярность или неравномерность окраски в связи с наличием включений полигидроксимасляной кислоты. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 69 мол %. Строгий аэроб, оптимальная температура для роста 35 – 37 °C, рН 6,8. Хорошо растет на обычных средах с добавлением 4 – 5 % глицерина. В МПБ с глицерином в начале роста образуется равномерное помутнение, на второй день – пристеночный рост, превращающийся в пленку, от которой вниз спускаются нити. На агаре с глицерином при 37 °C уже через сутки появляются плоские полупрозрачные колонии, которые затем сливаются и образуют густые налеты слизистой тягучей массы янтарного цвета. На картофеле через сутки образуются нежные полупрозрачные колонии, которые через неделю сливаются и образуют налет желто-бурого цвета, похожий на мед.

Биохимические свойства выражены слабо и нестабильны. Обычно ферментирует глюкозу, маннит, ксилозу с образованием кислоты, желатин не разжижает. Не образует индола и не восстанавливает нитраты в нитриты. На жидких средах образует сероводород и аммиак. Обладает каталазной активностью. Свертывает, но не пептонизирует молоко. Тест на β-галактозидазу положительный; имеет фермент аргининдигидролазу.

В антигенном отношении родствен возбудителю мелиоидоза и некоторым другим псевдомонадам; в то же время установлено, что различные штаммы возбудителя сапа не однородны по антигенной структуре, содержат специфические полисахаридные и неспецифические нуклеопротеидные антигенные фракции.

Экзотоксина возбудитель сапа не образует. При нагревании возбудителя в течение 1 – 2 ч при 60 °C выделяется эндотоксин, активно действующий на клетки гладких мышц изолированных органов и оказывающий общетоксическое действие.

Эпидемиология. Источник инфекции – больные лошади, иногда мулы, ослы, верблюды, которые заражаются путем прямого контакта. Особо заразны животные с острой формой сапа. Возбудитель содержится в выделениях из кожных повреждений и дыхательной системы. Заражение человека происходит при уходе за больными животными, при контакте с трупами животных или вторично инфицированными объектами (солома, фураж, сбруя и пр.). Возможно внутрилабораторное аэрогенное заражение. Передача инфекции от человека к человеку маловероятна. В России сап уже давно не регистрируется. Заболевание встречается очень редко и ограничено частью Африки и Средним Востоком.

Во внешней среде возбудитель сапа малоустойчив. При температуере 100 °C погибает в течение нескольких минут, при 70 °C – в течение 1 ч. Под действием солнечного света в чистой культуре погибает в течение суток, в выделениях животных сохраняется несколько недель.

Патогенез и клиника. Возбудитель сапа проникает в организм человека через поврежденную кожу, слизистую носа, глаз, а также перорально и аэрогенно. Проникшие палочки сапа сначала размножаются в лимфатических узлах, затем проникают в кровь и распространяются по всему организму. Процесс принимает септикопиемический характер с образованием множественных рассеянных очагов гнойного расплавления, формируются язвы и абсцессы. Реже наблюдается хроническое течение в виде хрониосепсиса с полиартритами и множественными абсцессами в различных органах, в коже, подкожной клетчатке, мышцах, на слизистых оболочках, с явлениями рубцевания и инкапсуляции. Инкубационный период при сапе от 1 до 5 сут., реже 2 – 3 нед. Летальность при острой форме в случае позднего диагноза или отсутствия лечения достигает 100 %, при хронических формах – 50 % и выше.

Иммунитет. В случае перенесенного заболевания формируется кратковременный, преимущественно гуморальный иммунитет. В сыворотке крови больных и реконвалесцентов обнаруживаются агглютинины, преципитины и комплементсвязывающие антитела.

Лабораторная диагностика. Включает в себя микроскопическое исследование (РИФ, окраска по Граму или Романовскому – Гимзе) отделяемого материала из язв, полости носа, пунктата из лимфатического узла или абсцесса, а также бактериологический, серологический, биологический и аллергический методы. Для выделения чистой культуры сеют патологический материал на питательные среды, содержащие картофель и агар, и в бульон с 3 % глицерина. С помощью РПГА и РСК в парных сыворотках больного обнаруживают нарастание титра антител, или с помощью РПГА обнаруживают антиген возбудителя в исследуемом материале.

Для заражения используют морских свинок или хомячков; заражают подкожно, если материал загрязнен сопутствующей микрофлорой; или внутрибрюшинно, если это чистая культура возбудителя сапа. Характерны развитие у зараженных самцов поражения яичек, а также кожные гнойники и язвы. Аллергическая диагностика сапа осуществляется путем внутрикожного введения маллеина, получаемого из возбудителя сапа при его разрушении. В основе пробы лежит реакция гиперчувствительности замедленного типа, результат учитывается через 24 – 48 ч; положительна с 10 – 15-го дня заболевания.

Специфическая профилактика и лечение не разработаны. Для лечения используют антибиотики (тетрациклины, аминогликозиды, рифампицин).

Мелиоидоз – так же, как и сап, протекает по типу тяжелой септикопиемии в острой или хронической форме с образованием абсцессов в различных органах и тканях. Возбудитель был выделен и описан А. Уитмором и К. Кришнасвами в 1912 г.

Возбудитель мелиоидоза – Burkholderia pseudomallei (по старой классификации – Pseudomonas pseudomallei) – грамотрицательная палочка с закругленными концами, размером 0,3 – 0,6 × 3 – 6 мкм, располагается поодиночке или в виде коротких цепочек. В старых культурах встречаются нитевидные, короткие и толстые палочки, коккобактерии и т. д. Спор не образует, свежевыделенные бактерии часто имеют псевдокапсулу. Микроб подвижен; лофотрих, в молодых культурах – монотрих. Как и возбудитель сапа, часто дает биполярное окрашивание, так как имеются расположенные по полюсам включения полигидроксимасляной кислоты. Содержание Г + Ц в ДНК – 69 мол %. Строгий или факультативный аэроб, растет на среде, в которой единственным источником азота является сульфат аммония, а углерода – глюкоза. Оптимальная температура для роста 37 °C, рН среды нейтральная. На МПА с 3 – 5 % глицерина через сутки вырастают блестящие, гладкие S-колонии; в дальнейшем возможна диссоциация, колонии приобретают желтовато-коричневую окраску, становятся складчатыми. В МПБ с глицерином через сутки появляется равномерное помутнение, в последующем образуется осадок без просветления среды, а на 2 – 3-й день на поверхности появляется нежная пленка, прилегающая к стенке пробирки. Затем пленка утолщается и становится складчатой. Многие штаммы возбудителя мелиоидоза при росте на средах вначале издают неприятный гнилостный запах, который затем сменяется приятным ароматом трюфелей. На кровяном агаре иногда дает гемолиз. Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, лактозу и другие углеводы. По мере старения культуры ферментативная активность падает. Разжижает желатин и свернутую сыворотку. Молоко пептонизирует, но не свертывает. Индола не образует. Обладает денитрифицирующим свойством и лецитиназной активностью.

В антигенном отношении возбудитель мелиоидоза довольно однороден. У него обнаружены соматический (О), оболочечный (К), слизистый (М) и жгутиковый (Н) антигены, причем соматический О-антиген родствен О-антигену возбудителя сапа. Возбудитель мелиоидоза образует два термолабильных токсина. Один из них обусловливает геморрагические и некротические поражения, второй – вызывает гибель лабораторных животных (летальный токсин) без повреждения тканей в месте введения.

Эпидемиология. Источником возбудителя инфекции являются грызуны (крысы, мыши), кошки, собаки, козы, овцы, свиньи, коровы, лошади, среди которых могут возникать эпизоотии. В эндемичных районах возбудитель обнаруживают в почве, воде открытых водоемов, загрязненных испражнениями больных животных. Не исключается возможность заражения человека не только контактным, но и алиментарным путем. Больной человек для окружающих не заразен. В России в течение многих десятилетий случаев мелиоидоза среди людей не наблюдается. Заболевание встречается в ряде стран Юго-Восточной Азии, Европы, Африки, Северной и Южной Америки, Австралии.

Возбудитель погибает при температуре 56 °C в течение 30 мин, 1 % раствор фенола или 0,5 % раствор формалина убивают его в течение 10 мин. В воде и почве сохраняется до 1,5 мес., в трупах животных – до 12 дней.

Патогенез и клиника. Заражение человека происходит преимущественно через поврежденную кожу или слизистые оболочки при контакте с водой или почвой, в которых содержится возбудитель мелиоидоза. Инкубационный период от 4 дней до нескольких месяцев. Возбудитель размножается в крови, разносится по всему организму, что приводит к образованию абсцессов в различных органах и тканях.

Течение может быть острым и хроническим. Прогноз всегда серьезный, заболевание может тянуться месяцами и даже годами.

Иммунитет. В крови переболевших мелиоидозом людей обнаруживаются специфические антитела; заболевание протекает на фоне выраженной инфекционной аллергии (ГЧЗ).

Лабораторная диагностика. Используют бактериологический, серологический и биологический методы. Для выделения чистой культуры берут кровь, мокроту, гной из абсцессов, отделяемое из носа и мочу, а также трупный материал. Кровь больных засевают на глицериновый МПБ, любой другой материал – на глицериновый агар. Возбудитель, в отличие от других псевдомонад, устойчив к полимиксину в концентрации 400 мкг/мл.

Наряду с посевом материала на среды заражают морских свинок или хомячков: кровь больных вводят внутрибрюшинно, другой материал – подкожно или путем втирания в скарифицированную кожу. При положительном результате в месте введения развивается отек, некроз, язва, в лимфатических узлах появляются абсцессы. При вскрытии погибшего животного обнаруживаются множественные абсцессы во внутренних органах; из них легко выделить чистую культуру.

Для обнаружения специфических антител в крови больных или переболевших используют РСК, РПГА и реакцию агглютинации. Нарастание титров антител в этих реакциях является важным диагностическим признаком, но и в этом случае не всегда удается дифференцировать мелиоидоз от сапа.

Специфическая профилактика и лечение. Специфическая профилактика не разработана. Общая профилактика сводится к проведению дератизационных мероприятий в местностях, не благополучных по мелиоидозу, предотвращению доступа грызунов к источникам водоснабжения, жилищам и продуктам. Запрещают купание в стоячих водоемах, употребление необеззараженной воды. Больных домашних животных изолируют, проводят лечение (или уничтожают). Для лечения людей используют антибиотики (тетрациклины, левомицетин, канамицин, рифампицин) в сочетании с хирургическим лечением (например, дренирование абсцессов).

Общая характеристика семейства Enterobacteriaceae

Микробиология эшерихиозов

Основной представитель рода Escherichia – E. coli – был впервые обнаружен в 1885 г. Т. Эшерихом, в честь которого этот род бактерий и получил свое название. Ключевые признаки этого рода: перитрихи (или неподвижные), ферментируют лактозу с образованием кислоты и газа (или лактозонегативны), на голодной среде с цитратом не растут, реакция Фогеса – Проскауэра отрицательна, проба с MR положительна, не имеют фенилаланиндезаминазы, не растут на среде с KCN, содержание Г + Ц в ДНК – 50 – 51 мол %.

Род Escherichia включает не менее 7 видов; особое значение в медицине имеет вид E. coli, в частности те его варианты, которые вызывают заболевания человека. Их подразделяют на 2 основные группы: вызывающие внекишечные заболевания и возбудители острых кишечных заболеваний (ОКЗ). Представители первой подразделяются на три патогруппы: 1) менингеальные (MENEC – meningitis E. coli); 2) септицемические (SEPEC – septicemia E. coli) и 3) уропатогенные (UPEC – uropathogenic E. coli). В свою очередь варианты E. coli, вызывающие ОКЗ, вначале были подразделены на 4 следующие категории: энтеротоксигенные E. coli (ETEC); энтероинвазивные E. coli (EIEC); энтеропатогенные E. coli (EPEC) и энтерогеморрагические E. coli (EHEC). Впоследствии были выделены еще две категории: энтероагрегативные E. coli (EAEC) и диффузноагрегативные E. coli (DAEC).

Кроме того, E. coli используется в международных стандартах как показатель степени фекального загрязнения воды, особенно питьевой, и пищевых продуктов (глава 16, с. 154).

Стандартный штамм E. coli (E. coli K-12) широко используется в лабораториях многих стран мира для изучения генетики бактерий.

Культуральные свойства. E. coli – факультативный анаэроб, хорошо растет на обычных питательных средах – колонии на агаре круглые, выпуклые, полупрозрачные. Рост на бульоне в виде диффузного помутнения. Температурный оптимум для роста 37 °C, растет в диапазоне от 10 до 45 °C, оптимальная рН 7,2 – 7,5. На всех дифференциально-диагностических средах колонии E. coli, разлагающей лактозу, окрашены в цвет индикатора (на среде Эндо – темно-малиновые с металлическим блеском, см. цв. вкл., рис. 99, а).

Биохимические свойства. Кишечная палочка в большинстве случаев способна ферментировать следующие углеводы с образованием кислоты и газа: глюкозу, лактозу, маннит, арабинозу, галактозу, иногда сахарозу и некоторые другие углеводы;

образует индол; как правило, не образует H₂S; восстанавливает нитраты в нитриты, не разжижает желатин, не растет на голодной среде с цитратом, дает положительную реакцию с MR и отрицательную – Фогеса – Проскауэра. По этим признакам ее легко можно отличить от возбудителей ряда заболеваний (дизентерии, брюшного тифа, сальмонеллезов и др.). Однако патогенные E. coli ни по культуральным, ни по биохимическим свойствам очень часто не отличаются от непатогенных.

Антигенное строение. E. coli является представителем нормальной микрофлоры кишечного тракта всех млекопитающих, птиц, рептилий и рыб. Поэтому для выяснения вопроса, какие варианты E. coli и почему вызывают эшерихиозы, потребовалось изучить антигенное строение, разработать серологическую классификацию, необходимую для идентификации патогенных серовариантов, и выяснить, какими факторами патогенности они обладают, т. е. почему они способны вызывать различные формы эшерихиозов.

У E. coli обнаружен 171 вариант О-антигенов (О1 – О171), 57 вариантов Н-антигенов (Н1 – Н57) и 90 вариантов поверхностных (капсульных) К-антигенов. Однако в действительности существует 164 группы по О-антигену и 55 серовариантов по Н-антигену, так как некоторые из прежних О: Н-серогрупп были исключены из вида E. coli, но порядковые номера О– и Н-антигенов сохранились неизменными. Антигенная характеристика диареегенных E.coli включает в себя номера О– и Н-антигенов, например, О55:Н6; О157:Н7; О-антиген означает принадлежность к определенной серогруппе, а Н-антиген – ее серовариант. Кроме того, при более углубленном изучении О– и Н-антигенов выявлены так называемые факторные О– и Н-антигены, т. е. их антигенные субварианты, например: H2a, H2b, H2c или O20, O20а, O20ab и т. п. Всего в список диареегенных E. coli включено 43 О-серогруппы и 57 ОН-серовариантов. Список этот (табл. 32) пополняется все новыми серовариантами.

Таблица 32

Классификация диареегенных Escherichia coli

Факторы патогенности E. coli. Способность E. coli вызывать различные заболевания обусловлена наличием у нее следующих факторов патогенности:

1. Факторы адгезии и колонизации. Они необходимы для прикрепления к клеткам ткани и их колонизации. Обнаружено три варианта фактора колонизации: а) CFA/I-CFA/VI (англ. colonization factor) – они имеют фимбриальную структуру; б) EAF (англ. enteropathogenic E. coli adherence factor) – интимин – белок наружной мембраны, кодируется геном eaeA. Обнаружен у EPEC и EHEC, выявляется по способности бактерий прикрепляться к клеткам Hep-2; в) Adhesion Henle-407 – фимбриальные структуры, выявляются по способности бактерий прикрепляться к клеткам Henle-407. Все они кодируются плазмидными генами. Помимо них описаны и другие факторы колонизации, в роли которых могут выступать также бактериальные липополисахариды.

2. Факторы инвазии. С их помощью EIEC и EHEC, например, проникают в эпителиоциты кишечника, размножаются в них и вызывают их разрушение. Роль факторов инвазии выполняют белки наружной мембраны.

3. Экзотоксины. У патогенных E. coli обнаружены экзотоксины, повреждающие мембраны (гемолизин), угнетающие синтез белка (токсин Шига), активизирующие вторичные мессенджеры (англ. messenger – связной) – токсины CNF, ST, CT, CLTD, EAST.

Гемолизины продуцируют разные патогены, в том числе E. coli. Гемолизин – порообразующий токсин. Он вначале связывается с мембраной клетки-мишени, а затем формирует в ней пору, через которую происходит вход и выход небольших молекул и ионов, что ведет к гибели клеток и лизису эритроцитов.

Токсин Шига (STX) был обнаружен вначале у Shigella dysenteriae, а затем сходный токсин (шигаподобный токсин) был обнаружен у EHEC. Токсин (N-гликозидаза) блокирует синтез белка, взаимодействуя с 28S pРНК, в результате чего клетка гибнет (цитотоксин). Различают два типа шигаподобного токсина: STX-1 и STX-2. STX-1 по антигенным свойствам почти идентичен токсину Шига, а STX-2 отличается от токсина Шига по антигенным свойствам и, в отличие от STX-1, не нейтрализуется антисывороткой к нему. Синтез цитотоксинов STX-1 и STX-2 контролируется у E. coli генами умеренных конвертирующих профагов 9331 (STX-1) и 933W (STX-2).

Токсин L (термолабильный токсин) – АДФ-рибозилтрансфераза; связываясь с Gбелком, вызывает диарею.

Токсин ST (термостабильный токсин), взаимодействуя с рецептором гуанилатциклазы, стимулирует ее активность и вызывает диарею.

CNF (цитотоксический некротический фактор) – белок деамидаза, повреждает так называемые RhoG-белки. Этот токсин обнаружен у UPEC, вызывающих инфекции мочевыводящих путей.

CLTD-токсин – цитолетальный разрыхляющий токсин. Механизм действия изучен слабо.

Токсин EAST – термостабильный токсин энтероагрегативных E. coli (EAEC), вероятно, подобен термостабильному токсину (ST).

4. Эндотоксины-липополисахариды. Они определяют антигенную специфичность бактерий (которая детерминируется повторяющейся боковой цепочкой сахаров) и форму колоний (утрата боковых цепочек приводит к превращению S-колоний в R-колонии).

Таким образом, факторы патогенности E. coli контролируются не только хромосомными генами клетки-хозяина, но и генами, привносимыми плазмидами или умеренными конвертирующими фагами. Все это свидетельствует о возможности возникновения патогенных вариантов E. coli в результате распространения среди них плазмид и умеренных фагов. Ниже дана краткая характеристика 4 категорий E. coli, вызывающих ОКЗ; сведений о недавно выделенных категориях DAEC и EAEC в доступных нам источниках не найдено.

ETEC включает 17 серогрупп. Факторы адгезии и колонизации фимбриальной структуры типа CFA и энтеротоксины (LT или ST, или оба) кодируются одной и той же плазмидой (плазмидами). Колонизируют ворсинки без их повреждения. Энтеротоксины вызывают нарушение водно-солевого обмена. Локализация процесса – область тонкой кишки. Заражающая доза 10⁸– 10¹⁰ клеток. Заболевание протекает по типу холероподобной диареи. Тип эпидемий – водный, реже пищевой. Болеют дети в возрасте от 1 года до 3 лет и взрослые.

EIEC включает 9 серогрупп, патогенность связана со способностью внедряться в эпителиальные клетки слизистой оболочки кишечника и размножаться внутри них, вызывая их разрушение. Эти свойства кодируются, помимо хромосомных генов, генами плазмиды (140 МД). Плазмида кодирует синтез белков наружной мембраны, которые и определяют инвазию. Как сама плазмида, так и белки, которые она кодирует, родственны таковым у возбудителей дизентерии, чем и объясняется сходство EIEC с шигеллами. Заражающая доза 10⁵ клеток. Локализация процесса – нижний отдел подвздошной и толстая кишка. Заболевание протекает по типу дизентерии: вначале водянистая диарея, затем колитический синдром. Болеют дети 1,5 – 2 лет, подростки и взрослые. Тип вспышек – пищевой, водный.

EPEC. Группа включает 9 серогрупп класса 1 и четыре серогруппы класса 2. У серогрупп класса 1 имеется плазмида (60 МД), которая контролирует синтез фактора адгезии и колонизации типа EAF. Он представлен белком, локализованным в наружной мембране, и выявляется по способности бактерий прикрепляться к клеткам HЕp-2. Белок имеет м. м. 94 кД. У серогрупп класса 2 эта плазмида отсутствует, их патогенность обусловлена какими-то иными факторами. У некоторых штаммов EPEC обоих классов обнаружена способность синтезировать STX. EPEC колонизируют плазмолемму энтероцитов, вызывают повреждение поверхности эпителия с образованием эрозий и умеренного воспаления. Заражающая доза 10⁵– 10¹¹ клеток. Процесс локализуется в области тонкой кишки. Для заболевания характерны водянистая диарея и выраженное обезвоживание. Болеют в основном дети первого года жизни. Способ заражения – контактно-бытовой, реже пищевой.

Серогруппы EIEC и EPEC – наиболее частые виновники внутрибольничных вспышек.

ЕНЕС продуцируют цитотоксины STX-1 и STX-2. Вызывают у людей геморрагический колит с тяжелыми осложнениями в виде гемолитической уремии и тромботической тромбоцитопенической пурпуры. Токсины разрушают клетки эндотелия мелких кровеносных сосудов. Образование сгустков крови и выпадение фибрина приводят к нарушению кровотока, кровотечению, ишемии и некрозу в клеточной стенке. Уремический гемолитический синдром может привести к летальному исходу. ЕНЕС представлены многими серотипами (~150), но главную эпидемиологическую роль играют E. coli O157:H7 и ее безжгутиковый мутант E. coli O157:NM, так как только они образуют STX. Эти штаммы бактерии могут выделять только один из цитотоксинов или оба одновременно. Полагают, что естественным резервуаром сероваров ЕНЕС, в том числе E. coli O157:H7, являются крупный рогатый скот и овцы. Наиболее частый путь заражения – пищевой (мясо, особенно фарш; молоко). E. coli O157:H7 необычайно устойчива к неблагоприятным факторам. Это способствует ее выживанию и размножению в разных продуктах. Возможно заражение контактно-бытовым путем. Начало болезни острое: возникают кишечные спазмы, затем понос, вначале водянистый, потом – с кровью. Болеют дети и взрослые. Больной человек заразен.

Лабораторная диагностика эшерихиозов основана на выделении чистой культуры возбудителя и его идентификации, а также на тестировании токсинов с помощью

ПЦР. Возбудителя эшерихиозов идентифицируют с помощью набора поливалентных OK-сывороток и набора адсорбированных сывороток, содержащих антитела только к определенным антигенам. Для идентификации EIEC можно использовать кератоконъюнктивальную пробу. Некоторые представители EIEC неподвижны, не ферментируют лактозы и салицина. Идентификации E. coli О157:H7 помогает ее неспособность ферментировать сорбит (применяют среду Эндо с сорбитом вместо лактозы). Но лучше всего для идентификации и дифференциации возбудителей ОКЗ (всех категорий) использовать тест-системы ПЦР. При необходимости у выделенных возбудителей определяют чувствительность к антибиотикам.

Лечение. Используют различные антибиотики. Для восстановления нарушенного водно-солевого обмена применяют оральные солевые растворы. Их выпускают в целлофановых пакетах в виде порошков, содержащих NaCl – 3,5 г; NaHCO₃ – 2,5 г; KCl – 1,5 г и глюкозы – 20,0 г и растворяемых в 1 литре воды.

Микробиология брюшного тифа

Брюшной тиф – тяжелое острое инфекционное заболевание, характеризующееся глубокой общей интоксикацией, бактериемией и специфическим поражением лимфатического аппарата тонкого кишечника. Интоксикация проявляется сильной головной болью, помрачением сознания, бредом (тиф от греч. typhos – туман). Брюшной тиф как самостоятельную нозологическую единицу впервые попытался выделить русский врач А. Г. Пятницкий еще в 1804 г., но окончательно это сделал в 1822 г. Р. Бретонно, который дифференцировал эту болезнь от туберкулеза кишечника и высказал предположение о контагиозной природе брюшного тифа.

Возбудитель брюшного тифа – Salmonella typhi – был обнаружен в 1880 г. К. Эбертом, а выделен в чистой культуре в 1884 г. К. Гаффки. Вскоре были выделены и изучены возбудители паратифов А и В – S. paratyphi A и S. paratyphi B. Род Salmonella включает в себя большую группу бактерий, но только три из них – S. typhi, S. paratyphi A и S. paratyphi B – вызывают заболевание у человека с клинической картиной брюшного тифа. Морфологически они неразличимы – короткие грамотрицательные палочки с закругленными концами, длиной 1 – 3,5 мкм, диаметром 0,5 – 0,8 мкм (см. цв. вкл., рис. 100.2); спор и капсул не образуют, обладают активной подвижностью (перитрихи). Содержание Г + Ц в ДНК составляет 50 – 52 мол %.

Возбудители брюшного тифа и паратифов – факультативные анаэробы, температурный оптимум для роста 37 °C (но могут расти в диапазоне от 10 до 41 °C), рН 6,8 – 7,2; не требовательны к питательным средам. Рост на бульоне сопровождается помутнением, на МПА образуются нежные круглые, гладкие, полупрозрачные колонии диаметром 2 – 4 мм. Однако колонии S. typhi, имеющие Vi-антиген, мутные. Колонии S. paratyphi B более грубые, через несколько дней у них по периферии формируются своеобразные валики. На средах Эндо колонии всех трех сальмонелл бесцветны (см. цв. вкл., рис. 99б), на висмут-сульфит-агаре – черного цвета. В случае диссоциации на плотных средах вырастают колонии R-формы. Избирательной средой для возбудителей брюшного тифа и паратифов является желчь или желчный бульон.

Биохимические свойства. Возбудители брюшного тифа и паратифов дают положительную реакцию с MR, не образуют индола, не разжижают желатин, восстанавливают нитраты в нитриты, не образуют ацетоина. S. typhi не растет на голодном агаре с цитратом. Основные биохимические различия между возбудителями брюшного тифа и паратифов заключаются в том, что S. typhi ферментирует глюкозу и некоторые другие углеводы с образованием только кислоты, а S. paratyphi A и S. paratyphi B – с образованием и кислоты, и газа (табл. 33).

Таблица 33

Биохимические свойства E. coli, S. typhi, S. paratyphi A и S. paratyphi B

Примечание.К – образование кислоты; КГ – образование кислоты и газа; (+) – признак постоянный; (±) – признак непостоянный; ( – ) – признак отсутствует.

S. typhi по способности ферментировать ксилозу и арабинозу подразделяют на четыре биохимических типа:

Антигенное строение. Сальмонеллы имеют О– и Н-антигены. По О-антигенам они разделяются на большое количество серогрупп, а по Н-антигенам – на серотипы (подробнее о серологической классификации сальмонелл см. в следующем разделе). S. typhi, S. paratyphi A и S. paratyphi B отличаются друг от друга как по О-антигенам (относятся к разным серогруппам), так и по Н-антигенам.

В 1934 г. А. Феликс и Р. Питт установили, что S. typhi помимо О– и Н-антигенов имеет еще один поверхностный антиген, который они назвали антигеном вирулентности (Vi-антигеном). По химической природе Vi-антиген отличается от О– и Н-антигенов, он состоит из трех различных фракций, но его основу составляет сложный полимер N-ацетилгалактозаминоуроновая кислота с м. м. 10 МД. Vi-антиген, как правило, обнаруживается у свежевыделенных культур, но он легко утрачивается под влиянием различных факторов (в частности, при выращивании при температуре выше 40 °C и ниже 20 °C, на средах с карболовой кислотой и т. п.), при длительном хранении культур, разрушается при температуре 100 °C в течение 10 мин. Поскольку он располагается более поверхностно, чем О-антиген, его наличие препятствует агглютинации культуры S. typhi О-специфической сывороткой, поэтому такую культуру обязательно проверяют в реакции агглютинации с Vi-сывороткой. Напротив, утрата Vi-антигена ведет к освобождению О-антигена и восстановлению О-агглютинации, но при этом утрачивается Vi-агглютинация. Количественное содержание Vi-антигена у S. typhi может сильно варьировать, поэтому Ф. Кауффманн предложил классифицировать S. typhi по содержанию Vi-антигена на три группы:

1) чистые v-формы (нем. viel – много);

2) чистые w-формы (нем. wenig – мало);

3) промежуточные vw-формы.

Обнаружены 3 необычных мутанта S. typhi: Vi-I – R-форма, клетки лишены Ни О-антигенов, но стойко сохраняют Vi-антиген; О-901 – лишен Н– и Vi-антигенов; Н-901 – содержит О– и Н-антигены, но лишен Vi-антигена. Все три антигена: О-, Ни Vi– имеют выраженные иммуногенные свойства. Наличие Vi-антигенов позволяет подвергать культуры S. typhi фаготипированию. Есть 2 типа фагов, лизирующих только те культуры, которые содержат Vi-антиген: Vi-I – универсальный фаг, лизирует большинство Vi-содержащих культур S. typhi; и набор Vi-II-фагов, лизирующих избирательно культуры S. typhi. Впервые это было показано в 1938 г. Дж. Крейджем и К. Иеном. С помощью Vi-фагов II типа они разделили S. typhi на 11 фаготипов. К 1987 г. было выявлено уже 106 различных Vi-фаготипов S. typhi. Чувствительность их к соответствующим фагам является стабильным признаком, поэтому фаготипирование имеет важное эпидемиологическое значение.

Разработаны также схемы фаготипирования S. paratyphi A и S. paratyphi B, по которым они разделяются на десятки фаготипов. Существенно, что фаготипы сальмонелл могут ни по каким другим признакам не отличаться друг от друга.

Резистентность. Возбудители брюшного тифа и паратифов во внешней среде (вода, почва, пыль) сохраняются, в зависимости от условий, от нескольких дней до нескольких месяцев. В проточной воде могут выживать до 10 дней, в застойной – до 4 нед., на овощах и фруктах – 5 – 10 дней, на посуде – до 2 нед., в масле, сыре – до 3 мес., во льду – до 3 мес. и больше; нагревание при температуре 60 °C убивает через 30 мин, а кипячение – мгновенно. Обычные химические дезинфектанты убивают их через несколько минут. Содержание в водопроводной воде активного хлора в дозе 0,5 – 1,0 мг/л или озонирование воды обеспечивают ее надежное обеззараживание как от сальмонелл, так и от других патогенных кишечных бактерий.

Факторы патогенности. Важнейшей биологической особенностью возбудителей брюшного тифа и паратифов А и В является их способность противостоять фагоцитозу и размножаться в клетках лимфоидной системы. Экзотоксинов они не образуют. Основным фактором патогенности их, помимо Vi-антигена, является эндотоксин, отличающийся необычно высокой токсичностью. Такие факторы патогенности, как фибринолизин, плазмокоагулаза, гиалуронидаза, лецитиназа и т. п., обнаруживаются у возбудителей брюшного тифа и паратифов очень редко. С наибольшей частотой встречается ДНК-аза (у 75 – 85 % изученных культур S. typhi и S. paratyphi B). Установлено, что штаммы S. typhi, имеющие плазмиду с м. м. 6 МД, обладают более высокой вирулентностью. Поэтому вопрос о факторах патогенности этих сальмонелл остается еще мало изученным.

Эпидемиология. Источником брюшного тифа и паратифа А является только человек, больной или бактерионоситель. Источником паратифа В, кроме человека, могут быть и животные, в том числе птицы. Механизм заражения – фекальнооральный. Заражающая доза S. typhi 105 клеток (вызывает заболевание 50 % добровольцев), заражающие дозы сальмонелл паратифов А и В значительно выше. Заражение происходит главным образом в результате прямого или непрямого контакта, а также через воду или пищу, особенно молоко. Наиболее крупные эпидемии вызывало инфицирование возбудителями водопроводной воды (водные эпидемии).

Особенности патогенеза и клиники. Инкубационный период при брюшном тифе 15 дней, но он может варьировать от 7 до 25 дней. Это зависит от заражающей дозы, вирулентности возбудителя и иммунного статуса больного. Патогенез и клиническая картина брюшного тифа и паратифов А и В очень сходны. В развитии болезни четко выявляются следующие стадии:

1) стадия вторжения. Возбудитель через рот проникает в тонкий кишечник;

2) через лимфатические пути сальмонеллы проникают в лимфоидные образования подслизистой оболочки тонкого кишечника (пейеровы бляшки и солитарные фолликулы) и, размножаясь в них, вызывают лимфангоит и лимфаденит (своеобразные брюшно-тифозные гранулы);

3) бактериемия – выход возбудителя в большом количестве в кровь. Стадия бактериемии начинается в конце инкубационного периода и может (в отсутствие эффективного лечения) продолжаться в течение всей болезни;

4) стадия интоксикации наступает вследствие распада бактерий под действием бактерицидных свойств крови и высвобождения эндотоксинов;

5) стадия паренхиматозной диффузии. Из крови сальмонеллы поглощаются макрофагами костного мозга, селезенки, лимфатических узлов, печени и других органов. В большом количестве возбудитель брюшного тифа накапливается в желчных ходах печени и в желчном пузыре, где он находит благоприятные условия для своего размножения и где бактерицидные свойства крови ослаблены влиянием желчи;

6) выделительно-аллергическая стадия. По мере формирования иммунитета начинается процесс освобождения от возбудителя. Этот процесс осуществляют все железы: слюнные, кишечника, потовые, молочные (во время кормления ребенка), мочевыделительная система и особенно активно – печень и желчный пузырь. Выделяющиеся из желчного пузыря сальмонеллы опять поступают в тонкий кишечник, откуда часть их выделяется с испражнениями, а часть вторгается вновь в лимфатические узлы. Вторичное внедрение в уже сенсибилизированные узлы вызывает в них гиперергическую реакцию, которая проявляется в виде некроза и образования язв (см. цв. вкл., рис. 100.1). Эта стадия опасна возможностью прободения стенки кишечника (язв), внутреннего кровотечения и развития перитонита;

7) стадия выздоровления. Процесс заживления язв происходит без возникновения обезображивающих рубцов на местах, очистившихся от некротических налетов. В свою очередь, в клинической картине болезни различают следующие периоды:

I – начальная стадия – stadium incrementi (1-я неделя): постепенное повышение температуры до 40 – 42 °C, нарастание интоксикации и других проявлений болезни.

II – стадия максимального развития всех симптомов – stadium acme (2 – 3-я недели болезни): температура держится на высоком уровне;

III – стадия спада болезни – stadium decrementi (4-я неделя болезни): постепенное снижение температуры и ослабление проявления других симптомов;

IV – стадия выздоровления.

На 8 – 9-й день болезни, а иногда и позднее, у многих больных появляется розеолезная сыпь на коже живота, груди и спины. Появление сыпи (мелких красных пятен) является следствием местных продуктивно-воспалительных процессов аллергической природы в поверхностных слоях кожи около лимфатических сосудов, которые в изобилии содержат возбудителя болезни. Клиническое выздоровление не всегда совпадает с бактериологическим. Примерно 5 % переболевших становятся хроническими носителями сальмонелл тифа или паратифов. Причины, лежащие в основе длительного (более 3 мес., а иногда многие годы) носительства сальмонелл, остаются неясными. Известное значение в формировании носительства играют местные воспалительные процессы в желчевыводящих (иногда в мочевыводящих) путях, которые часто возникают в связи с тифо-паратифозными инфекциями или обостряются в результате этих инфекций. Однако не менее важную роль в формировании длительного носительства сальмонелл брюшного тифа и паратифов А и В играет L-трансформация их. L-формы сальмонелл утрачивают Н-, частично Ои Vi-антигены, располагаются, как правило, внутриклеточно (внутри макрофагов костного мозга), поэтому становятся не доступными ни для химиопрепаратов, ни для антител и могут длительно персистировать в организме переболевшего человека. Возвращаясь в исходные формы и полностью восстанавливая свою антигенную структуру, сальмонеллы вновь становятся вирулентными, вновь проникают в желчные ходы, вызывают обострение процесса бактерионосительства, выделяются с испражнениями, а такой носитель становится источником заражения для окружающих. Не исключено также, что формирование бактерионосительства зависит от какого-то дефицита иммунной системы.

Постинфекционный иммунитет прочный, продолжительный, повторные заболевания брюшным тифом и паратифами бывают редко. Иммунитет обусловлен появлением антител к Vi-, O– и H-антигенам, клеток иммунной памяти и повышением активности фагоцитов. Поствакцинальный иммунитет, в отличие от постинфекционного, непродолжителен (около 12 мес.).

Лабораторная диагностика. Самым ранним и основным методом диагностики брюшного тифа и паратифов является бактериологический – получение гемокультуры или миелокультуры. С этой целью исследуют кровь или пунктат костного мозга. Кровь лучше засевать на среду Рапопорт (желчный бульон с добавлением глюкозы, индикатора и стеклянного поплавка) в соотношении 1: 10 (на 10 мл среды 1 мл крови). Посев следует инкубировать при температуре 37 °C не менее 8 дней, а с учетом возможного наличия L-форм – до 3 – 4 нед. Для идентификации выделенной культуры сальмонелл используют (с учетом их биохимических свойств) диагностические адсорбированные сыворотки, содержащие антитела к антигенам О2 (S. paratyphi A), О4 (S. paratyphi B) и О9 (S. typhi). Если выделенная культура S. typhi не агглютинируется О9-сывороткой, ее необходимо проверить с Vi-сывороткой.

Для выделения S. typhi можно использовать экссудат, полученный путем скарификации розеол – вырастают розеолокультуры.

Бактериологическое исследование испражнений, мочи и желчи проводят для подтверждения диагностики, контроля бактериологического выздоровления при выписке реконвалесцентов и для диагностики бактерионосительства. В этом случае материал предварительно засевают на среды обогащения (среды, содержащие химические вещества, например селенит, которые угнетают рост E. coli и других представителей микрофлоры кишечника, но не угнетают роста сальмонелл), а затем со среды обогащения – на дифференциально-диагностические среды (Эндо, висмут-сульфит-агар) с целью выделения изолированных колоний и получения из них чистых культур, идентифицируемых по указанной выше схеме. Для обнаружения О– и Viантигенов в сыворотке крови и испражнениях больных могут быть использованы РСК, РПГА с антительным диагностикумом, реакции коагглютинации, агрегат-гемагглютинации, ИФМ. Для ускоренной идентификации S. typhi перспективно применение в качестве зонда фрагмента ДНК, несущего ген Vi-антигена (время идентификации 3 – 4 ч).

С конца 1-й недели болезни в сыворотке больных появляются антитела, поэтому для диагностики брюшного тифа в 1896 г. Ф. Видалем была предложена реакция развернутой пробирочной агглютинации. Динамика содержания антител к S. typhi своеобразна: раньше всего появляются антитела к О-антигену, но титр их быстро снижается после выздоровления; Н-антитела появляются позднее, но зато сохраняются после болезни и прививок годами. С учетом этого обстоятельства реакцию Видаля ставят одновременно с раздельными О– и Н-диагностикумами (а также с паратифозными А– и В-диагностикумами) для исключения возможных ошибок, связанных с прививками или ранее перенесенным заболеванием. Однако специфичность реакции Видаля недостаточно высока, поэтому более предпочтительным оказалось применение РПГА, в которой эритроцитарный диагностикум сенсибилизирован либо О– (для обнаружения О-антител), либо Vi-антигеном (для обнаружения Vi-антител). Наиболее надежной и специфической является последняя реакция (Vi-гемагглютинации).

Диагностика бактерионосительства. Единственным доказательством бактерионосительства является выделение от носителя культур S. typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi B. Материалом для исследования являются дуоденальное содержимое, испражнения и моча. Сложность проблемы заключается в том, что у носителей возбудитель не всегда выделяется с этими субстратами, бывают паузы, и довольно продолжительные. В качестве вспомогательных методов, которые позволяют сузить круг обследуемых лиц, используют серологические реакции (одновременное обнаружение О-, Н-, Vi– или О-, Vi-антител говорит о возможном присутствии возбудителя в организме) и аллергическую кожную пробу с Vi-тифином. Последний содержит Vi-антиген, который при взаимодействии с Vi-антителами дает местную аллергическую реакцию в виде покраснения и припухлости в течение 20 – 30 мин. Положительная реакция с Vi-тифином свидетельствует о наличии в организме Vi-антител и о возможном присутствии S. typhi. Для идентификации L-форм S. typhi предложены специальные иммунофлуоресцирующие антитела (к антигенам L-форм возбудителя). Оригинальный метод выявления бактерионосителей был предложен В. Муром. Он заключается в исследовании тампонов, одновременно забрасываемых в канализационные люки на всем протяжении канализационной сети населенного пункта.

Лечение. Для лечения больных брюшным тифом применяют различные антибиотики, к которым возбудители проявляют высокую чувствительность (левомицетин, ампициллин, тетрациклины и др.). Антибиотики снижают тяжесть течения болезни и сокращают ее продолжительность. Однако перенос R-плазмид сальмонеллам от E. coli или других энтеробактерий может привести к появлению среди них опасных эпидемических клонов.

Специфическая профилактика. Вместо семи различных брюшно-тифозных вакцин, применявшихся ранее, с 1978 г. в нашей стране выпускается только одна – химическая сорбированная брюшно-тифозная моновакцина. Однако в связи с тем, что брюшной тиф из эпидемического заболевания перешел в разряд спорадических (а это стало возможным, прежде всего, благодаря улучшению систем водоснабжения и канализации и повышению санитарной культуры населения), необходимость массовой иммунизации против него отпала. Поэтому прививки проводят только в случае эпидемических показаний.