Book: Медицинская микробиология, иммунология и вирусология



Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Сергей Бабичев, Александр Коротяев

Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

ПРЕДИСЛОВИЕ

В учебник внесены существенные дополнения и уточнения на основании опубликованных за последние годы новых научных данных. В частности, в соответствии с новым Определителем бактерий Берги (George M. Garrity, Julia A. Bell, Timothy G. Lilburn. Taxonomic Outline of the Prokaryotes. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition. Release 5.0, May 2004) уточнена классификация бактерий: их принадлежность к доменам, типам и классам, а для многих бактерий, которые чаще всего вызывают заболевания у людей и о которых идет речь в учебнике, к семействам, родам и видам. Приведены сведения о возбудителе так называемой атипичной пневмонии, уточнены сведения о хантавирусах, вирусе TTV, возможных механизмах возникновения нового пандемического варианта вируса гриппа A, новейших молекулярно-биологических методах диагностики инфекционных болезней (геномная дактилоскопия, варианты ПЦР и др.). Полнее описаны особенности генетического контроля синтеза факторов патогенности у бактерий, мобильные генетические элементы и «острова патогенности», роль конвертирующих фагов, плазмид вирулентности, IS-элементов и транспозонов в горизонтальной передаче генов патогенности у бактерий. Представлены данные о новых синтетических индукторах синтеза эндогенного интерферона, которые используют для лечения вирусных инфекций. Внесены также уточнения и дополнения во многие другие разделы учебника. Специальный раздел учебника посвящен руководителям кафедр микробиологии многих медицинских вузов России за всю историю этих кафедр. Авторы выражают глубокую благодарность нынешним руководителям кафедр микробиологии, любезно предоставившим необходимые сведения обо всех своих коллегах-предшественниках. 5-е издание учебника отличается от предыдущих тем, что в нем, помимо неизбежных уточнений и дополнений, связанных с накоплением новых научных данных, полностью переработана заключительная глава (глава 74). Она посвящена обсуждению той роли, которую сыграли две главные системы информации – генетическая, присущая всем живым существам, и умственная (интеллектуальная), свойственная исключительно человеку, в возникновении и развитии как биологической, так и общественной, социальной жизни.

Система умственной информации возникла в ходе эволюции предка человека в сторону Homo sapiens благодаря тем генетическим предпосылкам, которые привели к образованию двух новых аппаратов – мышления и голосового, а вместе с ними к возникновению главной кодовой единицы новой, умственной системы информации – слова. Слово (словесный код) и стало главным «орудием разума», как его определил Л. Н. Толстой.

Умственная информация, в отличие от генетической, не передается по наследству. Она формируется заново у каждого человека в течение всей его жизни. С помощью словесного кода эта информация материализуется и поэтому передается от поколения к поколению, определяя форму уклада общественной жизни.

Авторы заранее благодарят читателей за критические замечания, которые могут быть высказаны по обсуждаемым вопросам, отдавая себе полный отчет в том, что все эти вопросы будут еще долгое время занимать умы многих людей и окончательный ответ на них будет получен лишь в результате новых научных достижений. В подготовке к изданию учебника оказали неоценимую помощь наши дорогие жены Р. А. Коротяева и Н. В. Бабичева, сыновья А. И. Коротяева Борис и Михаил, а также Т. Л. Коротяева. Без их огромной поддержки и помощи мы вряд ли смогли бы осилить такую работу. Мы безгранично благодарны им за все.

Авторы

ВВЕДЕНИЕ

Прежде чем приступить к изучению той или иной науки, будущий специалист должен убедиться в том, что эти знания действительно необходимы для его успешной деятельности. Для чего нужно будущему врачу изучать микробиологию, иммунологию и вирусологию? Во-первых, чтобы узнать о природе так называемых заразных (инфекционных) болезней, о том, какие микроорганизмы и каким образом их вызывают. Во-вторых, для овладения современными методами их диагностики, эффективными способами профилактики и лечения. Все эти вопросы, безусловно, имеют громадное прикладное значение. Наконец, изучение иммунологии дает возможность узнать, какими мощными естественными механизмами самозащиты и самоисцеления, с помощью которых, главным образом, поддерживается на протяжении всей жизни состояние здоровья и осуществляется противостояние болезням, обладает наш организм.

Природа многообразна и едина. Все, что ее составляет, взаимосвязано. В конечном счете между собою взаимодействуют все живые существа, и, вместе с тем, на них воздействуют различные абиотические факторы окружающей среды.

Здоровье человека – это бесценный дар природы, но оно постоянно подвергается атаке со стороны самых различных внешних сил, которые и вызывают болезни. Организм человека как бы постоянно балансирует между состоянием здоровья и болезнью, переход между которыми может быть незаметным, постепенным. Это хорошо понимали врачи древности. Гален (131 – 211): «Здоровье есть состояние, при котором тело человека по натуре и по сочетанию (частиц) таково, что все исходящие от него действия (совершаются) здраво и полностью. Болезнь есть состояние человеческого тела противоположное этому, а (третье) состояние не есть ни здоровье, ни болезнь».

Авиценна (XI в. н. э.): «Бывает тело, здоровое до предела, тело здоровое, но не до предела; тело не здоровое, но и не больное… затем тело в хорошем состоянии, быстро воспринимающее здоровье; затем – тело, больное легким недугом, затем – тело, больное до предела».

Существуют различные определения болезни, однако самое простое, лаконичное и понятное для всех определение дал Карл Маркс. По его мнению, болезнь – это «стесненная в своей свободе жизнь». Но из этого следует, что здоровье – это ничем не стесненное проявление жизни.

Наиболее полное определение здоровья дано специалистами Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ): «Здоровье – это состояние полного физического, психического и социального благополучия, а не только отсутствие болезней или физических дефектов». Причин болезней, а стало быть самих болезней, очень много. Но факторы (причины), их вызывающие, можно свести к нескольким категориям:

– механические повреждения, являющиеся причиной многочисленных травматических заболеваний;

– физические факторы, среди которых наибольшую опасность представляет радиоактивное облучение;

– химические факторы. Загрязнение окружающей среды (воздуха, воды, почвы) вредными для здоровья живых существ химическими веществами уже привело к экологической катастрофе, выход из которой возможен только усилиями всех стран мира;

– биологические факторы, прежде всего микроорганизмы, являющиеся причиной инфекционных болезней;

– особую группу составляют наследственные заболевания, в основе которых лежат передача родителями по наследству поврежденных генов или нарушение механизмов обмена генами.

Инфекционных, т. е. вызываемых микроорганизмами, заболеваний очень много. Практически ими болеет в течение своей жизни хотя бы раз, а то и несколько каждый человек. К микроорганизмам относятся живые существа, размеры которых столь малы, что они не видны невооруженным глазом.

Медицинская микробиология изучает морфологию, физиологию обмена веществ, факторы патогенности, механизмы их реализации на клеточном и молекулярно-генетическом уровнях у возбудителей инфекционных заболеваний человека и разрабатывает специфические методы их диагностики, лечения и профилактики.

Медицинская вирусология – наука, изучающая молекулярно-генетическую структуру вирусов, их свойства, механизм взаимодействия с клеткой, их роль в жизни человека как возбудителей различных инфекционных заболеваний, а также разрабатывает методы специфической диагностики, лечения и профилактики этих болезней. В методическом отношении вирусология существенно отличается от микробиологии, поскольку вирусы, в отличие от других микробов, не размножаются на искусственных питательных средах, и для их культивирования используют другие приемы.

Иммунология – наука, изучающая биологические механизмы самозащиты организма, направленные на распознавание и уничтожение с помощью специальных иммунных систем любых чужеродных веществ и клеток, проникающих в него или образующихся в нем, и способствующие поддержанию его структурной и функциональной целостности и биологической индивидуальности. Основную роль в формировании и сохранении иммунитета играют системы интерферонов, макрофагов, комплемента, Т– и В-лимфоцитов; различные киллерные клетки, главная система гистосовместимости и антитела. Для изучения функций этих систем иммунология использует свои особые методы. Предметом иммунологии является также разработка специфических методов диагностики, лечения и профилактики различных болезней и изучение заболеваний самой иммунной системы.

Теоретическое значение изучения этих наук трудно переоценить. Достижения микробиологии, вирусологии, в особенности генетики микроорганизмов, а также иммунологии позволили понять фундаментальные процессы жизнедеятельности, протекающие на молекулярно-генетическом уровне. Они обусловливают современное понимание сущности механизмов развития заболеваний (патогенеза болезни) и намечают пути их наиболее эффективного предупреждения и лечения.

Практическое значение этих наук определяется тем, что инфекционные болезни по-прежнему представляют грозную опасность для здоровья и жизни людей. По данным ВОЗ, из 51 млн человек, ежегодно умирающих в мире в последнее время, более чем у 16 млн причиной смерти являются инфекционные болезни. В России ими ежегодно болеют от 30 до 50 млн человек. В ХХ в. мировому сообществу удалось ликвидировать только одну болезнь – натуральную оспу, а столкнулось человечество с 36 новыми и «возникающими» инфекциями, т. е. болезнями, которые либо неожиданно появляются, либо быстро распространяются среди людей (СПИД, болезнь Лайма, болезни Эбола, Марбурга, легионеров, вирусные гепатиты, геморрагические лихорадки и др.).

Впервые в истории человечества возникла реальная угроза использования международными террористами биологического оружия, в качестве которого могут быть применены возбудители особо опасных и некоторых других заболеваний и продуцируемые ими токсины.

Исторический опыт показал, что основным оружием в борьбе с инфекционными болезнями является создание у людей коллективного иммунитета к возбудителям соответствующих заболеваний. Именно благодаря иммунизации против оспы, осуществленной под эгидой ВОЗ, в октябре 1977 г. была полностью ликвидирована эта одна из самых опасных болезней. Этот опыт послужил основой для создания международной службы по ликвидации инфекционных заболеваний. Разработанная ВОЗ расширенная программа иммунизации предполагает создание у всех детей первого года жизни иммунитета против туберкулеза, гепатита В, дифтерии, коклюша, столбняка, полиомиелита и кори. Таковы впечатляющие успехи медицины в борьбе с этой категорией болезней человека. Однако здесь остается еще много сложных проблем, решение которых зависит от развития микробиологии, вирусологии и иммунологии. Активная иммунизация населения позволяет управлять этими заболеваниями, т. е. существенно снижать заболеваемость вплоть до полной их ликвидации.

Существует два пути решения этой проблемы: а) эрадикация инфекции, т. е. искоренение возбудителя как биологического вида; б) элиминация инфекции, т. е. практическое прекращение заболеваемости, когда циркуляция возбудителя сохраняется только в форме носительства. Именно благодаря иммунизации в октябре 1977 г. была полностью ликвидирована на всей Земле оспа – одна из самых опасных болезней. С помощью иммунизации был ликвидирован полиомиелит в 1994 г. в Американском регионе ВОЗ, в 2000 г. – в регионе Западной части Тихого океана. 21 июня 2002 г. зоной, свободной от полиомиелита, объявлены Россия и весь Европейский регион ВОЗ (25 стран). Близок день, когда вслед за оспой на Земле будет полностью ликвидирован полиомиелит.

Несмотря на ликвидацию полиомиелита в нашей стране, наблюдаются нередкие случаи так называемого вакцино-ассоциированного паралитического полиомиелита (ВАПП), причиной которого служит вакцинный штамм. В связи с этим для ликвидации случаев ВАПП предложено использовать либо инактивированную полиомиелитную вакцину (ИПВ), либо ее комбинацию с живой оральной поливакциной (ОПВ).

В 2008 г. исполнилось 25 лет со времени открытия возбудителя ВИЧ-инфекции французским ученым Л. Монтанье, который был награжден Нобелевской премией. За эти годы многое сделано в изучении ВИЧ-инфекции. К сожалению, пандемия ВИЧ-инфекции продолжает оставаться одной из самых сложных проблем мирового здравоохранения, так как до сих пор нет высокоэффективных вакцин для ее профилактики и препаратов для лечения.

ВОЗ разработана расширенная программа иммунизации (РПИ) не только против оспы и полиомиелита, но и против таких тяжелых заболеваний, как дифтерия, корь, коклюш, краснуха, эпидемический паротит, гепатиты B и A, столбняк, туберкулез. По этой программе предусмотрено создание к 2025 г. средств для иммунопрофилактики еще 25 – 30 инфекций. Ближайшими целями ВОЗ поставлены эрадикация полиомиелита во всем мире и ликвидация кори в Европе к 2007 г., а к 2010 г. – во всем мире.

Для успешного решения программы ВОЗ по иммунизации широко ведутся исследования по улучшению биотехнологии изготовления вакцин и повышения их иммуногенной активности. Ведется разработка около 350 вакцин – кандидатов против 100 различных заболеваний. Уже предложен целый ряд новых препаратов, таких как комбинированная вакцина против гепатитов А и B, цельнокультуральная пероральная поливалентная менингококковая ABC-вакцина, тетравакцина для предотвращения возможной пандемии гриппа, которая содержит антигены как вируса гриппа человека H1N1 и H3N2, так и вируса птичьего гриппа H5N1 и др. С 2007 г. в России вступили в силу разработанные ВОЗ особые международные медико-санитарные правила (ММСП), направленные на предотвращение распространения опасных заболеваний.



Часть первая

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Глава 1

Краткий исторический очерк становления и развития микробиологии, иммунологии и вирусологии

Размеры микроорганизмов лежат за пределами разрешающей способности человеческого глаза, поэтому до изобретения микроскопа человек не знал о существовании столь мелких живых существ. Однако, не зная об этом, люди на протяжении тысячелетий научились широко использовать в своих целях процессы жизнедеятельности многих микробов, в частности, для приготовления кумыса и других молочнокислых продуктов, получения вина, уксуса, пива, силосования кормов, мочки льна и т. п. В течение многих веков природа процессов брожения оставалась неясной. Наряду с этим человек давно познал и другую сторону жизнедеятельности микроорганизмов: их способность вызывать повальные заразные («прилипчивые») болезни, от которых погибало множество людей. Происхождение и причины таких болезней также тысячелетиями были непонятны. Вместе с тем давно подмечено, что существует определенное сходство между процессами брожения и гниения, с одной стороны, и заразными болезнями, часто сопровождаемыми образованием гноя, с другой. Родство слов «гниль» и «гной» говорит о давности такого мнения. Поэтому много веков назад возникла мысль, что решение вопроса о природе брожения и гниения приведет к пониманию и природы заразных болезней. Особенно четко эту мысль выразил в XVII в. английский ученый Р. Бойль, который пророчески предсказал, что природу заразных болезней разгадает тот, кто отгадает тайну брожения.

О природе заразных болезней высказывались различные предположения, в том числе и такое, что их возбудителями являются какие-то мельчайшие живые существа – контагии. В наиболее законченной форме эта идея была сформулирована в XVI в. выдающимся итальянским ученым, поэтом и врачом Джироламо Фракасторо. В своем главном медицинском труде «О контагии, контагиозных болезнях и лечении» (1546) он четко сформулировал положение, что зараза – это материальное начало («контагий телесен»). По его мнению, заражение происходит тремя путями: через непосредственное соприкосновение, опосредованно через предметы и на расстоянии, но при обязательном участии мельчайших невидимых контагий («зародышей болезней»). Фракасторо же впервые использовал термин «инфекция» в медицинском смысле. Идея Фракасторо была правильной и плодотворной, но для ее научного доказательства не было еще необходимых научно-технических предпосылок – не было микроскопа.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Дж. Фракасторо (1478 – 1553)


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

А. Левенгук (1632 – 1723)


Открытие микробов смогло осуществиться лишь во второй половине XVII в., когда в связи с развитием торговли назрела потребность в усовершенствовании оптики для мореплавания (подзорные трубы, телескопы и т. п.). Впервые микроскоп был сконструирован в Голландии Гансом и Захарием Янсенами в 1590 г., но он давал еще очень слабое увеличение (всего в 32 раза) и не позволял увидеть бактерии. Открытие мира микробов связано с именем А. Левенгука. С помощью своего микроскопа, дающего увеличение до 300 раз, он в 1674 г. обнаружил и описал эритроциты человека, лягушек и рыб, в 1675 г. – простейших, в 1677 г. – сперматозоиды. А. Левенгук наблюдал клетки более чем 200 видов растений и животных. Свои наблюдения он описывал в письмах (всего их было около 300), направляя их в Лондонское Королевское Общество. Членом этого Общества он был избран в 1680 г. Первое из этих писем направил его друг, голландский ученый Р. Грааф, в 1673 г. В 1683 г. А. Левенгук подробно описал и зарисовал основные формы бактерий. С открытия Левенгука начинается период зарождения микробиологии как науки и ее становления. Этот период получил название «микрографического», так как изучение микроорганизмов сводилось лишь к описанию различных их форм, доступных исследованию при помощи далеко не совершенного микроскопа. Их биологические свойства и значение для человека долго еще оставались во многом непонятными.

Первые сведения о микроорганизмах были весьма скудными, поэтому К. Линней в XVIII в. выделил их в один род под названием Chaos и отнес к червям. В развитии микробиологии в этом периоде, продолжавшемся до середины XIX в., большое значение имели работы русских исследователей М. М. Тереховского (1740 – 1796) и Д. С. Самойловича (Сущинского). Большая заслуга М. М. Тереховского состоит в том, что он одним из первых использовал экспериментальный метод в микробиологии: он изучал влияние на микроорганизмы электрических разрядов разной силы, температуры, различных химических веществ; изучал их размножение, дыхание и т. п. К сожалению, его работы были мало известны в то время и не смогли оказать большого влияния на развитие микробиологии. Работы выдающегося русского врача Д. С. Самойловича получили самое широкое признание. Он был избран членом 12 зарубежных академий наук. Д. С. Самойлович вошел в историю микробиологии как один из первых (если не первый) «охотников» за возбудителем чумы. Впервые он принял участие в борьбе с чумой в 1771 г. во время вспышки ее в Москве, а затем с 1784 г. участвовал в ликвидации вспышек чумы в Херсоне, Кременчуге (1784), Тамани (1796), Одессе (1797), Феодосии (1799). С 1793 г. он был главным доктором карантинов юга России. Д. С. Самойлович был убежденным сторонником гипотезы о живой природе возбудителя чумы и за сто с лишним лет до открытия микроба пытался обнаружить его. Лишь несовершенство микроскопов того времени помешало ему сделать это. Он разработал и применил целый комплекс противочумных мероприятий. Наблюдая за чумой, он пришел к выводу, что после перенесения чумы к ней остается иммунитет. Одна из главных научных заслуг Д. С. Самойловича – идея о возможности создания искусственного иммунитета против чумы с помощью прививок. Своими идеями Д. С. Самойлович выступил как провозвестник зарождения новой науки – иммунологии. В это же время (конец XVIII – начало XIX вв.) английский врач Э. Дженнер впервые успешно осуществил древнюю мечту человечества: обуздать одну из самых страшных болезней человека – натуральную оспу – с помощью вакцинации (искусственных прививок возбудителя коровьей оспы).


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Д. С. Самойлович (1744 – 1805)


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Э. Дженнер (1749 – 1823)


По мере расширения методов изучения свойств микроорганизмов стала возможной и их систематика. В 1786 г. О. Мюллер выделил два рода бактерий – Monas и Vibrio – и отнес их к группе инфузорий. В 1838 г. К. Эренберг переименовал их в семейства Monadna с одним родом (Monas) и Vibrionia, в котором выделил четыре рода: Bacterium, Spirillum, Vibrio и Spirochaeta. Большой вклад в систематику микробов внес один из основоположников отечественной микробиологии Л. С. Ценковский (1822 – 1887). В своей работе «О низших водорослях и инфузориях» (1855) он установил место бактерий в системе живых существ, указав на близость их к растениям. Л. С. Ценковский описал 43 новых вида микроорганизмов, выяснил микробную природу клека (слизеподобная масса, образуемая на измельченной свекле). Впоследствии, независимо от Пастера, он получил сибиреязвенную вакцину, а будучи профессором Харьковского университета (1872 – 1887), способствовал организации Пастеровской станции в Харькове.

В 1857 г. П. Негели выделил все бактерии в одну самостоятельную группу Schizomycetes (грибы-дробянки). Вывод Л. С. Ценковского о природе бактерий поддержал в 1872 г. Ф. Кон, который отделил бактерии от простейших и отнес их к царству растений.

Второй период микробиологии – период ее подлинного рождения как самостоятельной биологической науки и стремительного развития – связан прежде всего с именами Л. Пастера, Р. Коха и их учеников. Любая наука рождается только тогда, когда для этого созреют необходимые научные и технические предпосылки, а также социально-экономические потребности в ней. Это общее правило. К середине XIX в. научно-технические условия для рождения такой науки, как микробиология, вполне созрели: были сконструированы микроскопы с высокой разрешающей способностью и обнаружено много различных видов микроорганизмов. Наступило время выяснить и доказать их важную роль для человека, в частности, в качестве виновников различных заболеваний людей, животных и растений, а также в процессах брожения и гниения.

В медицине в это время господствовала клеточная теория патологии Р. Вирхова (1821 – 1902), в соответствии с которой «все болезни в конце концов сводятся к активным или пассивным повреждениям большего или меньшего количества клеток», но она ничего не говорит о причинах, их вызывающих. В то же время у больных животных и людей в организме находили различные микроорганизмы. Нужно было решить вопрос: являются ли они следствием болезни или ее причиной?

К середине 50-х гг. XIX в. стало ясно, что пока не будет выяснена природа гнойных осложнений ран, дальнейший прогресс медицины вообще, и хирургии в особенности, не возможен. Наконец, незнание биологических основ технологических процессов, лежащих в основе производства вина и пива, наносило большой экономический ущерб. Таким образом, сама жизнь требовала решения этих проблем.

Окончив в 1847 г. Эколь Нормаль (одно из лучших высших учебных заведений Франции), Л. Пастер выполнил две докторские диссертации – по химии и физике. Последняя была посвящена изучению явлений, относящихся к вращательной поляризации жидкостей. В ходе изучения изомеров винной кислоты он впервые непосредственно столкнулся с деятельностью микроорганизмов. Добавляя плесневой гриб в оптически неактивную смесь двух изомеров винной кислоты, Л. Пастер обнаружил, что через некоторое время эта смесь начинает вращать плоскость поляризации влево вследствие разрушения правого изомера грибом. Это обстоятельство натолкнуло его на мысль о возможном участии микроорганизмов в процессах брожения. Действительно, после нескольких лет напряженных исследований Л. Пастер установил, что процессы брожения вызываются микроорганизмами, причем каждый вид брожения – определенным видом. Позднее он установил, что и гниение (разложение белковых продуктов) – результат жизнедеятельности микроорганизмов. Таким образом, природа процессов брожения и гниения была наконец выяснена. Трудно переоценить все значение этих открытий Л. Пастера. Благодаря им были заложены основы технической (промышленной) микробиологии, выяснена роль микробов в круговороте веществ в природе, открыты анаэробные организмы. На основе этих работ Л. Пастера Дж. Листером (1827 – 1912) были разработаны принципы антисептики, а затем Л. Пастер дополнил их принципами асептики, благодаря которым и стал возможен дальнейший прогресс в хирургии. Исходя из своих исследований, Л. Пастер смог установить природу болезней вина и пива, показав, что они также являются результатом жизнедеятельности микроорганизмов. Он предложил и метод их предупреждения, названный впоследствии пастеризацией, а затем (после решения проблемы самозарождения) были разработаны методы стерилизации (автоклавирование), столь необходимые для обеспечения принципов асептики в медицине и развития консервной промышленности. Выяснение природы процессов брожения и гниения вновь поставило на повестку дня вопрос о возможности самозарождения жизни, теперь уже на уровне микроорганизмов. Оппоненты Л. Пастера утверждали, что в субстратах, подвергающихся брожению или гниению, их возбудители самозарождаются. Безупречными экспериментами Л. Пастер доказал, что микроорганизмы проникают из окружающей среды, а не самозарождаются. Своими исследованиями Л. Пастер подготовил научную общественность к пониманию того непреложного положения, что главными виновниками заразных болезней человека и животных являются микроорганизмы. Однако это нужно было доказать на конкретных примерах. Не будучи врачом, Л. Пастер привлек к своим работам высоко талантливого врача Э. Ру (1853 – 1933) и приступил к изучению болезнетворных бактерий. Пастер выделил из крови больного сибирской язвой животного палочку, получил ее чистую культуру и, заражая ею здоровое животное, наблюдал его гибель от сибирской язвы. Аналогичные опыты он поставил с куриной холерой и получил такие же результаты. Этими безукоризненными опытами была бесспорно доказана микробная природа заразных болезней.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Л. Пастер (1822 – 1895)


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Р. Кох (1843 – 1910)


В 1876 г. заявил о себе и другой исследователь, оказавший огромное влияние на становление и развитие медицинской микробиологии, – Роберт Кох. В своей работе Р. Кох подвел окончательную черту под многолетней дискуссией о природе бактерий, обнаруживаемых у больных сибирской язвой животных. Дискуссия шла по вопросу: являются ли обнаруживаемые бактерии случайными спутниками болезни или причиной ее? Р. Кох точными экспериментами доказал, что возбудителем сибирской язвы является микроорганизм Bacillus anthracis. «Благодаря французу Пастеру было верно понято значение сибиреязвенных палочек, а благодаря немцу Коху было доказано их значение как единственных возбудителей сибирской язвы» (И. И. Мечников). Р. Коху микробиология обязана прежде всего тем, что он усовершенствовал бактериологическую методику. Он предложил метод выделения чистых культур из изолированных колоний на плотных средах, способы окраски бактерий анилиновыми красителями и внес усовершенствования в технику микроскопирования – конденсор Аббе и иммерсионные объективы. Все это способствовало широкому распространению экспериментальных исследований микроорганизмов и разработке бактериологических методов диагностики инфекционных болезней. Кроме того, Р. Коху принадлежит огромная историческая заслуга в открытии возбудителей тяжелейших заболеваний человека – туберкулеза и холеры.

Так благодаря Л. Пастеру и Р. Коху возникла и начала быстро развиваться новая наука – микробиология. Такое название ей дал соратник Л. Пастера П. Дюкло, а Пастер назвал ее вначале «микробией». Все невидимые простым глазом живые существа Ч. Седийо в 1878 г. предложил называть микробами. Открытия возбудителей заразных заболеваний после работ Пастера следовали буквально одно за другим:

1874 г. – палочка проказы (Г. Хансен);

1879 г. – гонококк (А. Нейссер);

1880 г. – палочка брюшного тифа (К. Эберт);

1880 г. – малярийный плазмодий (А. Лаверан);

1880 – 1884 гг. – стафилококк (Л. Пастер, А. Огстон, А. Розенбах);

1882 г. – туберкулезная палочка (Р. Кох);

1883 г. – холерный вибрион (Р. Кох);

1884 г. – дифтерийная палочка (Ф. Леффлер);

1886 г. – пневмококк (А. Френкель).

С 1874 по 1900 г. были открыты возбудители более чем 35 заболеваний человека и животных; открытия продолжаются и в наше время.

Л. Пастер после обоснования микробной природы заразных болезней и открытия ряда их возбудителей поставил далее своей главной целью не поиски других патогенных бактерий, а разработку общего принципа борьбы с заразными болезнями. И эту задачу он также блестяще решил. Однажды Пастер обнаружил любопытный факт: хранившиеся долгое время в термостате возбудители куриной холеры утратили свою заразительность для кур. Нужны были наблюдательность и гений Пастера, чтобы на основании этого маленького факта сделать выводы, которые определили основные направления борьбы с заразными заболеваниями. Пастер предположил, что ослабленные бактерии могут сыграть роль, подобную осповакцине Дженнера, которая надежно предохраняет от натуральной оспы. Оставалось только найти способы ослабления (аттенуации) заразительности бактерий. Пастер решил добиться ослабления заразительности сибиреязвенной палочки и получить из нее вакцину (этот термин со времен Дженнера он сохранил, и ныне все препараты, используемые для создания искусственного активного иммунитета, называют «вакцинами») методом, сходным с получением вакцины из возбудителей куриной холеры. Он выращивал сибиреязвенную палочку не при 37 °C, а при более высокой температуре (42 – 43 °C) и получил два варианта вакцины – более и менее ослабленную.

5 мая 1881 г. на ферме Пуй ле Фор под Парижем начался невиданный в истории медицины публичный эксперимент: 27 животных (главным образом овцы) были привиты полученной Пастером сибиреязвенной вакциной. 17 мая им была сделана прививка повторно, но уже менее ослабленной вакциной, а 31 мая наступил решающий момент: всех вакцинированных животных и столько же невакцинированных заразили смертельной дозой сибиреязвенной палочки. Перед этим опытом Пастер уверенно заявил, что все вакцинированные животные устоят перед инфекцией, а невакцинированные – умрут. Так и получилось. Блестящий успех этого эксперимента показал, что человечество получило надежное оружие борьбы против инфекционных болезней. Так, начав с изучения природы брожения, решая одну за другой практические задачи общества, Пастер совершил одно из величайших открытий и заложил научные основы наиболее эффективной борьбы с заразными болезнями с помощью искусственной иммунизации. Завершая свою научную деятельность, Л. Пастер после долгих и упорных опытов получил вакцину против бешенства. Сложность решения этой задачи состояла в том, что возбудителем бешенства является вирус, которого Пастер не мог увидеть под микроскопом и который не размножался на искусственных питательных средах. Только благодаря гению Пастера удалось превратить уличный вирус бешенства в вакцину против бешенства, которая до сих пор является единственным средством защиты от этой страшной болезни. Высокая эффективность вакцины против бешенства быстро подтвердилась. Ее стали называть «пастеровской», и вскоре в различных странах мира (раньше всего в России, в Одессе, И. И. Мечников) стали открывать пастеровские станции, где людям, пострадавшим от нападения бешеных животных, спасали жизнь с помощью пастеровской вакцины. Успех идей Пастера был настолько велик, что для него в Париже на собранные по международной подписке деньги был построен и открыт 14 ноября 1888 г. специальный институт (Пастеровский институт), ставший мировым научным центром микробиологии. 22 декабря 1892 г. Пастеру исполнилось 70 лет, его чествование имело международный характер. Юбиляру была вручена специальная золотая медаль, на которой выгравированы такие слова: «Пастеру в день его семидесятилетия – благодарная наука и человечество». Скончался Л. Пастер 22 сентября 1895 г. Его тело погребено в гробнице Пастеровского института. Над аркой перед входом в усыпальницу выбито всего три слова: «Ici repose Pasteur» («Здесь покоится Пастер»). На мемориальной доске, установленной на здании Эколь Нормаль, так лаконично записана хронология научной жизни Пастера:



«Здесь была лаборатория Пастера.

1857 г. Брожение.

1860 г. Самопроизвольное зарождение.

1865 г. Болезни вина и пива.

1881 г. Зараза и вакцина.

1885 г. Предохранение от бешенства».

Пастер не только создал микробиологию как фундаментальную биологическую науку, но и определил ее основные разделы, которые затем выделились в качестве самостоятельных научных дисциплин со своими целями и задачами: общая микробиология (изучает фундаментальные закономерности биологии микроорганизмов); техническая (промышленная) микробиология (изучает различные типы процессов брожения, которые используются для получения спиртов, ацетона, глицерина и т. п., а также разрабатывает и организует производство с помощью микробов продуцентов антибиотиков, витаминов и других биологически активных соединений); сельскохозяйственная микробиология (изучает почвенную микрофлору, ее роль в круговороте веществ в природе и влияние на структуру и плодородие почв, а также болезни растений, методы предупреждения и борьбы с ними и т. п.); ветеринарная микробиология (изучает биологию возбудителей заразных болезней животных и разрабатывает методы специфической диагностики, профилактики и лечения их; она тесно связана с медицинской микробиологией, так как имеются болезни, общие для животных и человека и передающиеся от животных к человеку).

Из всех разделов микробиологии наибольшее значение для человечества имело развитие медицинской микробиологии – науки, которая занимается изучением биологии болезнетворных микробов и особенностей взаимодействия их с организмом человека. Задачей медицинской микробиологии является не только выяснение этиологии инфекционных заболеваний, но и разработка специфических методов их диагностики, профилактики и лечения. Как известно, здесь достигнуты громадные успехи, которыми мы в значительной степени обязаны тому, что в ходе исторического развития микробиологии возникли и стали бурно развиваться такие новые биологические науки, как иммунология, вирусология, учение об антибиотиках и плазмидах.

То, что человек, переболевший заразной болезнью, повторно ею, как правило, не болеет, было известно очень давно. Однако о механизмах, обеспечивающих такую приобретенную устойчивость (иммунитет), стало известно лишь в результате исследований И. И. Мечникова, П. Эрлиха и их многочисленных учеников.

Выдающийся русский ученый И. И. Мечников не только был одним из основоположников микробиологии, в том числе и отечественной, но по праву считается вместе с П. Эрлихом основоположником иммунологии. Он открыл явление фагоцитоза и впервые в истории медицины показал, что целебные силы организма связаны с особой группой клеток, названных им «фагоцитами». Идеи И. И. Мечникова горячо поддержал Л. Пастер, он пригласил его и предложил возглавить лабораторию в Пастеровском институте. Здесь и работал И. И. Мечников с 1887 г. до конца жизни. После того как было установлено, что против бактерий и их токсинов в организме вырабатываются различные антитела (антитоксины, бактериолизины, опсонины, агглютинины и т. п.), П. Эрлих предложил гуморальную теорию иммунитета. В многолетней и на редкость плодотворной научной дискуссии между сторонниками фагоцитарной теории иммунитета Мечникова и гуморальной – Эрлиха – фактически были раскрыты многие механизмы иммунитета и родилась иммунология. Обе теории оказались правомочными – И. И. Мечникову и П. Эрлиху за исследования по иммунитету в 1908 г. была присуждена Нобелевская премия.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

И. И. Мечников (1845 – 1916)


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

П. Эрлих (1854 – 1915)


В развитие иммунологии большой вклад внесли ученики И. И. Мечникова – А. М. Безредка (1870 – 1940), Л. А. Тарасевич (1868 – 1927), И. Г. Савченко, В. И. Исаев – и такие ученые, как Э. Ру, А. Иерсен, Э. Беринг, Ш. Китазато, Ж. Борде, О. Жангу, Г. Рамон и др.

В результате последующих многочисленных исследований было установлено, что и наследственный, и приобретенный иммунитеты обеспечиваются согласованной деятельностью пяти основных систем: макрофагов; комплемента; Т– и В-лимфоцитов; интерферонов; главной системы гистосовместимости. Они и обеспечивают различные формы иммунного ответа.

12 февраля 1892 г. на заседании Российской академии наук Д. И. Ивановский сообщил о том, что возбудителем мозаичной болезни табака является фильтрующийся вирус. Эту дату можно считать днем рождения вирусологии, а Д. И. Ивановского – ее основоположником. Очень скоро выяснилось, что вирусы вызывают заболевания не только растений, но и человека, животных и бактерий. Они оказались столь же вездесущими, как и другие микроорганизмы. Развитие вирусологии, также ставшей фундаментальной биологической наукой, определялось совершенствованием методов исследования вирусов и их культивирования. Необычные свойства вирусов на многие годы затянули решение вопроса об их природе. Только после расшифровки природы гена и генетического кода вирусы были признаны живыми существами, хотя они по многим свойствам отличаются от всех других организмов. Л. Пастер, создавая вакцину против бешенства, вплотную подошел к открытию вирусов, во всяком случае, он предсказал их существование. Здесь прослеживается историческая связь микробиологии с вирусологией. Между созданием вакцины против бешенства и открытием вирусов Д. И. Ивановским прошло всего 8 лет.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Д. И. Ивановский (1864 – 1920)


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

А. Флеминг (1881 – 1955)


Следующим важным этапом в развитии микробиологии было открытие антибиотиков. В 1929 г. А. Флеминг открыл пенициллин, и началась новая эра – эра антибиотикотерапии, которой суждено было произвести подлинную революцию в медицине. А изучение природы лекарственной устойчивости, которая стала эпидемически распространяться среди бактерий, привело к очередному важному открытию. Оказалось, что у многих бактерий, устойчивых к антибиотикам и иным химиопрепаратам, существует два генома – хромосомный и плазмидный. Изучение плазмид привело к выводу о том, что они представляют собой еще более простые организмы, чем вирусы, и в отличие от последних не разрушают бактерии, а наделяют их дополнительными важными биологическими свойствами. Открытие плазмид и изучение их свойств расширили и углубили представление о формах существования жизни и путях ее эволюции.

Новый этап развития микробиологии, иммунологии и вирусологии начался во второй половине ХХ в. в связи с рождением молекулярной генетики и молекулярной биологии. В 1944 г. в опытах по трансформации пневмококков впервые было доказано, что носителем генов является ДНК. Использование бактерий, вирусов, а затем и плазмид в качестве объектов молекулярно-генетических и молекулярно-биологических исследований привело к более глубокому пониманию фундаментальных процессов, лежащих в основе жизни. В области иммунологии исследования на молекулярно-генетическом и молекулярно-биологическом уровне позволили раскрыть структуру антител; выяснить, как осуществляется генетический контроль их биосинтеза, каковы механизмы дифференцировки иммунокомпетентных клеток и их взаимодействия в выдаче различных вариантов иммунного ответа. Иммунология вплотную подошла к раскрытию основных принципов и закономерностей саморегуляции иммунной системы на всех ее уровнях. Открываются широкие перспективы использования иммунобиологических модуляторов для лечения различных форм иммунодефицитов, включая рак. За последние годы расшифрована молекулярно-генетическая организация многих вирусов, изучены механизмы их взаимодействия с клетками, особенности противовирусного иммунитета, открыты и изучены различные вирусы, в том числе относящиеся к семейству Retroviridae (ВИЧ), выяснены в общих чертах механизмы, с помощью которых онковирусы вызывают трансформацию нормальных клеток в опухолевые. Большие успехи достигнуты в изучении генетического, в том числе плазмидного, контроля факторов патогенности и механизма действия многих бактериальных экзотоксинов. Разработаны принципы получения и производства, в том числе генно-инженерными методами, новых поколений вакцин. Созданы реальные предпосылки для ликвидации ряда инфекционных заболеваний уже в ближайшее время с помощью массовой вакцинации. Успешный опыт по ликвидации на Земле оспы позволяет надеяться, что с помощью расширенной программы иммунизации, осуществляемой под эгидой ВОЗ, такие болезни, как полиомиелит, краснуха, корь, эпидемический паротит, также будут ликвидированы, а заболеваемость туберкулезом, дифтерией, столбняком, коклюшем и некоторыми другими болезнями будет значительно снижена.

За открытия в области микробиологии Нобелевских премий удостоены многие выдающиеся ученые: Э. Беринг (1901), Р. Кох (1905), И. И. Мечников, П. Эрлих (1906), Ш. Лаверан (1907), Ш. Рише (1913), Ж. Борде (1919), Ш. Николь (1928), К. Ландштейнер (1930), Г. Домагк (1939), А. Флеминг, Х. Флори, Э. Чейн (1945), М. Тейлер (1951), С. Ваксман (1952), Ф. Робинс, Д. Эндерс, Т. Веллер (1954), Д. Ледерберг (1958), А. Корнберг, С. Очоа (1959), Ф. Бернет, П. Медавар (1960), Ф. Крик, М. Х. Уилкинс, Д. Уотсон (1962), Ф. Жакоб, А. Львов, Ж. Моно (1965), Ф. Раус (1966), М. Ниренберг, Р. Холли, Х. Корана (1968), М. Дельбрюк, А. Херши, С. Лурия (1969), Д. Балтимор, Р. Дульбекко, Х. Темин (1970), Б. Блюмберг, К. Гайдушек (1976), В. Арбер, Д. Натанс, Х. Смит (1978), Ж. Доссе, Б. Бенасерраф, Д. Снелл (1980), Б. Мак-Клинток (1983), Г. Келлер, Ц. Мильштейн, Н. Ерне (1984), С. П. Прузинер (1997).

Российским ученым принадлежит большая заслуга в развитии микробиологии, иммунологии и вирусологии. Рядом с именами И. И. Мечникова, Д. И. Ивановского по праву можно поставить имена и многих других выдающихся ученых. С. Н. Виноградский является основоположником почвенной микробиологии и одним из организаторов Русского микробиологического общества (1903 г.). С 1932 г. и до конца жизни он руководил агробиологическим отделом Пастеровского института в Париже. П. Ф. Боровский (1863 – 1932) и Ф. А. Леш (1840 – 1903) – первооткрыватели патогенных простейших, лейшманий и дизентерийной амебы. И. Г. Савченко установил стрептококковую этиологию скарлатины, первым использовал антитоксическую сыворотку для ее лечения, предложил вакцину против нее, создал Казанскую школу микробиологов в России и вместе с И. И. Мечниковым изучал механизм фагоцитоза и проблемы специфической профилактики холеры. Д. К. Заболотный (1866 – 1929) – крупнейший организатор борьбы с чумой, установил и доказал ее природную очаговость. Он создал первую самостоятельную кафедру бактериологии в Петербургском женском медицинском институте в 1898 г.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

С. Н. Виноградский (1856 – 1953)


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

И. Г. Савченко (1862 – 1932)


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

В. Д. Тимаков (1904 – 1977)


Большой вклад в развитие общей, технической и сельскохозяйственной микробиологии внесли академики В. Н. Шапошников (1884 – 1968), Н. Д. Иерусалимский (1901 – 1967), Б. Л. Исаченко (1871 – 1947), Н. А. Красильников (1896 – 1973), В. Л. Омелянский (1867 – 1928), С. П. Костычев (1877 – 1931), Е. И. Мишустин (1901 – 1983) и их многочисленные ученики. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология во многом обязаны исследованиям таких широко известных отечественных ученых, как Н. Ф. Гамалея (1859 – 1949), П. Ф. Здродовский (1890 – 1976), Л. А. Зильбер (1894 – 1966), В. Д. Тимаков, Е. И. Марциновский (1874 – 1934), В. М. Жданов (1914 – 1987), З. В. Ермольева (1898 – 1979), А. А. Смородинцев (1901 – 1989), М. П. Чумаков (1909 – 1990), П. Н. Кашкин (1902 – 1991), Б. П. Первушин (1895 – 1961) и многих других. Трудами отечественных микробиологов, иммунологов и вирусологов внесен крупный вклад в развитие мировой науки, в теорию и практику здравоохранения.

Преподавание в России микробиологии было начато И. И. Мечниковым и Я. Ю. Бардахом в 1885 г. в Новороссийском университете (Одесса). В 1892 г. Г. Н. Габричевский (1860 – 1907) организовал в Московском университете самостоятельный курс бактериологии, на основе которого затем была создана кафедра.

Глава 2

Микроскопические методы исследования микроорганизмов

Размеры всех объектов, являющихся предметом изучения микробиологии и вирусологии, лежат далеко за пределами разрешающей способности человеческого глаза. Морфология микроорганизма (его форма, размеры, взаиморасположение клеток, поверхностные структуры, внутренняя организация) является чрезвычайно важной его характеристикой и лежит в основе таксономии. Поэтому одним из главных методов исследования в области микробиологии является микроскопия. Основу микроскопических методов исследования составляют световая микроскопия со всеми ее разновидностями (темнопольная, фазово-контрастная, аноптральная, люминесцентная и др.) и электронная микроскопия. Выбор метода определяется целями, стоящими перед исследователем.

В основе световой микроскопии лежат различные свойства света. Современные световые микроскопы представляют собой довольно сложные приборы, совершенствуемые в течение 400 лет с момента создания первого прототипа микроскопа. Современный биологический световой микроскоп состоит из следующих основных элементов: штатива, состоящего из массивного основания (башмака), и тубусодержателя, на котором смонтирована механическая система грубой и тонкой настройки, револьвер с 3 – 4 сменными объективами, предметный столик с конденсором и диафрагмой и под ним светонаправляющее зеркало, концентрирующее естественный или искусственный свет на объект исследования, находящийся на предметном столике. Тубусодержатель микроскопа заканчивается головкой, на которой крепится монокулярный или бинокулярный тубус с окуляром или окулярами. Предметный столик имеет приспособление для крепления предметного стекла с препаратом и механизма для его перемещения.

Иммерсионная световая микроскопия

Важнейшей характеристикой каждого объектива, как и любой оптической системы, является его разрешающая способность. Под разрешающей способностью понимают минимальное расстояние между двумя точками, при котором они еще видны раздельно, т. е. не сливаются в одну. Разрешающая способность объектива ограничивается такими недостатками оптической системы, как сферическая и хроматическая аберрация, дифракция и т. д. Если первые два явления устранимы, то явление дифракции наблюдается в любой оптической системе. Она ограничивает разрешающую способность оптических систем. Разрешающая способность объектива с учетом явлений дифракции описывается следующей формулой:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

где А – разрешающая способность; n – показатель преломления среды между препаратом и фронтальной линзой объектива (в случае масляной иммерсии n = 1,51);

α – угол между оптической осью объектива и самым крайним лучом, попадающим в объектив из центра препарата; λ – длина световой волны; 0,61 – коэффициент учета геометрических факторов при вычислении освещенности первого дифракционного максимума от круглого отверстия.

Величина n · sin α постоянна для каждого объектива и называется числовой, или нумерической, апертурой. Она выгравирована на оправе объектива. В монобромнафталиновых иммерсионных объективах нумерическая апертура может варьировать в пределах от 1,25 до 1,60. При наличии воздуха между фронтальной линзой и покровным стеклом нумерическая апертура не превышает 0,95 (сухие объективы). Из приведенной выше формулы видно, что разрешающая способность объектива прямо пропорциональна его числовой апертуре и обратно пропорциональна длине волны света, используемого для микроскопии. При микроскопии в видимом свете с длиной волны 0,55 мкм (550 нм) и иммерсионным объективом с нумерической максимальной апертурой 1,60 разрешающая способность равна:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Таким образом, даже в идеальном световом микроскопе нельзя увидеть объекты размером менее 0,2 мкм.

Величина угла, при котором глаз способен различать раздельно две точки, называется углом резкого зрения. Для получения на сетчатке четкого раздельного изображения двух точек световые лучи должны попасть в глаз под углом зрения, который стягивает дугу от 2 до 4 минут.

Изображение структур, разрешенных объективом, может быть увеличено окуляром лишь настолько, чтобы было различимо под углом, стягивающим дугу величиной от 2 до 4 минут. Это полезное увеличение микроскопа. Полезное увеличение микроскопа не может превышать числовую апертуру более чем в 1000 раз. Поэтому максимальное полезное увеличение для микроскопов, имеющих иммерсионные объективы с апертурой 1,4 – 1,6, составляет 1400 – 1600. Применение в таких микроскопах более сильных окуляров не выявляет никаких дополнительных деталей в разрешаемой объективом структуре препарата.

Фазово-контрастная микроскопия

Обыкновенные окрашенные препараты поглощают часть проходящего через них света, в результате чего амплитуда световых волн снижается, и частицы препарата выглядят темнее фона. При прохождении света через неокрашенный препарат амплитуда световых волн не меняется, происходит лишь изменение фазы световых волн, прошедших через частицы препарата. Однако человеческий глаз улавливать это изменение фазы света не способен, поэтому неокрашенный препарат при правильной установке освещения в микроскопе будет невидим.

Фазово-контрастное устройство позволяет превратить изменение фазы лучей, прошедших через частицы неокрашенного препарата, в изменения амплитуды, воспринимаемые человеческим глазом, и, таким образом, позволяет сделать неокрашенные препараты отчетливо видимыми.

Приспособление для фазово-контрастной микроскопии включает в себя конденсор с набором кольцевых диафрагм, обеспечивающих освещение препарата полным конусом света, и фазово-контрастные объективы, которые отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе располагается полупрозрачная фазовая пластинка в виде кольца, вызывающая сдвиг фазы проходящего через нее света. Установку освещения проводят так, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, в дальнейшем прошел через расположенное в объективе фазовое кольцо.

При рассмотрении препарата весь свет, прошедший через участки препарата, в которых нет каких-либо объектов, пройдет через фазовое кольцо и даст светлое изображение фона. Свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например бактериальные клетки, получит некоторое изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча – недифрагированный и дифрагированный. Недифрагированные лучи, пройдя в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе, получат дополнительный сдвиг фазы. Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция (наложение) дифрагированного и недифрагированного лучей, а так как эти лучи идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение и уменьшение амплитуды. Благодаря этому микробные клетки будут выглядеть темными на светлом фоне.

Существенными недостатками фазово-контрастной микроскопии являются слабая контрастность получаемых изображений и наличие светящихся ореолов вокруг объектов. Фазово-контрастная микроскопия не увеличивает разрешающей способности микроскопа, но помогает выявить детали структуры живых бактерий, стадии их развития, изменения в них под действием различных агентов (антибиотики, химические вещества и т. д.).

Аноптральная микроскопия (амплитудно-контрастная, фазово-темнопольная)

Аноптральная микроскопия – разновидность фазово-контрастной микроскопии, при которой применяют объективы со специальными пластинками, нанесенными на одну из линз в виде затемненного кольца.

Принцип аноптральной микроскопии тот же, что и фазово-контрастной, но первая обладает большей разрешающей способностью при микроскопировании объектов, вызывающих незначительный фазовый сдвиг, и открывает новые возможности использования обычного светового микроскопа для прижизненного исследования бактерий, простейших и т. д.

Широкое центральное отверстие в слое копоти или меди, нанесенном на линзу объектива, является как бы люком, выпускающим из объектива бwольшую часть дифрагированного света, в то время как широкий темный слой кольца, покрывающий остальную поверхность линзы, играет роль ловушки для нежелательного периферического дифрагированного света. За счет этого в значительной степени устраняется ореол вокруг исследуемого объекта, фон поля зрения имеет коричневато-серый цвет, а сами объекты имеют различные оттенки от светло-коричневого до белого.

Интерференционная микроскопия

Интерференционная микроскопия решает те же задачи, что и фазово-контрастная, но если последняя позволяет наблюдать лишь контуры объектов исследования, то с помощью интерференционной микроскопии можно изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный анализ. Это достигается благодаря раздвоению луча света в микроскопе: один из лучей проходит через частицу объекта, а другой мимо нее. В окуляре микроскопа оба луча соединяются и интерферируют между собой. Разность возникающих фаз можно измерить, определив таким образом массу различных клеточных структур. Последовательное измерение разности фаз света с известными показателями преломления дает возможность определять толщину живых объектов, концентрацию в них воды и сухого вещества и т. д. На основании данных интерференционной микроскопии можно косвенно судить о проницаемости мембран, активности ферментов, клеточном метаболизме объектов исследования.

Поляризационная микроскопия

Поляризационная микроскопия позволяет изучать объекты исследования в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях, т. е. в поляризованном свете. Для этого используют пленчатые поляроиды или призмы Николя, которые помещают в микроскопе между источником света и препаратом. Поляризация меняется при прохождении лучей света через различные структурные компоненты клеток и тканей, свойства которых неоднородны, или при отражении от них. В оптически изотропных структурах скорость распространения поляризованного света не зависит от плоскости поляризации, в анизотропных структурах она меняется в зависимости от направления света по продольной или поперечной оси объекта. Если показатель преломления света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает положительное двойное лучепреломление, при обратных взаимоотношениях – отрицательное двойное лучепреломление. Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, являются анизотропными и вызывают положительное двойное преломление света.

Темнопольная микроскопия

При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив. В объектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо).

Для микроскопии в темном поле используют специальный конденсор (параболоид-конденсор или кардиоид-конденсор) и обычные объективы. Поскольку апертура иммерсионного объектива больше, чем апертура конденсора темного поля, внутрь иммерсионного объектива вставляется специальная трубчатая диафрагма, снижающая его апертуру.

Этот метод микроскопии удобен при изучении живых бактерий, спирохет и их подвижности.

Люминесцентная микроскопия

Метод основан на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света. При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждающего люминесценцию. Так, если освещать объект синим светом, он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого и зеленого цвета. Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными светящимися красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый, изотиоцианат флуоресцеина и др.). Лучи света от сильного источника (обычно ртутной лампы сверхвысокого давления) пропускают через сине-фиолетовый светофильтр. Под действием этого коротковолнового излучения окрашенные флуорохромом клетки или бактерии начинают светиться красным или зеленым светом. Для того чтобы синий свет, вызвавший люминесценцию, не мешал наблюдению, над окуляром ставят запирающий желтый светофильтр, задерживающий синие, но пропускающий желтые, красные и зеленые лучи. В результате при наблюдении в люминесцентном микроскопе на темном фоне будут видны клетки или бактерии, светящиеся желтым, зеленым или красным светом. Например, при окраске акридиновым оранжевым ДНК клетки (ядерное вещество) будет светиться ярко-зеленым светом. Метод люминесцентной микроскопии позволяет изучать живые нефиксированные бактерии, окрашенные сильно разведенными флуорохромами, не причиняющими вреда микробным клеткам. По характеру свечения могут быть дифференцированы отдельные химические вещества, входящие в состав микробной клетки. Метод с успехом может быть использован для ускоренной диагностики ряда заболеваний (см. также раздел «Реакция иммунофлуоресценции» в гл. 42).

Электронная микроскопия

Для изучения структуры клеток на субклеточном и молекулярном уровнях, а также для изучения вирусов используют электронную микроскопию. Ценность электронной микроскопии заключается в ее способности разрешать объекты, не разрешаемые оптическим микроскопом в видимом или ультрафиолетовом свете. Малая длина волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, позволяет разрешать, т. е. различать как отдельные объекты, отстоящие друг от друга всего на 2 2 (0,2 нм, или 0,0002 мкм) или даже меньше, в то время как предел разрешения световой оптики лежит вблизи 0,2 мкм (он зависит от длины волны используемого света). Электронная микроскопия, при которой изображение получают благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называется просвечивающей (трансмиссионной). При сканирующей (растровой), или туннельной, электронной микроскопии пучок электронов быстро сканирует (просматривает) поверхность образца, вызывая излучение (отражение), которое посредством катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране микроскопа по аналогии с формированием телевизионного изображения.

Принципиальная оптическая схема электронного микроскопа аналогична схеме светового, в котором все оптические элементы заменены соответствующими электрическими: источник света – источником электронов, стеклянные линзы – линзами электромагнитными. В электронных микроскопах просвечивающего типа различают три системы: электронно-оптическую, вакуумную, электропитания. Фотографирование изображений при всех видах исследований проводится на фотопластинки или фотопленку. Источником электронов является электронная пушка, состоящая из V-образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900 °C при подаче постоянного напряжения до 100 кВ в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом. Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его разной толщины и электроноплотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое полезное увеличение объекта.

После объективной линзы электроны попадают в промежуточную линзу, которая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения дифракции с участков исследуемого образца. Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение объекта, которое направляется на флуоресцирующий экран. Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экрана на нем возникает видимое изображение объекта. После наведения резкости сразу проводят фотографирование. Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточной и проекционной линзами.

Электронно-микроскопическому исследованию могут быть подвергнуты как ультратонкие срезы различных тканей, клеток, микроорганизмов, так и целые бактериальные клетки, вирусы, фаги, а также субклеточные структуры, выделяемые при разрушении клеток различными способами.

Современные модели электронных микроскопов устроены так, что сочетают в себе возможности как просвечивающего, так и сканирующего микроскопов, и их легко можно переоборудовать с одного типа на другой. При просвечивающей электронной микроскопии получают плоскостные изображения объекта, а при сканирующей – удается получить трехмерное объемное изображение (с помощью компьютера). В бактериологии сканирование наиболее эффективно для выявления отростков и других поверхностных структур, для определения формы и топографических отношений как в колониях, так и на поверхности инфицированных тканей.

Электронная микроскопия требует специальной подготовки объектов исследования, в частности: фиксации тканей или микроорганизмов, обезвоживания (так как вода сильно рассеивает электроны), заливки в твердые среды (эпоксидные смолы), приготовления ультратонких срезов. С целью повышения четкости наблюдаемой картины используют методы позитивного или негативного контрастирования, а также метод оттенения.

При сканирующей микроскопии образец фиксируют, высушивают на холоде и напыляют в вакууме золотом или другими тяжелыми металлами. Таким образом получают реплику (отпечаток), повторяющую контуры образца и впоследствии сканируемую.

Глава 3

Основные принципы классификации микроорганизмов. Происхождение и пути эволюции микроорганизмов

Четыре царства жизни

Мир микроорганизмов чрезвычайно разнообразен. По мере их открытия и изучения они были разделены на следующие группы:

1. Бактерии – Schizomycetes (грибы-дробянки; лат. schizo – расщепляю и mycetes – грибы).

2. Лучистые грибы – Actinomycetes (лат. actino – луч).

3. Нитчатые грибы – Trichomycetes (греч. trichos – волос).

4. Дрожжевые грибы – Blastomycetes (греч. blastos – почка, размножаются почкованием).

5. Сине-зеленые водоросли – Cyanophyta, они же цианобактерии (Cyanobacteria).

6. Спирохеты – Spirochaeta (греч. speira – спираль и chaite – волос).

7. Простейшие – Protozoa.

8. Риккетсии – Rickettsia.

9. Микоплазмы – Mycoplasma.

10. Вирусы.

11. Плазмиды.

Единственное, что их всех объединяет, – микроскопические размеры. Однако эти организмы существенным образом различаются по многим признакам и прежде всего по уровню организации геномов, наличию и составу белоксинтезирующих систем и клеточной стенки.

Все известные живые организмы в природе можно разделить на 4 существенно отличающиеся друг от друга царства: вирусы и плазмиды, архебактерии, эубактерии и эукариоты. Архебактерии и эубактерии по признаку отсутствия оформленного клеточного ядра объединяют в группу прокариот. К ним относятся бактерии, синезеленые водоросли, спирохеты, актиномицеты, риккетсии и подобные им бактерии, а также микоплазмы. Простейшие, дрожжи, нитчатые грибы и все другие группы живых существ с более высоким уровнем организации, имеющие оформленное клеточное ядро, называются эукариотами. В связи с таким разнообразием дать краткое и исчерпывающее определение понятия «микроорганизм» достаточно сложно, тем более, что к ним относятся вирусы и плазмиды, о природе которых шла продолжительная дискуссия. Нужно было определить главный критерий, который бы отличал живое от неживого. Современное представление о жизни связано с понятием гена. Ген является единственным носителем и хранителем жизни. Таким образом, главное отличие живого от неживого – наличие собственной генетической системы, которая обеспечивает наследственную непрерывность и эволюцию данного организма, т. е. его существование – жизнь. Все, кто имеет свою генетическую систему, должны рассматриваться как организмы. В свете всего сказанного и с учетом того, что уже известно о микроорганизмах, представляется возможным дать им такое определение.

Микроорганизмы – это невидимые простым глазом представители всех царств жизни: эукариоты, прокариоты (эубактерии и архебактерии), вирусы и плазмиды. Они занимают низшие ступени эволюции, но играют важную и разнообразную роль в общей экономике природы, в круговороте веществ, в патологии человека, животных и растений.

Отличительные особенности перечисленных царств жизни следующие.

К царству вирусов и плазмид относят организмы, у которых геном представлен либо ДНК, либо РНК; у них отсутствуют собственные системы биосинтеза белка и мобилизации энергии, поэтому они являются абсолютными внутриклеточными паразитами.

Прокариоты (эубактерии и архебактерии) – это организмы, у которых еще нет оформленного ядра, а есть лишь его предшественник – нуклеоид. Он представлен одной или несколькими хромосомами, которые состоят из ДНК и свободно располагаются в цитоплазме, не отграниченные от нее никакой мембраной. Прокариоты не имеют дифференцированного аппарата митоза, у них нет ядрышка. Кроме того, они имеют рибосомы 70S, и большинство их имеет клеточную стенку, содержащую пептидогликан, который отсутствует у эукариот. Размеры прокариот варьируют в пределах 1 – 20 мкм. У прокариот нет митохондрий и хлоропластов. Среди них есть аэробные и анаэробные организмы.

Архебактерии. В 70 – 80 гг. XX в. были использованы новые признаки при создании дендрограмм (древа жизни); сравнивали гены (или их продукты), выполняющие одну и ту же функцию, у разных классов организмов, например нуклеотидные последовательности 16S рРНК (18S рРНК) из 6 или большего числа остатков. Построенные по этим признакам дендрограммы выявили три высшие таксономические группы (домена): эубактерий, архебактерий и эукариот. При этом оказалось, что архебактерии отличаются от эубактерий и эукариот в такой же степени, в какой последние отличаются друг от друга. Основные отличия архебактерий от эубактерий: химический состав жесткой клеточной стенки различный, у архебактерий она не содержит пептидогликана; у архебактерий особая химическая структура липидов, иной компонентный состав РНК-полимераз; есть повторяющиеся последовательности в составе хромосомной ДНК; наличие интронов в генах тРНК и рРНК; различие в химическом составе и строении рибосом.

Сходство архебактерий с эукариотами: наличие интронов в генах тРНК и рРНК; наличие в хромосомных ДНК повторяющихся последовательностей; сходный компонентный состав РНК-полимераз; чувствительность белоксинтезирующих систем к дифтерийному токсину; сходство ферментных систем, участвующих в процессах репликации, транскрипции и трансляции. Рибосомы архебактерий имеют сходство с рибосомами 70S и 80S.

Таким образом, существуют четыре царства жизни: эукариоты; эубактерии; архебактерии; вирусы и плазмиды.

Среди архебактерий выделяют следующие группы:

1. Метаногены – организмы, являющиеся строгими анаэробами. Энергию для роста получают путем восстановления СО2 до метана по реакции: СО2 + 4Н2 = СН4 + + 2Н2О, ΔG° = – 31,3 ккал/моль (водород потребляется из атмосферы).

2. Экстремальные галофилы – аэробные бактерии, способные расти в насыщенном растворе NaCl (до 32 %), нижняя пороговая концентрация NaCl = 12 – 15 %. Обладают системой фотосинтеза, отличной от таковой у других фотосинтезирующих бактерий (в мембране галофильных бактерий присутствует не хлорофилл, а бактериородопсин).

3. Термоацидофилы – характеризуются высокими оптимальными температурами (от 75 до 90 °C) и низкими значениями рН (от 5 – 6 до 1 – 2), опимальными для своего роста. Сумма Г + Ц у архебактерий варьирует от 28 до 68 мол%. Экстремальные условия существования архебактерий, вероятнее всего, указывают на то, что их предки возникли тогда, когда физические условия существенно отличались от современных. Патогенных для человека видов среди архебактерий не обнаружено.

Эубактерии. Длина хромосомы Escherichia coli составляет 1,6 мм; хромосома организована в форме нуклеоида длиной в 1 мкм, т. е. в структуру в 1600 раз более короткую. Упаковка ДНК в пределах нуклеоида существует в двух вариантах: в виде длинных суперспирализованных доменов (по 1000 000 п. н. в каждом), у E. coli таких доменов 43; и в виде коротких доменов из нескольких сот пар нуклеотидов. Стабилизирующую роль в такой упаковке играют специфические белки. У энтеробактерий известно не менее 5 таких белков: H, H1, HU, IFN, HLP1, которые имеют сходство с гистонами.

Эукариоты имеют рибосомы 80S, митохондрии или хлоропласты (в этих структурах содержатся рибосомы 70S), не содержат пептидогликана; все они – аэробные организмы. К эукариотам относятся все высшие растения и животные. Жгутики у эукариот состоят из белка тубулина и представляют собой систему микротрубочек, распологающихся по типу 9 + 2 и связанных с базальным телом. Жгутики у прокариот не содержат систем микротрубочек и построены из белка флагеллина.

Принципы систематики и классификации микроорганизмов

Систематика занимается всесторонним описанием видов организмов, выяснением степени родственных отношений между ними и объединением их в различные по уровню родства классификационные единицы (таксоны). Классификация – составная часть систематики. Она сводится к распределению организмов в соответствии с их общими признаками по различным таксонам. Таксономия – наука о принципах и методах распределения (классификации) организмов в иерархическом плане. Основной таксономической единицей в биологии является вид (species). Виды объединяют в таксоны более высоких рангов: род (genus), триба (tribus), семейство (familia), порядок (ordo), класс (classis), тип (phylum). Помимо этих основных категорий, используются также дополнительные – подрод, подтриба, подсемейство, подпорядок, подкласс, подтип. Иногда употребляются также неформальные категории «отдел» и более общая – «группа».

Общее для всех живых существ определение понятия «вид» дать чрезвычайно трудно в связи с многообразием форм жизни. В микробиологии были предложены различные понятия вида. Н. А. Красильников, автор фундаментального труда «Определитель бактерий и актиномицетов» (1949), дал следующее определение вида: «Вид – группа или совокупность близких между собой организмов, которые имеют общий корень происхождения, на данном этапе эволюции характеризуются определенными морфологическими, биохимическими и физиологическими признаками, обособлены отбором от других видов и приспособлены к определенной среде обитания». Это определение подвергалось различными авторами модификациям. Сейчас, когда стало понятно, что степень родства бактерий, их свойства и признаки зависят от их собственных геномов, можно дать более краткое определение вида: Вид – совокупность микроорганизмов, имеющих общий корень происхождения, сходный генотип (степень гомологии ДНК 60 % и более, близкое суммарное содержание пар Г + Ц) и максимально близкие фенотипические признаки.

Специфические особенности микроорганизмов определили и набор тех признаков и свойств, которые используются для их систематики и классификации.

1. Морфологические признаки – величина, форма, характер взаиморасположения.

2. Тинкториальные свойства – способность окрашиваться различными красителями. Особенно важным признаком является отношение к окраске по Граму, которое зависит от структуры и химического состава клеточной стенки бактерий. По этому признаку все бактерии делятся на грамположительные и грамотрицательные. Морфологические свойства и отношение к окраске по Граму определяют принадлежность к крупным таксонам – роду, семейству и т. д.

3. Культуральные свойства – особенности роста бактерий на жидких (образование пленки, осадок, помутнение) и плотных (форма, размеры, консистенция, края, поверхность, прозрачность колоний, образование пигмента и другие свойства) питательных средах. В микробиологии широко используют такие специфические термины, как «колония», «культура», «штамм», «типы» или «варианты». Под колонией принято понимать видимую простым глазом изолированную структуру, образующуюся в результате размножения и накопления бактерий за определенный срок инкубации. Колония образуется обычно из одной родительской клетки или из нескольких идентичных клеток. Поэтому пересевом из изолированной колонии может быть получена чистая культура возбудителя. Под культурой понимают всю совокупность бактерий, выросших на плотной или жидкой питательной среде. Как колония, так и культура каждого вида характеризуются определенными признаками. Основной и главный принцип бактериологии – во избежание ошибок изучать свойства только чистых, однородных культур. Каждая выделенная культура данного вида бактерий называется также штаммом, т. е. конкретным образцом данного вида (нем. stammen – происходить). Штаммы одного и того же вида бактерий, различающиеся по антигенному строению, называют серотипами (сероварами, серовариантами), по чувствительности к фагу – фаготипами (фаговарами), по биохимическим или культуральным признакам – биотипами (биоварами) и т. п. Штамм можно считать низшей таксономической единицей бактерий.

4. Подвижность бактерий. Различают бактерии подвижные и неподвижные. Подвижные бактерии подразделяют на ползающие, или скользящие, они передвигаются за счет волнообразного сокращения клеток; и плавающие бактерии, у которых активная подвижность связана с наличием жгутиков.

5. Спорообразование – форма и характер расположения споры в клетке.

6. Физиологические свойства – способы углеродного (аутотрофы, гетеротрофы), азотного (аминоавтотрофы, аминогетеротрофы) питания; тип дыхания: аэробы, факультативные анаэробы, строгие анаэробы, микроаэрофилы.

7. Биохимические свойства – способность ферментировать различные углеводы, протеолитическая активность, образование индола, сероводорода, наличие уреазы и других ферментов и т. д.

8. Чувствительность к специфическим бактериофагам.

9. Антигенные свойства. Они зависят от химического состава клеточной стенки и жгутиков бактерий.

10. Химический состав клеточных стенок (содержание и состав основных сахаров и аминокислот).

11. Липидный и жирнокислотный состав. Изучение состава жирных кислот проводят с помощью газовой хроматографии, которая обладает высокой разделительной способностью и чувствительностью.

12. Белковые спектры. С помощью различных методов фракционирования, а главным образом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле, разделяют сложные смеси рибосомных, мембранных или внутриклеточных белков и получают электрофореграммы, или белковые спектры, соответствующей фракции данного вида бактерий.

В связи с тем, что количество фенотипических признаков, используемых для классификации микроорганизмов, значительно возросло, в конце 50-х гг. ХХ в. возникла нумерическая (численная) таксономия. Ее возникновению способствовало появление более совершенных компьютерных систем, которые позволяют быстро и точно производить громоздкие математические расчеты. В основе нумерической таксономии лежит принцип сопоставления организмов по возможно большему количеству учитываемых признаков при допущении, что все они для систематики равноценны. Однако принцип равнозначности является основным недостатком этого метода.

В последние годы для классификации бактерий помимо изучения их фенотипических свойств все более широко используют методы геносистематики. В ее основе лежит изучение нуклеотидного состава ДНК и наиболее важных характеристик генома, в частности его размера (величина, объем, молекулярная масса) и других параметров. Наиболее точным методом установления генетического (геномного) родства между бактериями является определение степени гомологии ДНК. Чем больше идентичных генов, тем выше степень гомологии ДНК и ближе генетическое родство.

Метод молекулярной гибридизации ДНК – ДНК считается сейчас наиболее важным для систематики бактерий. Однако четких и твердо установленных критериев степени гомологии ДНК для таких рангов, как вид и род бактерий, еще нет. Допускают, что диапазон гомологии ДНК от 60 до 100 % говорит о принадлежности к одному и тому же виду, степень гомологии от 40 до 60 % – к разным родам одного семейства. Таким образом, подобно тому, как фенотип и генотип отражают сущность организма, феносистематика и геносистематика отражают сходство и различие организмов, степень их генетического родства. Признаки, используемые для систематики бактерий, используют и для их идентификации, т. е. для установления их таксономического положения и прежде всего видовой принадлежности, что является решающим моментом бактериологической диагностики инфекционных заболеваний. Чаще всего для идентификации патогенных бактерий изучают их морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические и антигенные свойства, а при необходимости и некоторые другие, например отношение к специфическим фагам, антибиотикам и т. д.

Современные методы микробиологической диагностики инфекционных заболеваний

Основные требования, предъявляемые к современным методам микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, – высокая специфичность и чувствительность. Эти методы следующие.

Микроскопический. С помощью микроскопии нативного патологического материала, полученного от больного, определяют вид возбудителя по его форме, взаиморасположению клеток и способности окрашиваться определенными красителями.

Бактериологический. Метод основан на выделении чистой культуры возбудителя и его идентификации.

В настоящее время разработаны различные автоматические системы, позволяющие в течение нескольких часов определить вид возбудителя и изучить его антибиотикограмму (см. с. 184).

Серологический. Метод основан на определении в крови больных или переболевших специфических антител к соответствующим возбудителям с помощью различных реакций: агглютинации, преципитации, связывания комплемента, иммунной флуоресценции, иммуноферментного и радиоиммунного методов и др. Серологические реакции, кроме того, могут быть использованы и для непосредственного обнаружения антигенов возбудителя в исследуемом материале (реакции пассивной гемагглютинации, коагглютинации, латекс-агглютинации, агрегат-гемагглютинации, иммунофлуоресценции и т. д.).

Биологический. В основе метода лежит заражение лабораторных животных исследуемым материалом с целью воспроизведения у них инфекционного заболевания и (или) последующего выделения возбудителя.

Аллергические пробы. С помощью этих проб обнаруживают повышенную чувствительность макроорганизма к определенным возбудителям или продуктам их жизнедеятельности. Аллергические реакции характеризуются антигенной специфичностью, для их выявления применяют препараты, называемые аллергенами.

За последние годы самое широкое применение для идентификации и дифференциации микроорганизмов получили молекулярно-биологические методы: методы молекулярных, или генных, зондов, особенно в сочетании с полимеразной цепной реакцией; метод геномной дактилоскопии (ДНК-фингерпринт, англ. finger-print – отпечаток пальца) и др.

Метод генных зондов (ДНК– и РНК-зондов) – основан на реакции гибридизации между фрагментом нуклеотидной последовательности (зондом), несущим наиболее специфический для определенного вида бактерий или вирусов ген (гены), и ДНК (РНК) микроорганизма, находящегося в исследуемом субстрате. Точность метода зависит от качества зонда (его чистоты). Наилучшими ДНК– и РНК-зондами служат полученные путем химического синтеза олигонуклеотидные последовательности (о. п.), расположение нуклеотидов в которых полностью соответствует таковому участка гена (или всего гена), ответственного за определенную функцию микроорганизма. ДНК-зонды метят различными способами: изотопами, специальным белком биотином, флуорохромами и т. п.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, или ЦПР). Выдающуюся роль для создания новых типов ДНК-зондов (ДНК-маркеров) сыграло использование метода амплификации (англ. amplification – увеличение) in vitro определенного участка ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов полимеразной реакции. Кэри Мюллису, предложившему в 1983 г. метод ПЦР, в 1993 г. была присуждена Нобелевская премия. Метод ПЦР позволяет быстро получить более 10 млн копий определенной о. п. ДНК, первоначально представленной одной или несколькими молекулами. Модификации метода ПЦР легли в основу создания различных типов ДНК-маркеров – праймеров (англ. primer – запал, средство воспламенения). ПЦР используют для обнаружения любого агента, если для него имеется соответствующий праймер. ПЦР незаменима в тех случаях, когда трудно или даже невозможно выделить чистую культуру возбудителя. Предложен метод генотипирования, который основан на количественном анализе многолокусных генотипов бактерий (MLVA – анализ многолокусных вариантов) бактерий. Один из его вариантов используют для генотипирования бактерий, содержащих вариабельное число тандемных повторов (variable number of tandem repeats – VNTR).

Геномная дактилоскопия (ДНК-фингерпринт) основана на рестрикционном анализе ДНК микроорганизмов с применением специфических зондов. Этот метод позволяет исследовать полиморфизм множества локусов повторяющихся о. п. (мультилокусный анализ) в ДНК различных организмов. С его помощью можно выявить в геноме млекопитающих более 30 высокополиморфных локусов, что достаточно для индивидуальной идентификации человека, животных и растений.

Современная классификация бактерий

В «Определителе бактерий-9» (1984 – 1989) прокариоты в зависимости от строения клеточной стенки разделены на 17 частей:

Часть 1. Спирохеты (5 родов).

Часть 2. Аэробные (микроаэрофильные), подвижные, вибрионоподобные грамот рицательные бактерии (7 родов).

Часть 3. Неподвижные (иногда подвижные) грамотрицательные изогнутые бакте рии (7 родов).

Часть 4. Грамотрицательные аэробные палочки и кокки (8 семейств, в том числе Pseudomonadaceae; 37 родов).

Часть 5. Факультативно анаэробные грамотрицательные палочки (3 семейства: Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Pasteurellaceae; 34 рода).

Часть 6. Анаэробные грамотрицательные, прямые и изогнутые палочки (семей ство Bacteroidaceae – 13 родов).

Часть 7. Сульфат или серувосстанавливающие бактерии (7 родов).

Часть 8. Анаэробные грамотрицательные кокки (семейство Veillonellaceae – 3 рода).

Часть 9. Риккетсии и хламидии (2 порядка, 4 семейства, 3 трибы, 15 родов).

Часть 10. Микоплазмы. Отдел Tenericutes. Класс Mollicutes (3 семейства, 6 родов).

Часть 11. Эндосимбионты простейших (реснитчатых, жгутиковых, амеб – 5 родов), грибов, насекомых и других беспозвоночных.

Часть 12. Грамположительные кокки (2 семейства, 15 родов, в том числе Stаphylococcus и Streptococcus).

Часть 13. Грамположительные палочки и кокки, образующие споры (6 родов, в том числе Bacillus и Clostridium).

Часть 14. Не образующие спор грамположительные правильные палочки (7 родов).

Часть 15. Грамположительные неправильные палочки, не образующие спор (21 род, в том числе Corynebacterium).

Часть 16. Микобактерии (семейство Mycobacteriaceae, род Mycobacterium).

Часть 17. Нокардиоподобные бактерии (9 родов).

Однако уже в 1993 г. в определитель Берги были внесены новые изменения. Все 4 отдела («главные категории») были разделены на группы, перечисленные ниже.

ОТДЕЛ I. Грамотрицательные эубактерии, имеющие клеточную стенку, или Gracilicutes

Группа 1. Спирохеты. Роды: Borrelia, Brachyspira, Cristispira, Leptonema, Leptospira, Serpulina, Spirochaeta, Treponema.

Группа 2. Аэробные (или микроаэрофильные), подвижные, вибриоидные грамотрицательные бактерии. Роды: Alteromonas, Aquaspirillum (кроме A. fasciculus), Azospirillum, Bdellovibrio, Campylobacter, Cellvibrio, Halovibrio, Helicobacter, Herbaspirillum, Marinomonas, Micavibrio, Oceanospirillum, Spirillum, Sporospirillum, Vampirovibrio, Wolinella.

Группа 3. Неподвижные (или редко подвижные) грамотрицательные изогнутые бактерии. Роды: Ancylobacter, «Brachyarcus», Cyclobacterium, Flectobacillus, Meniscus, «Pelosigma», Runella, Spirosoma.

Группа 4. Грамотрицательные аэробные (или микроаэрофильные) палочки и кокки.

Подгруппа 4а. (Аэробы, палочки и кокки, которые растут в атмосфере воздуха, содержащего 21 % кислорода). Роды: Acetobacter, Acidophilium, Acidomonas, Acidothermus, Acidovorax, Acinetobacter, Afipia, Agrobacterium, Agromonas, Alcaligenes, Alteromonas, Aminobacter, Aquaspirillum fasciculus, Azomonas, Azorhizobium, Azotobacter, Beijerinckia, Bordetella, Bradyrhizobium, Brucella, Chromohalobacter, Chryseomonas, Comamonas, Cupriavidus, Deleya, Derxia, Ensifer, Erythrobacter, Flavimonas, Flavobacterium, Francisella, Frateuria, Gluconobacter, Halomonas, Hydrogenophaga, Janthinobacterium, Kingella, Lampropedia, Legionella, Marinobacter, Marinomonas, Mesophilobacter, Methylobacillus, Methylobacterium, Methylococcus, Methylomonas, Methylophaga, Methylophilus, Methylovorus, Moraxella, Morococcus, Neisseria, Oceanospirillum, Ochrobacterium, Oligella, Paracoccus, Phenylobacterium, Phyllobacterium, Pseudomonas, Psychrobacter, Rhizobacter, Rhizobium, Rhizomonas, Rochalimaea henselae, Roseobacter, Rugamonas, Serpens, Sinorhizobium, Sphingobacterium, Thermoleophilum, Thermomicrobium, Thermus, Variovorax, Volcaniella, Weeksella, Xanthobacter, Xanthomonas, Xylella, Xylophilus, Zoogloea.

Подгруппа 4б. (Микроаэрофилы, не растут при концентрации кислорода в воздухе 21 %). Роды: Taylorella, Wolinella, Bacteroides (B. urealyticus и B. gracilis).

Группа 5. Факультативно-анаэробные грамотрицательные палочки.

Подгруппа 1. Семейство Enterobacteriaceae. Роды: Arsenophonus, Budvicia, Buttiauxella, Cedecea, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclerica, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Salmonella, Serratia, Shigella, Tatumella, Xenorhabdus, Yersinia, Yokenella.

Подгруппа 2. Семейство Vibrionaceae. Роды: Aeromonas, Enhydrobacter, Photobacterium, Plesiomonas, Vibrio (14 видов).

Подгруппа 3. Семейство Pasteurellaceae. Роды: Actinobacillus, Haemophilus, Pasteurella.

Подгруппа 4. Другие роды: Callymatobacterium, Cardiobacterium, Chromobacterium, Eikenella, Gardnerella, Streptobacillus, Zymomonas.

Группа 6. Грамотрицательные, анаэробные прямые, изогнутые и спиральные палочки. Роды: Acetivibrio, Acetoanaerobium, Acetofilamentum, Acetogenium, Acetomicrobium, Acetothermus, Acidaminobacter, Anaerobiospirillum, Anaerorhabdus, Anaerovibrio, Bacteroides, Butyrivibrio, Centipeda, Fervidobacterium, Fibrobacter, Fusobacterium, Haloanaerobium, Halobacteroides, Llyobacter, Lachnospira (см. также группу 20), Leptotrichia, Malonomonas, Megamonas, Mitsuokella, Oxalobacter, Pectinatus, Pelobacter, Porphyromonas, Prevotella, Propionigenium, Propionispira, Rikenella, Roseburia, Ruminobacter, Sebaldella, Selenomonas, Sporomusa, Succinimonas, Succinivibrio, Syntrophobacter, Syntrophomonas, Thermobacteroides, Thermosipha, Thermotoga, Tissierella, Wolinella, Zymophilus.

Группа 7. Диссимилирующие сульфат или серуредуцирующие бактерии. Роды: Desulfuromonas, Desulfovibrio, Desulfomonas, Desulfococcus, Desulfobacter, Desulfosarcina, Desulfobulbus.

Группа 8. Анаэробные грамотрицательные кокки. Семейство Veillonellaceae. Роды: Acidaminococcus, Megasphaera, Syntrophococcus, Veillonella.

Группа 9. Риккетсии и хламидии.

Порядок I. Rickettsiales. Pиккетсии. Семейство Rickettsiaceae. Роды: Rickettsia,

Rochalimaea, Coxiella, Ehrlichia, Cowdria, Neorickettsia, Wolbachia, Rickettsiella. Семейство Bartonellaceae. Роды: Bartonella, Grahamella. Семейство Anaplasmataceae. Роды: Anaplasma, Aegyptianella, Haemobartonella, Eperythrozoon.

Порядок II. Chlamydiales. Хламидии. Семейство Chlamydiaceae, род Chlamydia.

Группа 10. Аноксигенные (не образующие кислорода) фототрофные бактерии. Содержат бактериохлорофилл и каротиноидные пигменты, но не содержат фикобилипротеинов. Могут использовать свет как источник энергии. Фотоаутотрофы или фотоорганотрофы в анаэробных или микроаэрофильных условиях, не образуют при фотосинтезе О2. В отличие от оксигенного фотосинтеза аноксигенный фотосинтез зависит от внешних доноров электронов (восстановленные серные соединения, молекулярный водород или органические соединения).

Группа 11. Оксигенные (образующие кислород) фототрофные бактерии.

Содержат хлорофилл а, могут использовать свет как источник энергии и образуют О2 по такому же способу, как и зеленые растения. Различают две подгруппы: 1. Cодержат хлорофилл а и имеют фикобилипротеины (аллофикоцианин, фикоцианин и иногда фикоэритрин). Эти организмы называют цианобактериями, или синезелеными водорослями. 2. Cодержат хлорофилл а и хлорофилл b, но не содержат фикобилипротеинов.

Группа 12. Аэробные хемолитотрофные бактерии и родственные организмы. Нефототрофные организмы. Различают следующие подгруппы: 1. Нитрифицирующие. Могут использовать в качестве источника энергии для своего роста восстановленные неорганические соединения азота (соли аммония и нитриты). 2. Серуокисляющие. Могут окислять восстановленные неорганические соединения серы, и большинство организмов использует их в качестве единственного источника энергии. 3. Облигатные окислители водорода. Используют газообразный водород (Н2) как источник энергии для роста, но не используют органических соединений углерода. 4. Бактерии, которые образуют или откладывают железо и/или оксиды марганца на клетках или внутри них. 5. Магнитоподвижные бактерии. Проявляют магнитотаксис в магнитных полях. Бактерии содержат богатые железом электронно-плотные внутриклеточные включения (магнитосомы).

Группа 13. Почкующиеся и/или образующие придатки бактерии. Нефототрофные бактерии, которые подразделяются на следующие подгруппы: 1. Бактерии, имеющие простеки (лат. prosteca) – полужесткое удлинение клеточной стенки, цитоплазматической мембраны и цитоплазмы, которое имеет диаметр меньший, чем сама клетка. А. Размножающиеся асимметрично путем почкования. Почки могут образовываться на кончике простека или на клеточной поверхности. Б. Размножающиеся путем бинарного поперечного деления. 2. Бактерии, не образующие простека. А. Почкующиеся бактерии. Б. Непочкующиеся бактерии, имеющие стебельки. В отличие от простека, стебелек представляет собой лентовидную или трубчатую структуру, образуемую из материала, секретируемого бактериальной клеткой. С помощью стебелька бактерии прикрепляются к поверхностям. В. Другие бактерии: а) бактерии, несущие тонкие нити, покрытые оксидами марганца; б) бактерии, несущие тонкие волокнистые структуры, не покрытые оксидами металлов; в) бактерии, имеющие стебельки (полые конические выросты, видимые с помощью световой микроскопии и имеющие поперечные полосы, которые обнаруживаются при электронной микроскопии).

Группа 14. Бактерии, образующие футляры. Нефототрофы. Аэробы. Не обладают скользящей подвижностью. Бактерии растут в виде цепочек клеток в нитях. Нити растут в трубках-футлярах из экзоклеточного материала. В типичных случаях футляр прозрачный; когда рассматривается во влажной среде с помощью фазово-контрастной микроскопии, очень похож на микроскопическую пластиковую трубочку или дудку. Иногда футляр настолько тонкий и тесно связан с клеткой, что он с трудом выявляется при фазовоконтрастной микроскопии. Добавление 95 %-ного этанола в «висячую» или «раздавленную» каплю облегчает выявление футляра. Другим способом футляр может быть обнаружен, если в нити имеются разрывы между клетками. Футляры могут иметь окраску от желтого до темно-коричневого цвета, созданную отложениями железа или оксидов марганца. Одиночные клетки могут быть неподвижными или подвижными, когда имеют жгутики с полярным или субполярным расположением. Роды: «Clonothrix», Crenothrix, Haliscomenobacter, Leptothrix, «Lieskella», «Phragmidiothrix», Sphaerotilus.

Группа 15. Нефотосинтезирующие, не образующие плодов скользящие бактерии. Нефототрофные палочки или нити, лишенные жгутиков, но обладающие скользящей подвижностью на твердых поверхностях.

Группа 16. Образующие плоды скользящие бактерии. Миксобактерии.

ОТДЕЛ II. Грамположительные эубактерии, имеющие клеточную стенку, или Firmicutes

Группа 17. Грамположительные кокки. Роды: Aerococcus, Coprococcus, Deinobacter, Deinococcus, Enterococcus, Gemella, Lactococcus, Leuconostoc, Marinococcus, Melissococcus, Micrococcus, Pediococcus, Peptostreptococcus, Planococcus, Ruminococcus, Saccharococcus, Salinicoccus, Sarcina, Staphylococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Trichococcus, Vagococcus.

Группа 18. Эндоспорообразующие грамположительные палочки и кокки. Роды: Amphibacillus, Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Oscillospira, Sporohalobacter, Sporolactobacillus, Sporosarcina, Sulfidobacillus, Syntrophospora.

Группа 19. Правильные, неспорообразующие грамположительные палочки. Роды: Brochothrix, Carnobacterium, Caryophanon, Erysipelothrix, Kurthia, Lactobacillus, Listeria, Renibacterium.

Группа 20. Неправильные, неспорообразующие грамположительные палочки. Роды: Асеtobacterium, Acetogenium, Actinomyces, Aeromicrobium, Agromyces, Arachnia, Arcanobacterium, Arthrobacter, Aureobacterium, Bifidobacterium, Brachybacterium, Brevibacterium, Butyrivibrio (могут также окрашиваться по Граму отрицательно – см. группу 6, с. 29), Caseobacter, Cellulomonas, Clavibacter, Coriobacterium, Corynebacterium, Curtobacterium, Dermabacter, Eubacterium, Exiguobacterium, Falcivibrio, Gardnerella, Jonesia, Lachnospira, Microbacterium, Mobiluncus, Pimelobacter, Propionibacterium, Rarobacter, Rothia, Rubrobacter, Sphaerobacter, Terrabacter, Thermoanaerobacter, Thermoanaerobium.

Группа 21. Микобактерии. Семейство Mycobacteriaceae. Род Mycobacterium.

Группы 22 – 29. Актиномицеты. В зависимости от морфологических свойств, по хемотипу клеточной стенки и другим химическим признакам подразделяются на 8 групп.

Группа 22. Нокардиоформные актиномицеты, включает 19 родов, в том числе Nocardia, Oerscovia, Pseudonocardia.

Группа 23. Актиномицеты с множественно расположенными спорангиями. Роды: Dermatophilus, Frankia, Geodermatophilus.

Группа 24. Актинопланеты. Включает 6 родов.

Группа 25. Стрептомицеты и близкие к ним роды, всего 5 родов.

Группа 26. Мадуромицеты, всего 7 родов.

Группа 27. Актиномицеты, образующие термоустойчивые споры. Включает 5 родов.

Группа 28. Термоактиномицеты. Один род – Thermoactinomyces, все виды термофилы.

Группа 29. Роды, которые не могут быть отнесены к какой-либо группе (3 рода).

ОТДЕЛ III. Эубактерии, лишенные клеточной стенки, или Tenericutes

Группа 30. Микоплазмы. Класс Mollicutes. Порядок Mycoplasmatales. Разделен на две подгруппы:

Подгруппа 1. Факультативные анаэробы, или микроаэрофилы. Роды: Acholeplasma, Mycoplasma, Spiroplasma, Ureaplasma.

Подгруппа 2. Облигатные анаэробы. Роды: Anaeroplasma, Asteroleplasma.

ОТДЕЛ IV. Архебактерии, или Mendosicutes

Группа 31. Метаногены. Строгие анаэробы, образуют метан как основной конечный метаболический продукт. В качестве субстратов могут служить Н2– СО2, формиат, ацетат, метанол, метиламины или Н2-метанол. Серу восстанавливают до H2S. Клетки флуоресцируют при длине волны 420 нм голубовато-зеленым цветом; имеют коэнзим М, фактор 420, фактор 430 и метанопротеин. Тип РНК-полимеразы – AB'B''.

Группа 32. Сульфатвосстанавливающие архебактерии. Строгие анаэробы, образуют H2S из солей серной кислоты путем их восстановления. Образуют также очень немного метана. Проявляют голубовато-зеленую флуоресценцию при 420 нм. В клетках содержатся фактор 420 и метанопротеин, но отсутствуют коэнзим М и фактор 430. Тип РНК-полимеразы – (А+С)B'B''. Экстремальные термофилы – растут при температуре 92 °C.

Группа 33. Экстремальные галофильные архебактерии (галоархебактерии). Аэробы или факультативные анаэробы, хемоорганотрофы, клетки могут быть грамотрицательными или грамположительными, правильной или очень неправильной формы. Требуют для роста высокой концентрации NaCl (1,5 М или выше). Нейтрофилы или алкалифилы, мезофилы или слабые термофилы (растут при t выше 55 °C). Некоторые виды содержат пурпурно-красный фотоактивный пигмент бактериородопсин и способны использовать свет для синтеза АТФ. РНК-полимераза типа AB'B''C.

Группа 34. Архебактерии, лишенные клеточной стенки. Термоацидофилы, аэробы, клетки кокковидной формы, клеточная стенка отсутствует. Цитоплазматическая мембрана содержит богатый маннозой гликопротеин и липогликан. РНК-полимераза типа ВАС.

Группа 35. Экстремально термофильные и гипертермофильные архебактерии, метаболизирующие серу. Облигатные термофилы, оптимальная температура для роста – между 70 и 105 °C. Аэробы, или факультативные анаэробы, или строгие анаэробы. Ацидофилы и нейтрофилы. Аутотрофы или гетеротрофы. Большинство видов метаболизирует серу. РНК-полимераза типа ВАС.

В 2001 г. классификация бактерий Берги вновь претерпела большие изменения. Первые 3 отдела (Gracilicutes, Firmicutes и Tenericutes) были объединены в новую неформальную группу – домен эубактерий (Bacteria), а 4-й отдел (Mendosicutes) выделен как самостоятельный домен архебактерий (Archaea) с двумя типами – AI Crenarchaeota (1 класс, 25 родов) и AII Euryarchaeota (8 классов, 55 родов). Основные группы архебактерий перечислены на с. 23, 31.

Домен эубактерий поделен на 24 типа, которые разделены на 33 класса. Бактерии, описанные в учебнике и чаще всего вызывающие инфекционные заболевания людей, включены в следующие типы, классы и роды. Тип Proteobacteria. Класс Alphaproteobacteria [роды Rickettsia, Orientia (к которому теперь относят возбудителя лихорадки цуцугамуши Rickettsia orientalis (= R. tsutsugamushi), Ehrlichia, Bartonella, Brucella]. Класс Betaproteobacteria [роды Alcaligenus, Bordetella, Burkholderia (включающий возбудителей сапа и мелиоидоза, ранее называвшихся Pseudomonas mallei и P. pseudomallei), Neisseria, Kingella, Spirillum]. Класс Gammaproteobacteria (роды Francisella, Legionella, Coxiella, Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter, Vibrio, Enterobacter, Citrobacter, Edwardsiella, Erwinia, Escherichia, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia, Pasteurella). Класс Epsilonproteobacteria (роды Campylobacter и Helicobacter). Тип Firmicutes. Класс Clostridia (роды Clostridium, Sarcina, Peptostreptococcus, Eubacterium, Peptococcus, Veilonella). Класс Mollicutes (роды Mycoplasma и Ureaplasma). Класс Bacilli (роды Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Streptococcus). Тип Actinobacteria (роды Actinomyces, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Propionobacterium, Bifidobacterium). Тип Chlamidiae (род Chlamidia). Тип Spirochaetes (роды Spirochaeta, Borrelia, Treponema, Leptospira). Тип Bacteroidetes. Класс Bacteroidetes (роды Bacteroides и Prevotella). Тип Fusobacteria (род Fusobacterium).

Таким образом, в классификации Берги-2001 (George M. Garrity, Julia A. Bell, Timothy G. Lilburn. Taxonomic Outline of the Prokaryotes. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition. Release 5.0, May 2004) выделены и охарактеризованы 2 домена, 26 типов, 42 класса и большое количество семейств и родов бактерий.

В определителе Берги дано следующее определение бактерий (прокариот): «единичные клетки или простые скопления сходных клеток размером 0,2 × × 10,0 мкм, которые образуют своеобразные групповые структуры. Ядерный аппарат (нуклеоид, или генофор) никогда не отделен от цитоплазмы системой унитарных (элементарных) мембран. Клеточное деление не связано с циклическими изменениями строения клетки или изменением окрашиваемости ядерного аппарата или цитоплазмы; система микротрубочек (нитей веретена) не образуется. Цитоплазматическая мембрана обычно представляет собой топологический комплекс (элементарная мембрана) и образует ячеистые, ламеллярные (пластинчатые) или трубчатые впячивания в цитоплазму; вакуоли и репликативные цитоплазматические органеллы не связаны с системой плазматической мембраны, встречаются относительно редко (газовые вакуоли; хлоробиум-везикулы, т. е. пузырьки, окруженные однослойной мембраной и содержащие аппарат фотосинтеза у некоторых фотобактерий) и окружены неунитарными мембранами. Дыхательные и фотосинтетические функции связаны с системой плазматической мембраны у тех организмов, которые обладают этими физиологическими функциями, хотя у цианобактерий они могут быть и не связаны с плазматической и тилакоидными (тилакоиды – двойные ламеллы) мембранами. Рибосомы типа 70S, кроме одной группы бактерий – архебактерий, у которых они имеют более высокое значение S и распределены по цитоплазме; эндоплазматического ретикулума с прикрепленными рибосомами нет. Цитоплазма неподвижна, ее переливания, образования псевдоподий, эндо– и экзоцитоза не происходит. Питательные вещества потребляются в молекулярной форме. Клетки окружены ригидной стенкой, хотя она имеется не у всех бактерий (ее нет у микоплазм и некоторых архебактерий). Клетки могут быть неподвижными или могут обладать плавательной подвижностью, обеспечиваемой жгутиками бактериального типа, или скользящей подвижностью на плотной поверхности. Прокариоты – преимущественно одноклеточные организмы, однако образование нитевидных мицелиальных и колониальных форм также происходит. Они обладают механизмами переноса генов и рекомбинации, но эти процессы происходят без образования гамет (половых клеток) и зигот».

Основные признаки, по которым дифференцируют прокариот и эукариот, приведены в табл. 1.

Для обозначения видов бактерий используют бинарную номенклатуру, состоящую из названия рода (пишется с заглавной буквы) и вида (пишется всегда со строчной буквы и состоит из одного слова), например, Shigella flexneri (возбудитель дизентерии – род Shigella, вид flexneri). Когда название вида неоднократно повторяется, то первый раз название рода пишется полностью, а затем пишется только начальная буква его. Например, Shigella flexneriS. flexneri. В связи со сложностью классификации бактерий названия внутривидовых форм (подвидов, серотипов и подсеротипов) часто используются как видовые, т. е. в качестве второго слова биномена – Salmonella enteritica (видовое), S. indica (подвидовое), S. typhimurium (серотип).


Таблица 1

Некоторые дифференциальные признаки прокариот и эукариот1 (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology–9)

Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

2 Некоторые бактерии (например, определенные трепонемы, микоплазмы, Haemobartonella) могут иметь ширину меньше 0,1 мкм, а другие бактерии (например, Achromatium, Macromonas) – больше 10 мкм.

3 Газовые вакуоли не ограничиваются элементарной мембраной. Везикулы, составляющие вакуоль, могут подвергаться коллапсу при внезапном гидростатическом воздействии – свойство, существенное для их идентификации.

4 Некоторые внутриклеточные фибриллы, которые могут быть микротрубочками, были описаны у Spiroplasma, цианобактерий Anabaena, некоторых спирохет и у L-форм бактерий.

5 Эндоспоры бактерий обычно устойчивы при температуре 80 °C или выше в течение 10 мин. Однако некоторые эндоспоры могут погибать при такой температурной обработке и должны быть испытаны при более низкой температуре.

6 Кроме мембран большинства микоплазм.

7 Имеются у всех грамотрицательных эубактерий и у многих грамположительных.

8 Имеются в клеточной стенке всех эубактерий, кроме хламидий; отсутствуют у архебактерий.

9 У цианобактерий они не связаны с цитоплазматической и тилакоидными мембранами.

10 За редкими исключениями, например у некоторых фотобактерий.

11 Кроме митохондрий, в которых встречается тип Mn.

12 Кроме митохондрий и хлоропластов, которые имеют 70S рибосомы.


Вопрос о самозарождении и развитии жизни на Земле

Вопрос о самозарождении и развитии жизни на Земле был и остается одним из самых главных и самых трудных вопросов науки. Теперь уже ни у кого нет сомнения в том, что самозарождение жизни могло происходить лишь после того, как возникнут чисто химическим путем важнейшие органические соединения, необходимые для того, чтобы произошел синтез прежде всего первородных генов, т. е. генов, образующихся без участия белков, до их возникновения; первородных белков, т. е. белков, которые образуются без участия генов, и генетического кода, так как без него ген не может реализовать свою задачу. В самом деле, синтез генов у всех живых организмов происходит только при участии сложной системы биосинтеза ДНК, а синтез белков происходит только по программе, заключенной в структуре гена: порядок расположения кодонов в гене определяет порядок расположения аминокислот в белке. Вот почему и возник вопрос: что возникло раньше – ген или белок? Образно говоря, что возникло раньше – курица или яйцо?

Выдающийся русский ученый А. И. Опарин, который внес большой вклад в развитие так называемой коацерватной теории происхождения жизни, получившей в XX в. общее признание, назвал этот вопрос чисто схоластическим. Однако он ошибся. Изучение структуры гена и генетического кода не оставляет никаких сомнений в том, что генетической системе принадлежит важнейшая роль в самозарождении и эволюции жизни на Земле. Нет более никакого сомнения в том, что именно ген служит основным носителем и хранителем жизни на Земле, а белок – ее творцом, поэтому вопрос о том, как возникли первородные гены, первородные белки и генетический код, приобрел основное значение для выяснения механизма зарождения жизни. Следует при этом иметь в виду, что структуры, состоящие только из первородных генов и первородных белков, сами по себе еще не способны к самостоятельному размножению, как это хорошо демонстрируют простейшие живые организмы – плазмиды и вирусы. Для того чтобы процесс самозарождения жизни состоялся, необходимо было возникновение специализированных систем жизнеобеспечения. К ним относятся следующие системы:

1. Система биологического самовоспроизводства генов, т. е. система биосинтеза ДНК.

2. Сложная биологическая система синтеза белков, которая включает в себя целый комплекс различных компонентов (мРНК, тРНК, рибосомы и комплекс особых рабочих белков).

3. Система мобилизации энергии, необходимой для синтеза всех компонентов формирующейся первородной клетки.

4. Система мембран, с помощью которых формирующаяся клетка отграничивается от внешней среды, сохраняя способность осуществлять активную и пассивную связь с ней.

5. Система, обеспечивающая саморегуляцию выражения генетической информации.

6. Система саморегуляции клеточного деления, т. е. размножения клетки.

Только после формирования всех этих систем жизнеобеспечения и возникновения уникальной структурной единицы живой материи – клетки – завершается этот первый и важнейший этап самозарождения и самоутверждения жизни на Земле. Эти вопросы более подробно рассматриваются в главе 74. Последующие этапы эволюции включали в себя появление многоклеточных организмов и их дальнейшую эволюцию в направлении растительного и животного царств. Изучением генетических механизмов эволюции занимается специальная наука – эволюционная генетика, или геномика. Однако нельзя не обратить особое внимание на предлагаемую представителями геномики гипотезу, получившую название пульсации генома. Суть ее состоит в том, что изменение генома может идти не только в сторону нарастания количества генов, но и в сторону его уменьшения. Предполагается, что это определяется не чем иным, как полинуклеотидным выбором (Пн-выбором) ДНК-реципиента. Из этого следует, что предметом естественного отбора служит не фенотипический признак, кодируемый донорной ДНК, а новые последовательности ДНК, независимо от того, какие признаки они кодируют. С этих позиций геномики естественный отбор складывается из двух этапов: Пн-выбора и фенотипического дарвиновского отбора. Такой вывод полностью совпадает с утверждением о том, что ген служит главным носителем и хранителем жизни, ее главным архитектором, т. е. именно ген играет важнейшую роль в эволюции самой живой материи.

Глава 4

Морфология бактерий

Формы бактерий

Всем бактериям присущи определенная форма и размеры, которые выражаются в микрометрах (мкм). Они варьируют в широких пределах – от 0,1 – 0,15 (Mycoplasma) до 10 – 15 мкм (Clostridium) в длине и от 0,1 мкм до 1,5 – 2,5 мкм в диаметре. Бо́льшая часть бактерий имеет размеры 0,5 – 0,8 мкм × 2 – 3 мкм.

Различают следующие основные формы бактерий: шаровидные (сферические), или кокковидные (греч. kokkos – зерно); палочковидные (цилиндрические); извитые (спиралевидные); нитевидные. Кроме того, существуют бактерии, имеющие треугольную, звездообразную, тарелкообразную форму (см. цв. вкл., рис. 1.1 – 1.8). Обнаружены так называемые квадратные бактерии, которые образуют скопления из 8 или 16 клеток в виде пласта (рис. 1.7).

Кокковидные патогенные бактерии обычно имеют форму правильного шара диаметром 1,0 – 1,5 мкм; некоторые – бобовидную, ланцетовидную, эллипсоидную форму. По характеру взаиморасположения образующихся после деления клеток кокки подразделяют на следующие группы:

1. Микрококки (греч. mikros – малый). Делятся в одной плоскости, располагаются одиночно и беспорядочно; сапрофиты; патогенных для человека нет (рис. 1.1).

2. Диплококки (греч. diplos – двойной). Деление происходит в одной плоскости с образованием пар клеток, имеющих либо бобовидную (Neisseria gonorrhoeae), либо ланцетовидную (Streptococcus pneumoniae) форму (рис. 1.2).

3. Стрептококки (греч. streptos – цепочка). Деление клеток происходит в одной плоскости, но размножающиеся клетки сохраняют между собой связь и образуют различной длины цепочки, напоминающие нити бус. Многие стрептококки являются патогенными для человека и вызывают различные заболевания: скарлатину, ангину, гнойные воспаления и др. (рис. 1.3).

4. Стафилококки (греч. staphyle – гроздь винограда). Деление происходит в нескольких плоскостях, а образующиеся клетки располагаются скоплениями, напоминающими гроздья винограда. Стафилококки вызывают более 100 различных заболеваний человека. Они наиболее частые возбудители гнойных воспалений (рис. 1.4).

5. Тетракокки (греч. tetra – четыре). Деление клеток происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях с образованием тетрад. Патогенные для человека виды встречаются очень редко (рис. 1.5).

6. Сарцины (лат. sarcina – связка, тюк). Деление клеток происходит в трех взаимно перпендикулярных плоскостях с образованием пакетов (тюков) из 8, 16, 32 и большего числа особей. Особенно часто встречаются в воздухе. Имеются условнопатогенные представители (рис. 1.6).

Палочковидные (цилиндрические) формы бактерий. Термин «бактерия» (греч. bakterion – палочка) применяется как для названия всего царства прокариот (Eubacteria, Archebacteria), так и для названия палочек, не образующих спор. Палочки, образующие споры, подразделяют на бациллы (лат. bacillus – палочка) – аэробные спорообразующие бактерии, например Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы, и клостридии (лат. clostridium – веретенообразный) – анаэробные спорообразующие бактерии, например Clostridium tetani – возбудитель столбняка. Палочки бывают длинными – более 3 мкм (Clostridium novyi – возбудитель газовой гангрены), короткими – 1,5 – 3,0 мкм (Escherichia coli и большинство возбудителей кишечных инфекций) и очень короткими – менее 1,0 мкм – в виде коккобактерий (Francisella tularensis – возбудитель туляремии, Brucella melitensis – бруцеллеза). Концы палочек могут быть закругленными (Escherichia coli и др.), заостренными (Fusobacterium), утолщенными (Corynebacterium), обрезанными (Bacillus anthracis);

палочка может иметь овоидную (яйцевидную) форму (Yersinia pestis – возбудитель чумы). По диаметру их делят на тонкие (Mycobacterium tuberculosis – возбудитель туберкулеза) и толстые (Clostridium perfringens – возбудитель газовой гангрены). По взаиморасположению бактерий их подразделяют на три группы (см. цв. вкл., рис. 2.1 – 2.6): 1) монобактерии – палочки располагаются одиночно и беспорядочно, сюда относится большинство палочковидных форм (рис. 2.1); 2) диплобактерии, располагающиеся попарно (Pseudomonas) (рис. 2.2); 3) стрептобактерии (Haemophilus ducreyi – возбудитель мягкого шанкра) или стрептобациллы (Bacillus anthracis) – бактерии, располагающиеся цепочкой (рис. 2.3 и 2.4).

Извитые (спиралевидные) бактерии по количеству и характеру завитков, а также по диаметру клеток подразделяют на две группы: 1) вибрионы (греч. vibrio – извиваюсь, изгибаюсь) имеют один изгиб, не превышающий четверти оборота спирали, однако могут иметь и форму прямой палочки, без изгиба (Vibrio cholerae – возбудитель холеры) (рис. 2.5); 2) спириллы (греч. speira – спираль) – клетки, имеющие большой диаметр и малое (2 – 3) число завитков (Spirillum minor – возбудитель содоку) (рис. 2.6). Особую группу спиралевидных бактерий представляют спирохеты, выделенные в порядок Spirochaetales. Их морфология подробно описана в гл. 69.

Нитевидные формы бактерий. Различают два типа нитевидных бактерий: образующие временные нити и постоянные.

Временные нити, иногда с ветвлениями, образуют палочковидные бактерии при нарушении условий их роста или регуляции клеточного деления (микобактерии, коринебактерии, а также риккетсии, микоплазмы, многие грамотрицательные и грамположительные бактерии). При восстановлении механизма регуляции деления и нормальных условий роста эти бактерии восстанавливают обычные для них размеры.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 2.7. Нитевидные бактерии.

Sphaerotilus natans, часть влагалища пустая


Постоянные нитевидные формы образуются из палочковидных клеток, соединяющихся в длинные цепочки либо с помощью слизи, либо чехлами (влагалищами, рис. 2.7), либо мостиками. Влагалищами, или футлярами, называют трубковидные чехлы гетерополисахаридной природы. Слизь может связывать отдельные клетки в длинные нити (Zoogloea) или пленки (Bacteriogloea). Нитевидные формы образуют серобактерии и железобактерии.

Следует особо отметить, что бактерии отличаются высоким полиморфизмом (индивидуальной изменчивостью формы, не передающейся по наследству), особенно при культивировании на искусственных питательных средах. Под действием различных факторов (антибиотиков, химических веществ) могут возникать необычные по форме и величине клетки, которые, однако, способны ревертировать в исходное состояние при снятии действия этих факторов.

Строение бактериальной клетки

Клетка – универсальная структурная единица живой материи. Подтверждением этому является сходство в химическом составе бактерии и клетки млекопитающего, которая в 2000 раз больше первой (табл. 2).


Таблица 2

Примерный химический состав типичной бактерии и типичной клетки

Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Организация бактериальной клетки позволяет ей координировать все процессы жизнедеятельности, за определенный срок удваивать свою биомассу и размножаться путем бинарного деления. В составе бактериальной клетки можно выделить различные структуры (рис. 3):


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 3. Схема строения бактериальной клетки:

1 – клеточная стенка; 2 – цитоплазматическая мембрана; 3 – цитоплазма; 4 – нуклеоид; 5 – мезосома; 6 – периплазматическое пространство; 7 – включения; 8 – рибосома; 9 – капсула; 10 – микрокапсула; 11 – жгутик; 12 – плазмида; 13 – донорная ворсинка; 14 – фимбрии (реснички); 15 – перемычки в периплазматическом пространстве


Клеточная стенка

Клеточная стенка – структурный компонент, присущий только бактериям (кроме микоплазм). Клеточная стенка выполняет следующие функции:

1. Определяет и сохраняет постоянную форму клетки.

2. Защищает внутреннюю часть клетки от действия механических и осмотических сил внешней среды.

3. Участвует в регуляции роста и деления клеток.

4. Обеспечивает коммуникацию с внешней средой через каналы и поры.

5. Несет на себе специфические рецепторы для бактериофагов.

6. Определяет во многом антигенную характеристику бактерий (природу и специфичность О– и К-антигенов).

7. Содержащийся в ее составе пептидогликан наделяет клетку важными иммунобиологическими свойствами (см. ниже).

8. Нарушение синтеза клеточной стенки бактерий является главной причиной их L-трансформации.

Строение клеточной стенки. В ее составе имеется два слоя: наружный – пластичный и внутренний – ригидный. Основу клеточной стенки составляет пептидогликан, который ранее называли муреином (лат. mureus – стенка). Он имеется только у эубактерий (кроме микоплазм). Пептидогликан (см. цв. вкл., рис. 4) включает в себя остов и два набора пептидных цепочек – боковых и поперечных. Остов пептидогликана одинаков у всех бактерий и состоит из чередующихся молекул аминосахаров – N-ацетилглюкозамина (N-АцГлю) и N-ацетилмураминовой кислоты (N-АцМур), связанных между собой β-гликозидными связями (рис. 5). Боковые цепочки в каждой молекуле пептидогликана представлены набором идентичных тетрапептидов. Поперечные цепочки также представлены набором из идентичных для данной молекулы пептидогликана пентапептидов, содержащих глицин, – пентаглицинов, однако у разных видов бактерий боковые и поперечные пептиды различны. В тетрапептидной боковой цепочке у большинства грамотрицательных бактерий имеется диаминопимелиновая (диаминопимеловая) кислота (ДАП) – уникальный компонент клеточной стенки, обнаруженный только у прокариот. Кроме того, в составе боковых цепочек пептидогликана обнаружены D-аминокислоты (D-аланин, D-глутамин). Боковые тетрапептиды связаны с N-ацетилмураминовой кислотой остова. Связывание боковых тетрапептидов между собой происходит путем образования поперечных пентаглициновых мостиков между D-аланином одной цепи и диаминопимелиновой кислотой (или иной аминокислотой) другого бокового пептида. Наличие двух типов связей (гликозидные и пептидные), которые соединяют субъединицы пептидогликанов, придает этому гетерополимеру структуру молекулярной сети (см. цв. вкл., рис. 4). Благодаря этим связям пептидогликановый слой клеточной стенки образует огромного размера ригидную мешковидную макромолекулу, которая окружает протопласт, уравновешивает его тургорное давление (у E. coli – до 15 атм.) и придает ему определенную постоянную форму. Пептидогликан может разрушаться под действием различных ферментов, а его синтез блокируют бета-лактамные антибиотики.

Связь между N-ацетилмураминовой кислотой и N-ацетилглюкозамином разрушается лизоцимом, связь между N-ацетилмураминовой кислотой и боковым пептидом (его L-аланином) расщепляют амидазы, а связи межпептидные – эндопептидазы. Пентаглициновый мостик стафилококкового пептидогликана разрушается лизостафином. Образование поперечных сшивок между боковыми цепочками тетрапептидов блокируется пенициллинами (бета-лактамными антибиотиками). Это приводит к разрыхлению пептидогликановой сети, следствием чего является осмотический лизис растущих клеток. Пептидогликан, помимо того что он определяет постоянную форму бактерий, обладает следующими важнейшими иммунобиологическими свойствами.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 5. Химическая структура пептидогликана.

Стрелками указаны участки молекулы, атакуемые лизоцимом, а также муроэндопептидазой и пенициллином. Объяснение в тексте


1. В его составе обнаружены родоспецифические антигенные детерминанты. Они содержатся в гликановом остове и в тетрапептидах. В межпептидных мостиках имеются видоспецифические антигенные детерминанты.

2. Пептидогликан запускает классический и альтернативный пути активации системы комплемента.

3. Он тормозит фагоцитарную активность макрофагов, т. е. защищает бактерии, особенно грамположительные, от фагоцитоза.

4. Угнетает миграцию макрофагов.

5. Способен индуцировать развитие гиперчувствительности замедленного действия.

6. Обладает противоопухолевым действием.

7. Оказывает пирогенное действие на организм человека и животных.

Таким образом, клеточная стенка является чрезвычайно важной биологической структурой бактерий, определяющей многие их специфические свойства. Как отмечалось выше, все бактерии, в зависимости от их отношения к окраске по Граму, делятся на грамположительные и грамотрицательные. Суть окраски по Граму заключается в том, что вначале бактерии окрашивают кристаллическим или генциановым фиолетовым, а затем – раствором Люголя, после чего мазок обрабатывают спиртом и докрашивают водным фуксином. Грамотрицательные бактерии обесцвечиваются спиртом и поэтому окрашиваются в красный цвет, а грамположительные не обесцвечиваются и сохраняют фиолетовую окраску. Это свойство грамположительных бактерий зависит исключительно от особенностей химического состава и структуры их клеточных стенок, так как при разрушении клеточных стенок или утрате их (в случае L-трансформации) они становятся грамотрицательными.

Причину различного отношения бактерий к окраске по Граму объясняют тем, что после обработки раствором Люголя образуется не растворимый в спирте комплекс йода с генциановым фиолетовым, который у грамположительных бактерий в связи со слабой проницаемостью их стенки не может диффундировать из клетки, в то время как у грамотрицательных легко удаляется при промывании их этанолом, а затем водой.

Особенности клеточной стенки грамположительных бактерий

Клеточная стенка грамположительных бактерий имеет однородную структуру, пластичный слой тонкий и ковалентно связан с ригидным слоем. Она значительно толще, чем у грамотрицательных – ее толщина 20 – 60 нм. Основную массу стенки составляет пептидогликан. Он представлен не 1 – 2 слоями, как у грамотрицательных бактерий, а 5 – 6, на его долю приходится до 90 % сухой массы клеточной стенки. Клеточная стенка содержит много тейхоевых кислот (до 50 % сухого веса ее). Тейхоевые кислоты (греч. teichos – стенка) – растворимые в воде линейные полимеры, содержащие остатки глицерина или рибитола, связанные между собой фосфодиэфирными связями. Тейхоевые кислоты – главные поверхностные антигены многих грамположительных бактерий. Они в значительном количестве располагаются между цитоплазматической мембраной и слоем пептидогликана и через поры в нем выступают наружу. Функция тейхоевых кислот полностью не выяснена. Клеточная стенка большинства грамположительных бактерий не содержит липидов, однако у микобактерий и коринебактерий в ней имеются токсические гликолипиды.

Особенность пептидогликанов грамположительных бактерий – частое отсутствие в них диаминопимелиновой кислоты. В клеточной стенке грамположительных бактерий отсутствуют липополисахариды; содержание белка в них сильно варьирует. Белки во многом определяют антигенную специфичность таких бактерий. Например, стрептококки серогруппы А по белкам М и Т подразделяют на несколько десятков серотипов.

Особенности клеточной стенки грамотрицательных бактерий

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий значительно тоньше, и у большинства из них ее толщина составляет 14 – 18 нм. Четко выделяются два слоя – пластичный и ригидный, они связаны лабильно и отделяются друг от друга при обработке додецилсульфатом натрия. Основная особенность клеточной стенки грамотрицательных бактерий: ригидный слой тонкий, представлен одним или, редко, двумя слоями пептидогликана, на долю которого приходится до 5 – 10 % сухого веса стенки. Для пептидогликана характерно низкое содержание поперечных сшивок между пептидными цепочками, однако в нем почти всегда имеется диаминопимелиновая кислота.

В составе клеточной стенки содержится много липопротеинов, фосфолипидов, липополисахарид, больше белка и, как правило, отсутствуют тейхоевые кислоты. Пластичный слой клеточной стенки у грамотрицательных бактерий представляет собой сложную мозаику, образованную из липопротеинов, липополисахаридов и наружной мембраны.

Липопротеины связывают наружную мембрану с пептидогликаном (белок связан с диаминопимелиновой кислотой бокового тетрапептида, а липид – нековалентно с наружной мембраной).

Липополисахарид (ЛПС) состоит из комплекса липида А и связанного с ним полисахарида, состоящего из ядра, которое одинаково у всех грамотрицательных бактерий, и терминальной цепочки из повторяющихся сахаров (рис. 6). Последние у разных видов бактерий различаются по химической природе. Они обычно представлены линейными трисахаридами или разветвляющимися тетра– или пентасахаридами. Терминальные повторяющиеся единицы полисахарида ЛПС располагаются на поверхности клетки в виде микроворсинок и определяют ее антигенную специфичность. ЛПС синтезируется на цитоплазматической мембране, а затем транспортируется в наружную часть клетки, он прикреплен к наружной мембране с помощью гидрофобных связей. ЛПС выполняет две важнейшие функции у грамотрицательных бактерий: во-первых, он определяет их антигенную специфичность, а во-вторых, является одним из главных факторов их патогенности. ЛПС – это эндотоксин. Его токсичность определяется липидом А. Кроме того, ЛПС в организме запускает синтез около 20 различных биологически активных соединений, которые опосредуют патогенез эндотоксикоза, и обладает пирогенным действием.

Наружная мембрана, подобно любой биологической мембране, состоит из двух слоев липидов, но в ней значительная часть фосфолипидов наружного слоя замещена молекулами липополисахаридов и набором белков, локализованных мозаично (рис. 7). В состав этих белков, заключенных в фосфолипидную матрицу, входят 3 или 4 основных (major), которые составляют около 70 % суммарных белков наружной мембраны; липопротеины и второстепенные белки, числом более 10. Два из основных белков проходят через оба слоя мембраны и прочно связаны с пептидогликаном. Эти белки-порины располагаются в виде триплетов и образуют диффузионные поры, через которые в клетку проникают мелкие гидрофильные молекулы. Второстепенные белки выполняют разнообразные специфические функции: одни из них участвуют в облегченной диффузии, другие – в активном транспорте молекул через наружную мембрану и выступают в качестве специфических рецепторов для фагов и колицинов. Некоторые из этих белков участвуют в конъюгации (являются рецепторами для донорных ворсинок), в контроле репликации ДНК и регуляции клеточного деления. Наружная мембрана осуществляет также функцию барьера, через который в клетку не способны проникать крупные молекулы (один из механизмов неспецифической устойчивости грамотрицательных бактерий к антибиотикам). Если бактерии поместить в гипертонический раствор, наступает резкое обезвоживание клеток, цитоплазма съеживается, и протопласт отходит от клеточной стенки. Это явление называется плазмолизом. В результате плазмолиза клетки гибнут. Этим свойством широко пользуются для консервирования пищевых продуктов с помощью концентрированных растворов поваренной соли или сахара. Однако плазмолиз проявляется не в одинаковой степени у разных видов бактерий. К нему особенно устойчивы Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, которые являются частыми виновниками пищевых отравлений. В случае помещения бактерий в дистиллированную воду или гипотонические растворы солей происходит противоположное явление – плазмоптиз: вода устремляется в клетки, происходит их набухание и разрушение.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 6. Структура липополисахарида грамотрицательных бактерий:

1 – повторяющиеся единицы; 2 – ядро; 3 – полимер дисахарид-фосфата; 4 – жирные кислоты; 5 – липид


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 7. Схематическое изображение структур наружной мембраны (1), пептидогликана (2) и плазматической мембраны (3) E. coli


При обработке грамположительных бактерий ферментами, разрушающими пептидогликан, возникают протопласты, т. е. структуры, полностью лишенные клеточной стенки. Обработка грамотрицательных бактерий лизоцимом разрушает только слой пептидогликана клеточной стенки, но наружная мембрана (или, по крайней мере, часть ее) сохраняется. Такие структуры получили название сферопластов. Протопласты и сферопласты имеют сферическую форму и в соответствующих осмотических условиях сохраняют жизнеспособность. Особенно чувствительны к изменению осмотического давления протопласты. При определенных условиях они способны к размножению подобно L-формам бактерий. Нарушение синтеза клеточной стенки лежит в основе L-трансформации бактерий.

L-трансформация бактерий

Впервые эта форма изменчивости бактерий была описана в 1935 г. Е. Клинебергер. Она обнаружила и выделила из культуры Streptobacillus moniliformis необычные варианты, которые росли в виде маленьких характерных колоний с врастающей в агар центральной и фестончатой полупрозрачной периферической зонами. В этих колониях обнаруживались самые разнообразные по морфологии структуры: нитевидные, волокнистые, колбасовидные, шаровидные образования и мелкие гранулы размером 0,1 – 0,15 мкм (фильтрующиеся формы бактерий). Поскольку этот феномен был обнаружен в институте имени Листера, то таким необычным вариантам бактерий дали название L-форм, а такую изменчивость бактерий назвали L-трансформацией. Она может быть обратимой и необратимой. В случае если генетический контроль синтеза клеточной стенки сохраняется, L-формы при благоприятных условиях могут возвращаться в исходную бактериальную форму с восстановлением всех основных биологических свойств, включая патогенность. Если же генетический контроль синтеза клеточной стенки нарушен необратимо, L-трансформация приобретает необратимый характер, а такие L-трансформанты по своим морфологическим, культуральным и иным свойствам становятся неотличимыми от микоплазм. L-трансформации могут подвергаться, по-видимому, все бактерии, имеющие клеточную стенку, а все образующиеся L-формы, независимо от вида бактерий, из которого они возникли, обладают следующими общими для них особенностями:

1. Сходство морфологических изменений: образование нитевидных, волокнистых, колбасовидных, шаровидных и гранулярных форм.

2. Сходные культуральные свойства: анаэробные или микроаэрофильные условия роста, потребность в холестерине и сывороточном белке, рост на плотных средах в виде характерных колоний двух типов – А и В (рис. 8). Колонии типа А растут на поверхности агара, имеют очень мелкие размеры. Они состоят главным образом из гранулярных структур, лишенных клеточной стенки, и очень похожи на микоплазмы. Колонии типа В состоят из центральной зоны, врастающей в агар, и прозрачной фестончатой периферической зоны. Они похожи по внешнему виду на колонии типа «глазуньи», образуемые микоплазмами, но более крупные и грубые. В этих колониях обнаруживаются крупные тела, содержащие компоненты клеточной стенки, сходные со стенкой родительских бактерий, но лишенные ригидности. Многие бактерии образуют колонии А и В типов, однако грамположительные бактерии (Streptococcus, Staphylococcus) чаще образуют колонии только типа А. L-формы бактерий из колоний типа В легко ревертируют в исходные формы. Колонии типа А более стабильны и ревертируют в исходные формы значительно реже.

3. Постепенное (по мере нарушения синтеза клеточной стенки) превращение из грамположительных в грамотрицательные структуры.

4. Образование стабильных и нестабильных L-форм (в зависимости от степени полноты утраты способности синтезировать клеточную стенку).

5. Изменение антигенных свойств (утрата К– и О-антигенов как следствие нарушения синтеза клеточной стенки).


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 8. L-формы бактерий:

1 – колонии L-форм типа 3А и 3В; 2 – пузыревидные, грушевидные и субмикроскопические элементы L-форм дифтерийной палочки


6. Снижение вирулентности по сравнению с исходными родительскими формами в связи с утратой различных факторов патогенности (адгезии, инвазии, эндотоксина и т. п.).

7. Способность длительно персистировать (переживать) в организме. Утрата клеточной стенки делает L-формы нечувствительными к различным химиопрепаратам и антителам.

8. Способность при неполной утрате синтеза клеточной стенки возвращаться в исходную бактериальную форму.

L-трансформация происходит как in vitro, так и in vivo (в организме человека и животных). Факторами, индуцирующими ее, являются различные антибиотики, угнетающие биосинтез клеточной стенки (пенициллин, цефалоспорины, циклосерин, ванкомицин и т. п.); ферменты (лизоцим, амидаза, эндопептидаза); антимикробные антитела; высокие концентрации некоторых аминокислот, особенно глицина и фенилаланина.

Исключительное значение L-трансформации патогенных бактерий заключается в том, что она является частой причиной перехода острых форм заболеваний в хронические и их обострений. L-трансформацию надо рассматривать не просто как одно из проявлений изменчивости бактерий, а как своеобразную, присущую всем бактериям форму приспособления к неблагоприятным условиям существования (подобно спорообразованию), которая способствует сохранению вида бактерий в природе. Клеточная стенка и ее синтез чувствительны к действию антител и различных химиопрепаратов. Освобождение от нее не лишает бактерии жизнеспособности, но позволяет переживать действие этих неблагоприятных для них факторов, а по их устранении – возвращаться в свое исходное состояние.

Принимая во внимание особую роль клеточной стенки в жизни бактерий, ей можно дать такое определение. Клеточная стенка – сложный структурный элемент, встречающийся только у эубактерий (кроме микоплазм) и характеризующийся наличием в его составе уникального химического соединения – пептидогликана, наделяющего клетку важными иммунобиологическими свойствами и определяющего ее постоянную форму; нарушение его синтеза приводит к превращению бактерий в L-формы, с помощью которых и обеспечивается, главным образом, длительное персистирование возбудителя в организме – одна из основных причин перехода заболевания из острой в хроническую форму. Соответственно L-трансформация, как и спорообразование, является важнейшей формой приспособления бактерий к неблагоприятным условиям существования.

Цитоплазматическая мембрана бактерий

Цитоплазматическая мембрана (ЦМ) является исключительно полифункциональной структурой.

1. ЦМ воспринимает всю химическую информацию, поступающую в клетку из внешней среды.

2. Она является основным осмотическим барьером, благодаря которому внутри клетки поддерживается определенное осмотическое давление.

3. ЦМ совместно с клеточной стенкой участвует в регуляции роста и клеточного деления бактерий.

4. ЦМ участвует в регуляции процессов репликации и сегрегации хромосом и плазмид (они связаны с ее рецепторами).

5. В ЦМ содержится значительное количество ферментов, в том числе системы переноса электронов (ЦМ – место генерации энергии у бактерий).

6. С ЦМ связаны жгутики и аппарат регуляции их движения.

7. ЦМ участвует в процессах транспорта (в том числе активного) питательных веществ в клетку и продуктов жизнедеятельности, включая ферменты и экзотоксины, из клетки в окружающую среду. В ней содержатся белки, участвующие в облегченной диффузии и активном транспорте.

8. ЦМ участвует в синтезе компонентов клеточной стенки и образовании мезосом (мезосомы возникают в результате инвагинации участка ЦМ в цитоплазму, они открыты в периплазматическое пространство).

9. ЦМ играет важную роль в компартментализации (англ. compartment – отсек, отделение), т. е. в разделении на «отсеки» рибосом и их стабилизации.

Каким образом мембрана осуществляет на молекулярном уровне свои многочисленные функции – один из актуальнейших вопросов современной биологии. На долю ЦМ приходится около 10 % сухого веса бактерий. Она содержит 25 – 40 % фосфолипидов, образующих два слоя, 20 – 75 % белков и до 6 % углеводов. Молекулы фосфолипидов асимметричны: головки, несущие электрический заряд, гидрофильны; хвостики – нейтральны и гидрофобны. Фосфолипиды упакованы в мембране следующим образом: их полярные гидрофильные головки обращены наружу и образуют два слоя ЦМ – внутренний и внешний, а неполярные гидрофобные хвостики скрыты в толще мембраны. На электронограммах ЦМ имеет вид трехслойной структуры, состоящей из двух параллельных темных слоев и разделяющего их светлого слоя. Этот слой более проницаем для электронов, чем слои, состоящие из полярных концов фосфолипидов, ассоциированных с белками. Специфичность функций ЦМ во многом зависит от набора содержащихся в них белков. Расположение их в ЦМ своеобразно (рис. 9): некоторые белки пронизывают весь двойной липидный слой, определенная часть белков связана или только с внутренней, или только с наружной поверхностью мембраны. Это вытекает из того, что взаимодействие между мембраной и цитоплазмой, с одной стороны, мембраной и внешней средой – с другой, определяет различные, хотя и взаимосвязанные, процессы ее жизнеобеспечения: облегченная диффузия, активный транспорт, перенос электронов, мобилизация энергии и т. п. Молекулы белков и других соединений, входящих в состав ЦМ, обладают значительной свободой перемещения.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 9. Схематическая модель элементарной биологической мембраны


Структура, состоящая из клеточной стенки и ЦМ, получила название оболочки клетки.

Цитоплазма

Цитоплазма бактерий представляет собой сложную коллоидную систему, в ней нет эндоплазматического ретикулума и других цитоплазматических органелл, свойственных эукариотам; она неподвижна. Правда, в цитоплазме Mycobacterium, Streptococcus, Clostridium, Proteus обнаружены микротрубочки – рапидосомы, сходные с микротрубочками простейших. У некоторых прокариот имеются три типа органелл, окруженных белковыми мембранами: газовые пузырьки (у водных прокариот, например, пурпурных и серных бактерий, галобактерий и др.), хлоробиум-везикулы (в них у фотосинтезирующих бактерий размещается аппарат фотосинтеза) и карбоксисомы (в них содержится большая часть основного фермента процесса фиксации CO2 – карбоксидисмутазы). В цитоплазме располагается ядерный аппарат – генофор (нуклеоплазма), который не отделен от нее никакими мембранами. Кроме хромосомы (хромосом), в цитоплазме многих бактерий, в том числе патогенных, имеются плазмиды, иногда целый их комплекс. Как хромосома, так и плазмиды связаны со специфическими рецепторами на ЦМ. В цитоплазме располагаются бактериальные рибосомы 70S и все остальные компоненты белоксинтезирующей системы. Помимо этих основных структурных элементов, являющихся главными атрибутами живой клетки, в цитоплазме содержатся различные макромолекулы (тРНК, аминокислоты, нуклеотиды и т. п.); могут быть мезосомы, которые участвуют в энергетическом обмене, формировании межклеточной перегородки при делении, спорообразовании и, возможно, обладают другими функциями. Нередко в цитоплазме бактерий обнаруживаются различные включения, которые образуются в процессе жизнедеятельности: капельки нейтральных липидов; воска, серы, гранулезы (специфическое запасное углеводное вещество, накапливающееся у бактерий рода Clostridium); гранулы гликогена; волютина (метаполифосфата), особенно у Spirillum volutans и Corynebacterium diphtheriae – возбудителя дифтерии; поли-β-гидроксимасляной кислоты – ПОМ (особенно у рода Bacillus). Гранулеза, гликоген, ПОМ, зерна волютина служат для бактерий запасным источником энергии. У некоторых бактерий (Bacillus thuringiensis) в цитоплазме находятся кристаллы белковой природы, обладающие ядовитым действием для насекомых. У разных биологических групп бактерий могут быть и другие внутрицитоплазматические включения метаболического происхождения.

Периплазматическое пространство

Между ЦМ и внутренним слоем пептидогликана находится периплазматическое пространство, ширина его у грамположительных бактерий составляет около 10 нм. При электронной микроскопии обнаружено, что у грамположительных и, вероятно, у грамотрицательных бактерий между внутренней поверхностью пептидогликана и наружной поверхностью ЦМ имеются регулярно повторяющиеся перемычки. Поры, содержащиеся в клеточной стенке, открываются в периплазматическое пространство. В него всегда открыты и мезосомы. Периплазматическое пространство играет существенную роль во взаимодействии ЦМ и клеточной стенки, в нем содержатся различные ферменты, по преимуществу фосфатазы, связывающие белки, олигосахариды и другие вещества.

Капсулы

У бактерий различают микрокапсулу, капсулу и слизистый слой. Микрокапсула выявляется при электронной микроскопии в виде коротких мукополисахаридных фибрилл. Ее роль и значение не совсем ясны. Капсула представляет собой слизистый слой, который обычно сохраняет связь с клеточной стенкой. Капсула служит внешним покровом бактерий, толщина ее более 0,2 мкм, она четко обнаруживается под микроскопом после негативного окрашивания, например по способу Бурри – Гинса (см. цв. вкл., рис. 10). Капсулы, в связи с их гелеобразной консистенцией, плохо удерживают красители, поэтому для их обнаружения наиболее приемлем метод негативного контрастирования. Макромолекулы капсулы сильно гидратированы, расположены рыхло и не препятствуют поступлению веществ в клетку и выходу продуктов ее метаболизма наружу. В образовании капсулы принимает участие ЦМ. По химическому составу различают капсулы, состоящие из полисахаридов, не содержащих азота; полисахаридов, содержащих азот (аминосахара); капсулы полипептидной природы (табл. 3). Капсулу полипептидной природы образуют несколько видов Bacillus, она у них состоит из D-глутаминовой кислоты, и Y. pestis.


Таблица 3

Химический состав капсул некоторых бактерий

Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Некоторые виды патогенных бактерий (S. pneumoniae, B. anthracis, C. perfringens и др.) образуют капсулы лишь в организме человека или животного, другие – как в организме, так и на искусственных питательных (иногда специальных) средах (S. aureus, S. pyogenes, Klebsiella pneumoniae, K. rhinoscleromatis и др.). У патогенных бактерий капсула может окружать одну (Y. pestis), две (S. pneumoniae) или целую цепочку (B. anthracis, K. pneumoniae) клеток. Некоторые сапрофитные бактерии (Leuconostoc mesenteroides, Zoogloea) образуют зооглеи – скопления клеток, заключенные в одну общую капсулу. Хотя капсулы не являются для бактерий жизненно необходимыми, они наделяют их многими важными свойствами. Совместно с клеточной стенкой и ЦМ они образуют более мощную оболочку бактерий, предохраняют их от высыхания, несут для них запасные питательные вещества. Капсульные антигены патогенных бактерий определяют их антигенную специфичность и иммуногенные свойства. Например, наиболее эффективные вакцины против менингококковых и пневмококковых заболеваний готовят из капсульных полисахаридов возбудителей. У многих бактерий капсулы являются важными факторами патогенности: они либо маскируют их от фагоцитов, либо подавляют фагоцитоз. Утрата способности синтезировать капсулу у пневмококков, например, сопровождается полной утратой патогенности.

Слизистые слои. Нередко слизистые экзополимеры выделяются бактериальной клеткой в значительно большем количестве, частично отделяются от нее и образуют рыхлый слизистый слой.

Жгутики

По механизму движения бактерии подразделяют на плавающие и скользящие, или ползающие. Последние активно передвигаются по плотной поверхности благодаря волнообразным сокращениям тела (некоторые виды Mycoplasma, Myxococcus и др.). У плавающих бактерий органом движения являются жгутики, которые представляют собой тонкие длинные нитевидные белковые образования диаметром 12 – 30 нм и длиной от 6 – 9 до 80 мкм. Белок, из которого построены жгутики, получил название флагеллина. Он отличается от других белков, содержащихся в бактериальной клетке. Флагеллин обладает сократительной способностью, хотя механизм ее не совсем понятен.

Жгутик состоит из однотипных спиралевидно или продольно уложенных вокруг полой сердцевины белковых субъединиц, образующих цилиндрическую структуру, которая особым образом прикреплена к бактериальной клетке. По характеру расположения жгутиков и их количеству подвижные бактерии условно делят на четыре группы (рис. 11):

1) монотрихи – один полярно расположенный жгутик (Vibrio cholerae);

2) лофотрихи – пучок жгутиков на одном конце (Pseudomonas methanica);

3) амфитрихи – пучки жгутиков на обоих концах клетки (Spirillum volutans);

4) перитрихи – множество жгутиков, расположенных вокруг клетки (E. coli, Salmonella typhi).

Жгутик состоит из трех компонентов – спиральной жгутиковой нити постоянной толщины, крючка и базального тельца (рис. 12). Крючок, к которому присоединена жгутиковая нить, имеет длину 30 – 45 нм и состоит из отличающегося от флагеллина белка. Он соединен с базальным тельцем, которое располагается целиком в оболочке (в клеточной стенке и ЦМ).


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 11. Расположение жгутиков у бактерий:

1 – монотрихи; 2 – лофотрихи; 3, 4 – амфитрихи; 5 – перитрихи


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 12. Схематическая модель бактериального жгутика


Базальное тельце состоит из центрального стержня, заключенного в систему особых колец. У грамотрицательных бактерий их две пары: внешняя (кольца L и P) и внутренняя (кольца S и М). Кольца L и P расположены внутри клеточной стенки (кольцо L – в ЛПС, а кольцо P – в слое пептидогликана). Они выполняют, очевидно, роль втулки для стержня. Внутренняя пара (кольца S и M) фиксирована на ЦМ, причем кольцо S располагается в периплазматическом пространстве, а кольцо М – на ЦМ или в ней.

Жгутики у грамположительных бактерий, имеющих более толстую и гомогенную клеточную стенку, содержат только одну пару колец – S и M. Вращение жгутиков в клеточной стенке происходит из-за вращательного движения колец S и M относительно друг друга и обеспечивается за счет энергии трансмембранного градиента ионов водорода или натрия. Благодаря такому вращению происходит движение бактерий в наиболее благоприятном для них направлении. Жгутиковый аппарат обладает особым бинарным переключателем, который позволяет менять направление вращения жгутиков против часовой стрелки на противоположное. Таким способом бактерии, получив химический сигнал из окружающей среды, изменяют направление движения и выбирают оптимальные условия обитания. По всей вероятности, базальное тельце (его внутреннее кольцо М) непосредственно связано с какими-то дополнительными жгутиковыми белками, которые необходимы для сборки жгутиков и управления переключением направления их вращения и которые расположены либо в ЦМ, либо сразу под ней. Со жгутиковым аппаратом связана также и хемотаксическая активность таких бактерий. Генетический контроль синтеза жгутиковых белков, их сборки и активности осуществляется особым опероном. Установлено, что мутации в области mot-генов (англ. motility – подвижность) приводят к потере только подвижности, однако все структуры жгутиков сохраняются; мутации в cheгенах (англ. chemotaxis – хемо + подвижность) – к потере хемотаксической активности при сохранении структуры жгутиков и их подвижности. Подвижность бактерий определяют либо микроскопически (с помощью фазово-контрастной или обычной световой микроскопии «раздавленной» или «висячей» капли соответственно), либо бактериологически (при посеве уколом в столбик полужидкого агара: подвижные бактерии дают диффузный рост, а неподвижные – растут только по ходу укола). Жгутики хорошо выявляются при электронной микроскопии (рис. 13). Жгутиковые бактерии могут двигаться с большой скоростью, например Bacillus megaterium движется со скоростью 27 мкм/с, а Vibrio cholerae – 200 мкм/с.

Донорные ворсинки. У бактерий, являющихся носителями конъюгативных плазмид (F-плазмид, R-плазмид и др.), имеются длинные (0,5 – 10 мкм) нитевидные структуры белковой природы, получившие название донорных ворсинок, или донорных пилей (англ. pile – волосок). Как и жгутики, они имеют внутреннюю полость и построены из особого белка. Их синтез находится под контролем плазмидных генов. Они служат аппаратом конъюгации – с их помощью устанавливается непосредственный контакт между донорной и реципиентной клетками. Донорные пили обнаруживают с помощью донорспецифических фагов, которые на них адсорбируются и далее вызывают лизис клетки-хозяина. Донорные пили встречаются в количестве 1 – 2 на клетку.

Фимбрии, или реснички. Фимбрии (англ. fimbria – бахрома) – короткие нити, в большом количестве (до многих тысяч) окружающие бактериальную клетку (рис. 14). Подобно жгутикам и донорным ворсинкам, они прикреплены к клеточной стенке, но значительно короче и тоньше – их длина 0,1 – 12,0 мкм, диаметр 25 нм. Белок фимбрий отличается от белков жгутиков и донорных ворсинок. Биологическое значение фимбрий, по-видимому, состоит в том, что с их помощью бактерии прикрепляются к определенным поверхностям. Для многих патогенных бактерий фимбрии являются важными факторами патогенности, так как с их помощью бактерии прикрепляются к чувствительным клеткам и заселяют их, т. е. фимбрии служат для бактерий факторами адгезии и колонизации.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 13. Жгутики бактерий (электронограмма Proteus vulgaris)


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 14. Реснички (фимбрии) бактерий (электронограмма Bordetella parapertussis)


Эндоспоры и спорообразование

Некоторые роды бактерий (Bacillus, Clostridium, Sporosarcina) при неблагоприятных для их существования условиях образуют защитные формы – эндоспоры. Споры представляют собой своеобразные покоящиеся клетки; у них чрезвычайно низкая метаболическая активность, но они обладают высокой устойчивостью к высушиванию, действию повышенной температуры и различных химических веществ. Высокую резистентность спор к действию указанных факторов связывают с присутствием в оболочке большого количества кальциевой соли дипиколиновой кислоты. Споры сильно преломляют свет, поэтому они хорошо заметны в неокрашенных препаратах. Для обнаружения спор предложены различные интенсивные способы окрашивания, поскольку они слабо воспринимают красители. Диаметр споры может не превышать диаметра вегетативной клетки (Bacillus) или превышает его. В последнем случае бактериальная клетка со спорой принимает форму веретена (Clostridium). Споры в клетке (рис. 15) могут располагаться центрально (B. megaterium), субтерминально (С. botulinum), терминально (C. tetani).

В процессе спорообразования (споруляции) бактериальная клетка подвергается сложной перестройке (рис. 16). Вначале на одном из ее полюсов происходит конденсация нуклеоида и отделение его за счет образования септы. Затем ЦМ начинает обрастать образовавшийся протопласт споры и возникает складка, состоящая из двух слоев ЦМ, позднее они сливаются, в результате образовавшаяся предспора оказывается окруженной двойной оболочкой. На следующей стадии между двумя мембранами, покрывающими предспору, формируется толстый слой кортекса (коры). Самый внутренний слой его представляет собой зародышевую стенку (из него образуется клеточная стенка прорастающей вегетативной клетки). По мере созревания споры обе ее мембраны участвуют в образовании специальных слоев споры. Таким образом между обращенными друг к другу мембранами образуются зародышевая стенка, кортекс, а также расположенные снаружи от мембран наружная и внутренняя оболочки и экзоспорий. Сформировавшаяся эндоспора состоит из протопласта с нуклеоидом, стенки споры, кортекса, оболочки и экзоспория.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 15. Расположение спор у бактерий:

1 – центральное (Bacillus megaterium); 2 – субтерминальное (Clostridium botulinum); 3 – терминальное (Clostridium tetani)


Протопласт споры (ядро) содержит ЦМ, цитоплазму, хромосому, все компоненты белоксинтезирующей системы и анаэробной энергообразующей системы.

Стенка споры непосредственно окружает внутреннюю мембрану ее и представлена пептидогликаном, из которого формируется клеточная стенка прорастающей клетки.

Кортекс – самый толстый слой оболочки споры. Он состоит из пептидогликана, содержащего мало поперечных сшивок и поэтому очень чувствительного к лизоциму. Разрушение кортекса лизоцимом играет пусковую роль в процессе прорастания споры.

Оболочка споры построена из кератиноподобного белка. Плохая проницаемость ее определяет высокую устойчивость спор к действию различных химических веществ.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 16. Схема образования споры (по Г. Шлегелю):

А, Б – образование септы; В, Г – окружение протопласта споры мембраной материнской клетки; Д – формирование кортекса и оболочек споры; Е – схема строения зрелой споры: 1 – экзоспориум; 2 – наружная оболочка споры; 3 – внутренняя оболочка споры; 4 – кортекс; 5 – клеточная стенка споры; 6 – ЦМ споры; 7 – цитоплазма с нуклеоидом


Экзоспорий – липопротеиновая оболочка, содержащая немного углеводов.

После завершения спорообразования вегетативная часть клетки отмирает, спора высвобождается и длительное время сохраняется в окружающей среде, до тех пор, пока не возникнут условия, благоприятные для ее прорастания.

Генетический контроль спорообразования

Процесс спорообразования контролируется более чем 40 оперонами, которые представляют собой как бы дополнительный геном у спорообразующих бактерий. В составе этого генома насчитывается более 60 генов. Инициация споруляции связана с геном spoO, мутации в котором делают невозможным образование споры с самых начальных стадий. Транскрипция гена spoO запускает последовательную транскрипцию всех оперонов спорового генома. При этом их транскрипция носит строго регулируемый характер: выражение более поздних генов зависит от транскрипции более ранних генов. Это обусловливает четкую временнwую последовательность биохимических и морфологических процессов, лежащих в основе споруляции. Спорообразующие бактерии обладают механизмами, с помощью которых они распознают определенные изменения в окружающей среде, например, уменьшение содержания источников энергии, некоторых аминокислот и оснований. В ответ на это в клетке происходят метаболические изменения, которые и запускают споруляцию. Эти изменения приводят прежде всего к изменению субъединичного состава РНКполимераз. Индукция транскрипции спорового генома приводит к синтезу особых δ-единиц РНК-полимераз, которые и обеспечивают распознавание промоторов генов, контролирующих споруляцию. Вместе с тем наличие множественных промоторов у жизненно важных для клетки генов, распознаваемых разными δ-факторами, обеспечивает их выражение на всех этапах роста этих клеток, споруляции и прорастания спор. Одна из особенностей споруляции состоит в том, что на определенном ее этапе (приблизительно на 3-м часу) происходит синтез небольших кислоторастворимых белков. На их долю приходится около 10 – 12 % всех белков споры. В спорах они связываются с ДНК, обеспечивая устойчивость их к УФ-облучению. В момент прорастания споры эти белки гидролизуются и тем самым обеспечивают прорастающую спору необходимыми аминокислотами. У некоторых представителей рода Clostridium выявлена функциональная зависимость токсинообразования от споруляции: наиболее интенсивно экзотоксин вырабатывается во время активной споруляции; причинная связь этих процессов не ясна.

Прорастание споры происходит после получения соответствующего химического сигнала. Различные виды спорообразующих бактерий располагают рецепторами, распознающими наличие в среде источников энергии, L-аланина, аденозина и других веществ. Связывание с такими эффекторами активирует содержащийся в споре автолизин (лизоцим), который быстро разрушает пептидогликан кортекса.

Прорастание спор включает три стадии: активацию, начальную стадию и стадию роста.

Активация является обязательным условием прорастания спор. Она осуществляется различными воздействиями – кислой рН; веществами, содержащими свободные сульфгидрильные группы; повышением температуры; механическим повреждением спор.

Начальная стадия. Под влиянием внешних эффекторов происходит активация автолизина, последний разрушает пептидогликан кортекса, в спору поступает вода, спора высвобождается от дипиколината кальция, под воздействием гидролитических ферментов разрушаются другие ее компоненты.

Стадия роста. После разрушения кортекса и наружных слоев споры из нее появляется («выклевывается») растущая новая вегетативная клетка. Она состоит из протопласта споры и ее клеточной стенки. В ней активизируются биосинтетические процессы; в результате новая вегетативная клетка, при наличии необходимых питательных веществ, удваивает свою биомассу и делится на две дочерние клетки, которые далее активно размножаются, пока этому способствуют условия среды. Процесс прорастания споры контролируется генами как спорового, так и вегетативного геномов.

Некультивируемые формы бактерий

У многих видов грамотрицательных бактерий, в том числе у патогенных (шигеллы, сальмонеллы, холерный вибрион и др.) существует особое приспособительное, генетически регулируемое состояние, физиологически эквивалентное цистам, в которое они могут переходить под влиянием неблагоприятных условий и сохранять жизнеспособность до нескольких лет. Главная особенность этого состояния заключается в том, что такие бактерии не размножаются и поэтому не образуют колоний на плотной питательной среде. Такие не размножающиеся, но жизнеспособные клетки получили название некультивируемых форм бактерий (НФБ). Клетки НФБ, находящиеся в некультивируемом состоянии (НС), обладают активными метаболическими системами, в том числе системами переноса электронов, биосинтеза белка и нуклеиновых кислот, и сохраняют вирулентность. Их клеточная мембрана более вязкая, клетки обычно приобретают форму кокков, имеют значительно уменьшенные размеры. НФБ обладают более высокой устойчивостью во внешней среде и поэтому могут переживать в ней длительное время (например, холерный вибрион в грязном водоеме), поддерживая эндемическое состояние данного региона (водоема). Для обнаружения НФБ используют молекулярно-генетические методы (ДНК – ДНК-гибридизация, ЦПР), а также более простой метод прямого подсчета жизнеспособных клеток. С этой целью к исследуемому материалу добавляют в небольшом количестве питательные вещества (дрожжевой экстракт) и налидиксовую кислоту (для подавления синтеза ДНК) на несколько часов. Клетки усваивают питательные вещества и увеличиваются в размерах, но не делятся, поэтому такие увеличенные клетки четко видны в микроскоп и их легко подсчитать. Для этих целей можно использовать также методы цитохимические (образование формазана) или микроауторадиографии. Генетические механизмы, обусловливающие переход бактерий в НС и их реверсию из него, не ясны.

Глава 5 Физиология бактерий. Механизмы питания

Жизнь любого организма сводится к тому, чтобы в соответствии с имеющимся у него объемом генома полностью воспроизвести самого себя и реализовать свои функции, т. е. обусловить индивидуальное развитие (жизнь) и произвести потомство. Это оказывается возможным потому, что в основе жизни каждого организма лежит непрерывное взаимодействие трех потоков информации: одного – из внешней среды и еще двух потоков генетической информации: по горизонтали, он обеспечивает индивидуальное развитие организма и реализацию его жизненных функций, и другого – по вертикали, который обеспечивает передачу потомству всех признаков родителей, т. е. наследственную непрерывность вида и самой жизни. Из этого вытекает следующее положение, которое, по-видимому, имеет общебиологическую закономерность – поведение всех живых существ, как в интересах их индивидуального развития, так и ради сохранения вида, должно быть всегда адекватным имеющейся у них генетической информации и информации, воспринимаемой из внешней среды. Отступление от этого закона может привести к гибели организма и вида. Единство организма с внешней средой заключается не только в том, что он получает из среды необходимые для себя источники энергии, питания, а также другую информацию, но и в том, что, в свою очередь, он также воздействует на среду, изменяет ее и этим постоянно меняет условия своего существования. Поэтому взаимосвязь организма с внешней средой должна быть постоянной и взаимовыгодной.

Чем больше объем генома, тем сложнее устроен организм, тем разнообразнее его собственная генетическая информация и та информация, которую он может воспринимать из окружающей среды и перерабатывать. Тем разнообразнее, сложнее и богаче проявляется его индивидуальная жизнь.

Бактерии воспринимают информацию из внешней среды в виде механических, физических и, главным образом, химических сигналов, поступающих через клеточную мембрану. Химическими сигналами для бактерий служат различные источники энергии, аминокислоты, основания, другие сложные химические вещества, ионы, вода, от которых зависит общая интенсивность всех биосинтетических процессов в клетке.

Механизмы питания бактерий

Большинство бактерий живет в среде, мало подходящей для того, чтобы поддерживать строгое соотношение воды, солей и органических веществ, без которого невозможна жизнь. Это обусловливает необходимость постоянного и тщательного регулирования обмена различными веществами, который происходит между клеткой и внешней средой и контролируется клеточной мембраной. Она проницаема для многих веществ, поток их идет в обоих направлениях (из клетки и в клетку), но структура мембраны такова, что она обладает избирательной и неравномерной проницаемостью, определяющей механизмы питания бактерий.

Питательные вещества из внешней среды поступают в бактериальную клетку с помощью трех основных механизмов: пассивной диффузии, облегченной диффузии и активного транспорта (рис. 17).

Пассивная диффузия осуществляется за счет различного содержания питательных веществ в среде и в клетке и происходит в направлении от большей концентрации к меньшей, т. е. по градиенту концентрации. Когда концентрация вещества по ту и другую сторону мембраны уравнивается, пассивная диффузия прекращается. Ее скорость зависит от величины градиента, но она имеет определенный предел. Таким путем в клетку проникает (и покидает ее) вода вместе с растворенными в ней различными мелкими молекулами, способными проходить через мелкие поры мембраны. Для пассивной диффузии характерно отсутствие субстратной специфичности, и она не требует затраты энергии.

Облегченная диффузия характеризуется выраженной субстратной специфичностью и протекает при обязательном участии специфических белков, локализованных в мембране; синтез некоторых из них индуцируется соответствующими субстратами. Эти белки, получившие название пермеаз (англ. permeate – проникать, проходить сквозь), обладают субстратной специфичностью. Они распознают и связывают молекулу субстрата на внешней стороне мембраны и обеспечивают каким-то образом ее перенос через мембрану. На внутренней поверхности мембраны комплекс пермеаза – субстрат диссоциирует, освободившаяся молекула субстрата включается в общий метаболизм клетки, а пермеаза повторяет очередной цикл переноса своего субстрата, который не способен проникать через мембрану путем простой диффузии. Главное свойство пермеаз – способность проходить через мембрану как с присоединенной молекулой субстрата, так и без нее. Однако облегченная диффузия происходит только по градиенту концентрации, но не против него, поэтому она не требует затраты энергии. Пермеазы, присоединившись к субстрату, повышают его способность проникать через мембрану. Облегченная диффузия протекает со значительно более высокой скоростью, чем пассивная. Ее скорость подчиняется закону Михаэлиса – Ментен, и при достижении равновесия концентрация субстрата, доставляемого посредством облегченной диффузии, на внутренней и внешней поверхностях мембраны становится одинаковой.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 17. Бактериальные транспортные системы (Р. Стейнер [и др.]. Мир микробов. 1979, т. 2):

Разная длина стрелок указывает на сдвиг равновесия реакции в сторону более длинной стрелки. S и s означают соответственно высокую и низкую концентрации растворенных веществ; © – белок-переносчик (пермеаза); R – белок HРr; R-ф – фосфо-HРr; ф – фосфатная группа


Активный транспорт. С помощью механизмов активного транспорта растворенные вещества могут поступать в клетку против градиента концентрации, поэтому активный транспорт требует от клетки затраты энергии. У бактерий этот механизм питания является преобладающим. С его помощью они обеспечивают такие концентрации растворенных питательных веществ внутри клетки, которые могут во много раз превышать их концентрации во внешней среде и обеспечивают им высокие скорости метаболизма даже при низкой концентрации химических веществ в окружающей среде. У многих бактерий, в особенности грамотрицательных, в активном транспорте принимают участие особые связывающие белки, не идентичные пермеазам и не входящие в структуру мембраны, а локализованные в периплазматическом пространстве. У связывающих белков отсутствует каталитическая активность, но они обладают очень высоким сродством к определенным питательным веществам – к различным аминокислотам, сахарам, неорганическим ионам. Выделено и изучено более 100 различных связывающих белков, которые образуют прочные комплексы со своими субстратами и необходимы для их активного переноса через мембрану. Связывающие белки функционируют только в комплексе со специфическими пермеазами, осуществляющими активный перенос субстрата через мембрану. Метаболическая энергия, необходимая для этого, используется для снижения сродства пермеазы к своему субстрату на внутренней поверхности мембраны по сравнению с ее сродством к нему на внешней стороне мембраны. В результате этих превращений происходит изменение скорости выхода субстрата наружу, она становится во много раз меньше скорости его поступления в клетку. При этом механизме активного транспорта через мембрану в клетку поступают против градиента концентрации химически не измененные питательные вещества. У бактерий, вместе с тем, существуют и такие транспортные системы, которые переводят питательные вещества в химически измененную форму, не способную проникать через мембрану. К их числу относится фосфотрансферазная система, широко распространенная среди бактерий. С помощью этой системы транспортируются многие сахара и их производные, в процессе переноса они фосфорилируются и поступают в клетку в виде сахарофосфатов. Поскольку мембрана для последних непроницаема, сахарофосфаты остаются внутри клетки.

Фосфотрансферазная система состоит из двух неспецифических компонентов: ферментов I и HPr и набора субстрат-специфических белков, связанных с мембраной и обозначенных как ферменты II. Фермент I обеспечивает перенос богатой энергией фосфатной группы от фосфоенолпирувата на гистидиновый остаток фермента HPr, который превращается в фосфо-HPr. Последний является общим донором фосфорильной группы для всех субстратов, переносимых фосфотрансферазной системой. Фосфорилирование же их осуществляется субстрат-специфическими белками из группы ферментов II, которые выполняют также и функции пермеаз. У мутантных бактерий, лишенных фермента I или белка HPr, ферменты II осуществляют облегченную диффузию своих субстратов.

Транспортные системы в жизни клетки выполняют две основные функции:

1) поддерживают на высоком уровне внутриклеточные концентрации всех субстратов, необходимых для осуществления важнейших биохимических реакций с максимальными скоростями даже при низких концентрациях этих химических веществ во внешней среде;

2) регулируют внутриклеточное осмотическое давление, поддерживают оптимальную для метаболической активности концентрацию растворенных веществ (небольших молекул и ионов).

Секреция продуктов жизнедеятельности бактериальной клеткой

Бактерии синтезируют и секретируют во внешнюю среду различные продукты своей жизнедеятельности, в том числе белки, главным образом ферменты и токсины, с помощью которых они оптимизируют свое существование. Например, благодаря секреции ферментов они расщепляют сложные органические соединения и делают их более доступными для питания. Для патогенных бактерий секреция ферментов и токсинов служит мощным средством, благодаря которому они только и могут обеспечивать свое существование и размножение в организме животного и подавлять его защитные механизмы. Секреция белков бактериями осуществляется с помощью различных систем и механизмов. При этом следует различать секрецию белков в периплазматическое пространство через ЦМ и секрецию белков непосредственно в культуральную среду (экскрецию, или экспорт белков). У грамотрицательных бактерий большинство белков секретируется в периплазматическое пространство в виде белков-предшественников, содержащих в своей структуре особый сигнальный (лидерный) пептид из 15 – 40 аминокислотных остатков. Именно он обеспечивает перенос белка-предшественника через ЦМ, после чего и отрезается от него с помощью сигнальной (лидерной) пептидазы.

Существует несколько моделей, объясняющих механизм, посредством которого лидерный пептид обеспечивает секрецию белка-предшественника через ЦМ в периплазматическое пространство.

Модель прямого транспорта предполагает прямое вхождение лидерного пептида в липидный бислой мембраны с использованием свободной энергии мембраноассоциированных рибосом.

Сигнальная гипотеза предполагает, что в результате взаимодействия лидерного пептида непосредственно с особым рецептором мембраны образуется внутримембранный канал, через который и осуществляется секреция.

Существуют и другие, более сложные, модели механизма переноса секретируемого белка через ЦМ. Возможно, что применительно к разным белкам и у разных групп бактерий действуют различные механизмы. Детальнее всего механизмы секреции изучены у E. coli. У нее обнаружены два пути секреции: sec-зависимый и относительно sec-независимый. Для обеспечения секреции белков в случае sec-зависимого механизма требуется участие продуктов ряда sec-генов: secA, secY, secB, secD, secE и secF. Источниками энергии для переноса белков служат гидролиз АТФ и градиент концентрации протонов. Для осуществления посттранслокационного процессинга (англ. processing – обработка) белка после его перемещения (транслокации) достаточно, вероятно, активности только сигнальных пептидаз. У E. coli их обнаружено две: сигнальная пептидаза I (м. м. 36 кД, кодируется геном lepB) и сигнальная пептидаза II (м. м. 18 кД, кодируется геном lepA).

Большой интерес представляет так называемая система секреции 3-го типа (ССТ3). Она осуществляет секрецию эффекторных белков из цитоплазмы клетки через ЦМ и наружную мембрану непосредственно в клетки растения и животного, с которыми бактерия контактирует. ССТ3 обнаружена у бактерий родов Shigella, Salmonella, Yersinia и других и играет у них роль одного из факторов патогенности. Непосредственно в культуральную среду грамотрицательные бактерии экскретируют только некоторые белки, при этом в каждом случае используются различные механизмы, которые также еще недостаточно изучены. Например, бактериоцины, кодируемые различными плазмидами, не содержат в своей структуре сигнальных пептидов. Для их секреции через ЦМ и наружную мембрану требуется специальный вспомогательный белок – рилизинг-белок. Система транспорта гемолизина HlyA, кодируемого генами Hly-плазмиды, состоит как минимум из двух вспомогательных белков HlyB и HlyD, которые образуют канал для непосредственного выхода гемолизина (важного фактора патогенности E. coli) из цитоплазмы во внешнюю среду.

Способы питания

Углеродное питание

К числу важнейших химических элементов-органогенов, необходимых для синтеза органических соединений, относят: углерод, азот, водород и кислород. Свою потребность в водороде и кислороде бактерии удовлетворяют за счет воды. Сложнее обстоит дело с углеродным и азотным питанием. По способу углеродного питания бактерии делят на аутотрофы и гетеротрофы.

Аутотрофы (греч. autos – сам, trophe – питание) – организмы, которые полностью удовлетворяют свои потребности в углероде за счет CO2.

Гетеротрофы (греч. heteros – другой, trophe – питание, т. е. «питаемые другими») – организмы, которые не могут удовлетворить свои потребности в углероде только за счет CO2, а требуют для питания готовых органических соединений. В свою очередь, гетеротрофов подразделяют на сапрофитов (греч. sapros – гнилой, phyton – растение), т. е. гетеротрофов, источником питания которых служат мертвые органические субстраты; и паразитов (греч. para – при, sitos – пища), т. е. гетеротрофов, живущих за счет живых тканей животных и растений. Для превращения CO2 в органические соединения требуется энергия: чтобы восстановить CO2 в один моль гексозы требуется около 112 ккал. Существует два источника этой энергии – фотосинтез и хемосинтез.

ФОТОСИНТЕЗ

Фотосинтез – это синтез за счет энергии солнечного света: свободная энергия фотона красного света (680 нм) ΔG = 41 ккал/моль, голубого (400 нм) – ΔG = = 65 ккал/моль. В результате фотосинтеза растительность земного шара ежегодно синтезирует более 100 млрд тонн органических веществ. На это используется около 200 млрд тонн CO2, и в атмосферу выделяется около 145 млрд тонн свободного O2. Общее количество солнечной энергии, используемой ежегодно для фотосинтеза, составляет не менее 3 ⋅ 1021 Дж.

У растений мобилизация солнечной энергии и превращение ее в энергию химических связей, главным образом в виде АТФ, осуществляется с помощью хлоропластов, содержащих хлорофилл (греч. chloros – зеленый, phyllon – лист) – зеленый пигмент, связанный с белками и липидами их мембран. Основу молекулы хлорофилла составляет магниевый комплекс порфиринового цикла, близкий к другим комплексам порфирина (с железом) – цитохромам, гему и т. п. Поглощая энергию фотона солнечного света, электрон в молекуле хлорофилла возбуждается и переходит с основного энергетического уровня на более высокий, а затем он стремится вновь возвратиться на свой основной, стабильный энергетический уровень, отдавая при этом поглощенную энергию. Если такое возвращение происходит в чистом препарате хлорофилла, поглощенная энергия испускается в виде света. Однако в клетке хлорофилл связан со специфическими молекулами, и поэтому возбужденный электрон отрывается от молекулы хлорофилла и транспортируется этими молекулами – переносчиками электронов. Они передают его по замкнутой цепи реакции вне молекулы хлорофилла. Возбужденный электрон постепенно отдает свою энергию, которая и используется для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфора, а далее электрон возвращается на свое прежнее место в молекуле хлорофилла, способной после этого поглощать другой фотон. В ходе переноса возбужденного электрона по крайней мере два из его переносчиков способны мобилизовать часть переносимой им энергии для синтеза АТФ (рис. 18). В процессе фотосинтеза происходит не только связывание солнечной энергии, но и синтез углеводов, в частности глюкозы, путем восстановления CO2, т. е. добавления к ней электронов и водорода. Источником электронов служит хлорофилл, а источником протонов – вода.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 18. Процесс циклического фосфорилирования, посредством которого в молекуле хлорофилла электрон, перенесенный на более высокий энергетический уровень благодаря поглощению фотона света, обеспечивает энергию, необходимую для образования АТФ (по А. Ленингеру)


Реакция фотосинтеза осуществляется в две фазы. В первой (световые реакции) – под действием фотонов электрон хлорофилла переходит в возбужденное состояние;

затем, возвращаясь в свое обычное энергетическое состояние, он освобождает энергию, которая используется для синтеза таких молекул, как АТФ и НАДФН2. Во второй фазе (темновые реакции) АТФ и НАДФН2 используются для восстановления CO2 в глюкозу.

Суммарная реакция фотосинтеза такова:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Таким образом, молекула глюкозы, которая представляет собой конечный продукт фотосинтеза (наряду с кислородом), содержит большое количество солнечной энергии (около 690 ккал на 1 моль), заключенной в ее молекулярной структуре. Гетеротрофные организмы извлекают эту энергию путем последовательного расщепления молекулы глюкозы для того, чтобы «законсервировать» содержащуюся энергию в форме вновь образующихся молекул АТФ – универсальных хранителей и носителей энергии, необходимой для жизни всех клеток.

К фотосинтезирующим бактериям – фототрофам – относятся цианобактерии (сине-зеленые водоросли), пурпурные и зеленые бактерии, а также некоторые архебактерии.

Цианобактерии – различные многоклеточные нитчатые и одноклеточные организмы, среди них есть подвижные формы, которые передвигаются с помощью скольжения. У цианобактерий, как и у растений, фотосинтез осуществляется с помощью хлорофилла и сопровождается выделением свободного кислорода.

Архебактерии (экстремальные галофилы) осуществляют особую форму фотосинтеза. У них вместо хлорофилла в фотосинтезе участвует особый пигмент – бактериородопсин (комплекс каротиноида ретиналя с белком), который под влиянием света претерпевает фотохимические превращения, непосредственно сопряженные с синтезом АТФ.

Пурпурные и зеленые бактерии содержат различные по составу хлорофиллы (бактериохлорофиллы a, b, c, d и e) и каротиноиды. Большинство зеленых бактерий – мелкие, неподвижные грамотрицательные палочки. Пурпурные бактерии представлены грамотрицательными палочками, кокками или спириллами и часто имеют жгутики. У пурпурных бактерий хлорофилл замаскирован пурпурно-красным или коричневым пигментом, а фотосинтезирующий аппарат заключен в клеточную мембрану, у зеленых – в клеточную мембрану или в специальные органеллы – хлоробиум-везикулы, локализованные в цитоплазме или мембране. В отличие от растений, водорослей и цианобактерий при фотосинтезе пурпурные и зеленые бактерии не выделяют O2, так как для восстановления CO2 они используют в качестве доноров электронов не водород H2O, а водород H2S. При этом пурпурные бактерии окисляют H2S до H2SO4:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

а зеленые серобактерии – до S2:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Некоторые пурпурные и зеленые бактерии в качестве донора электронов используют серу и другие ее неорганические соединения (тиосульфат, сульфит). Все они являются обитателями водоемов, где имеются наиболее благоприятные для них сочетания анаэробных условий, света и источников питания.

ХЕМОСИНТЕЗ

Русским ученым С. Н. Виноградским в 1880 – 1890 гг. было обнаружено, что некоторые грамотрицательные бактерии используют для своего роста энергию хемосинтеза, т. е. энергию, получаемую за счет окисления неорганических соединений. Такие организмы получили название хемоавтотрофов. Им было установлено, что хемоавтотрофы характеризуются двумя важнейшими особенностями:

1. Обладают высокой специфичностью в отношении неорганического источника энергии.

2. Очень часто они не только не способны использовать в качестве источников углерода и энергии органические вещества, но последние даже могут угнетать их рост.

К хемоавтотрофам относятся открытые С. Н. Виноградским нитрифицирующие бактерии, представленные двумя группами. Представители одной из них (роды Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus, Nitrosoglobus) окисляют NH3 до азотистой кислоты:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Представители другой (роды Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus) окисляют азотистую кислоту до азотной:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Выделяемая при хемосинтезе энергия используется нитрифицирующими бактериями для ассимиляции CO2 и восстановления ее до глюкозы или других углеводов. Наиболее многочисленную и разнообразную группу хемосинтезирующих бактерий составляют водородные бактерии, осуществляющие реакцию:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

где (CH2O)n – условное обозначение синтезируемого углевода.

Но эти бактерии являются факультативными хемоавтотрофами, так как способны расти на средах, содержащих органические вещества. Некоторые строго анаэробные метанообразующие бактерии осуществляют хемосинтез по реакции:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

К хемоавтотрофам, как показал С. Н. Виноградский, относятся нитчатые скользящие бактерии Beggiatoa, Thiothrix и другие аэробы, способные окислять сероводород и тиосульфат до серы и сульфата. Внутри таких клеток часто обнаруживается сера.

К числу хемоавтотрофов относятся и некоторые виды железобактерий, в частности рода Gallionella, которые в качестве минерального источника восстановленного железа используют осадок сульфида железа.

У всех хемоавтотрофов ассимиляция CO2 происходит с помощью реакции, катализируемой рибулозодифосфаткарбоксилазой (реакция Кальвина):


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Первичным продуктом фиксации CO2 является 3-фосфоглицериновая кислота, из которой синтезируются все остальные органические молекулы клетки.

Для осуществления ассимиляции CO2 хемоавтотрофы путем окислительной диссимиляции неорганического субстрата получают АТФ и восстановитель (восстановленный пиридиннуклеотид). Нитрифицирующие бактерии и многие тиобациллы имеют особые характерные для прокариот образования – карбоксисомы, содержащие рибулозодифосфаткарбоксилазу.

В зависимости от того, какими донорами электронов пользуются бактерии, их разделяют на литотрофы (используют неорганические доноры электронов H2, NH3, H2S, Fe и др.) и органотрофы (в качестве доноров электронов используют органические соединения).

Таким образом, по способу углеродного питания все организмы можно подразделить на три основные группы:

1. Фотолитотрофы (источник энергии – солнечный свет, доноры электронов – неорганические соединения).

2. Хемолитотрофы (источник энергии – окислительно-восстановительные реакции, доноры электронов – неорганические соединения).

3. Хемоорганотрофы (источник энергии – окислительно-восстановительные реакции, доноры электронов – органические соединения). Большинство патогенных бактерий относится к хемоорганотрофам.

Азотное питание

По способу азотного питания бактерии подразделяют на аминоавтотрофов и аминогетеротрофов. Аминоавтотрофы способны полностью удовлетворять свои потребности в азоте, необходимом для синтеза главным образом белков и нуклеиновых кислот, с помощью атмосферного или минерального азота. Аминогетеротрофы нуждаются для своего питания в готовых органических азотистых соединениях: некоторых аминокислотах, основаниях, витаминах и др.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 19. Рисунок Мальпиги (XVII в.), изображающий корни бобового растения с корневыми клубеньками (1) и оболочкой семени (2), из которого развилось данное растение


К числу аминоавтотрофов относятся азотфиксирующие бактерии, свободно живущие в почве, и так называемые клубеньковые азотфиксирующие бактерии. Первый представитель азотфиксирующих бактерий – Clostridium pasteurianum (анаэроб) – был открыт в 1893 г. С. Н. Виноградским. В 1901 г. М. Бейеринк установил, что способностью усваивать атмосферный азот обладают также аэробные бактерии Azotobacter, занимающие по азотфиксирующей активности первое место (до 25 г азота на 1 кг использованного сахара), но менее распространенные в почве, чем C. pasteurianum. Азотфиксирующими свойствами обладают некоторые виды Pseudomonas, Bacillus, цианобактерий, а также пурпурные и зеленые серобактерии. Азотфиксирующие бактерии рода

Rhizobium получили название клубеньковых потому, что они, размножаясь на корнях ряда бобовых растений, образуют выросты-клубеньки (рис. 19). Размножаясь в них, они превращаются из мелких палочек в разветвленные формы – бактероиды, которые наиболее интенсивно связывают молекулярный азот. Симбиоз клубеньковых бактерий с растениями взаимовыгоден, так как Rhizobium продуцируют ряд физиологически активных соединений, которые благоприятно влияют на бобовые растения. После разрушения клубеньков клубеньковые бактерии живут в почве как сапрофиты.

Азотфиксирующие бактерии восстанавливают азот (N2) до NH3 с помощью сложной ферментной системы нитрогеназы, содержащей железо, молибден, магний. Эта система нуждается в источнике электронов, которые поступают через восстановитель с низким потенциалом, содержащий негеминовое железо – ферредоксин (переносчик электронов).


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Цепь переноса электронов состоит из ферредоксина (Фд), азоферредоксина (АзоФд) и молибдоферредоксина (МоФд), и за один раз переносятся только два электрона. Для последнего переноса расходуется 1 молекула АТФ.

Поскольку для восстановления N2 до NH3 требуется шесть электронов, реакция, очевидно, протекает через три последовательные двухэлектронные стадии:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Подробное выяснение механизма генетического контроля азотфиксирующих систем бактерий может создать необходимые предпосылки для искусственного переноса оперонов этих систем в геном растений и конструирования трансгенных растительных организмов, обладающих азотфиксирующей активностью, что имело бы огромное значение для сельского хозяйства.

Вторая большая группа аминоавтотрофов представлена нитрифицирующими бактериями, которые используют для синтеза белков в качестве основных источников азота соли аммиака, азотистой и азотной кислот. Подсчитано, что на образование вновь вырастающих растений ежегодно требуется около 1,5 млрд тонн азота в форме, доступной растениям. Поэтому нельзя не отметить, что азотфиксирующим и нитрифицирующим бактериям принадлежит исключительно важная роль в обеспечении плодородия почвы (см. раздел «Роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе», гл. 15).

Аминогетеротрофы для роста и размножения нуждаются в различных органических азотистых соединениях. Необходимо оговориться, что аминогетеротрофы представляют собой также неоднородную группу, так как многие из них нуждаются для роста лишь в определенных аминокислотах, как, например, Francisella tularensis. Для ее роста требуется добавление к среде по крайней мере 10 аминокислот. В то же время многие бактерии, синтезируя аминокислоты и основания из минеральных источников азота, нуждаются в тех витаминах (ростовых факторах), которые сами не способны синтезировать: биотин (Н), тиамин (В1), рибофлавин (В2), пантотеновая кислота (В3), холин (В4), никотинамид (В5), фолиевая кислота (В9) и ее производные (В11) и т. п. Наконец, есть патогенные бактерии, например группа гемоглобинофильных организмов (Haemophilus), которые для роста нуждаются в добавлении к питательной среде сложных веществ, содержащихся в крови: Х-факторов (гемин) и др. Кроме того, в результате различных мутаций аминогетеротрофные бактерии могут превращаться в мутанты, неспособные синтезировать тот или иной метаболит и поэтому нуждающиеся в нем. Такие мутанты получили название ауксотрофов (лат. auxilium – помощь и греч. trophe – питание). Они во многом способствовали изучению особенностей биохимии бактерий.

Для нормальной жизнедеятельности бактерии, как и другие организмы, обязательно нуждаются в ионах Na+, K+, Cl-, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Cu2+, а также в фосфоре и сере, которые поступают в клетку путем диффузии и активного транспорта.

Все процессы обмена веществ представляют собой цепь взаимосвязанных во времени и пространстве саморегулируемых реакций. Каждая из них и их совокупные пути катализируются соответствующими ферментами.

Ферменты

Ферменты (греч. fermentum – закваска), или энзимы, – специфические белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках. Их нет у плазмид, у некоторых вирусов. Ферменты снижают энергию активации, которая необходима для осуществления той или иной химической реакции. Они направляют ее обходным путем через промежуточные реакции, требующие значительно меньшей энергии активации. Под влиянием ферментов происходит перераспределение электронных плотностей и некоторая деформация молекул субстрата, наступающая при образовании промежуточного фермент-субстратного комплекса. Эта деформация приводит к ослаблению внутримолекулярных связей и, следовательно, к понижению необходимой энергии активации, в результате чего скорость реакции возрастает. Открытию различных ферментов и изучению путей биохимических реакций, катализируемых ими, во многом способствовали работы с использованием в качестве объектов исследования бактерий, особенно ауксотрофов. У бактерий обнаружены все шесть классов ферментов:

1) оксидоредуктазы (катализируют окислительно-восстановительные реакции);

2) трансферазы (катализируют реакции переноса групп атомов);

3) гидролазы (катализируют гидролитическое расщепление различных соединений);

4) лиазы (катализируют реакции отщепления от субстрата той или иной химической группы негидролитическими путями с образованием двойной связи или, наоборот, присоединение химической группы к двойным связям);

5) изомеразы (катализируют внутримолекулярные превращения);

6) лигазы, или синтетазы (катализируют соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата).

Изучение ферментов, обнаруживаемых у бактерий, представляет большой интерес для микробиологической промышленности. Изучение особенностей обмена веществ патогенных бактерий необходимо прежде всего для понимания механизмов, с помощью которых они реализуют свою патогенность, т. е. для выяснения сущности патогенеза инфекционных заболеваний. Изучение биохимических свойств бактерий широко используется как для их систематики и классификации, так и для идентификации, т. е. для диагностики.

У бактерий обнаружены уникальные генетические механизмы контроля биосинтеза ферментов, они проявляются в виде феноменов индукции и репрессии. Индукция заключается в том, что синтез ферментов наступает только в присутствии специфических химических веществ, которые являются субстратом для данного фермента или аналогом этого субстрата. Например, синтез ферментов, участвующих в потреблении лактозы у E. coli, начинается (индуцируется) и происходит только при наличии в среде лактозы. Как только она исчезает, синтез этих ферментов прекращается.

Под эффектом репрессии понимают явление, при котором синтез фермента подавляется (репрессируется) под влиянием специфических химических соединений, почти всегда являющихся непосредственными продуктами (или аналогами продуктов) реакции, катализируемой этим ферментом. Например, синтез ферментов, участвующих в образовании метионина у E. coli, прекращается, как только в среде накапливается избыток этой аминокислоты. Нетрудно видеть, насколько совершенен такой механизм саморегуляции биохимических процессов.

В соответствии с этими особенностями генетического контроля, у бактерий различают три основные группы ферментов: конститутивные, синтез которых происходит в течение всего клеточного цикла; индуцибельные, синтез которых индуцируется соответствующим субстратом; и репрессибельные, синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом (ферментами).

Метаболизм

Биохимические процессы, протекающие в клетке, объединены одним словом – метаболизм (греч. metabole – превращение). Этот термин равнозначен понятию «обмен веществ и энергии». Различают две стороны метаболизма: анаболизм и катаболизм.

Анаболизм – совокупность биохимических реакций, осуществляющих синтез компонентов клетки, т. е. та сторона обмена веществ, которую называют конструктивным обменом.

Катаболизм – совокупность реакций, обеспечивающих клетку энергией, необходимой, в частности, и для реакций конструктивного обмена. Поэтому катаболизм определяют еще как энергетический обмен клетки.

В конструктивном обмене можно выделить две группы биосинтетических процессов: биосинтез мономеров (аминокислот, нуклеотидов, моносахаров, жирных кислот) и биосинтез полимеров (белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов). Для их синтеза необходимо около 70 различных мономеров-предшественников. Помимо них, клетка должна синтезировать ряд соединений, играющих каталитическую роль. Синтез любого мономера происходит (при наличии источников углерода и энергии) через цепь последовательных биохимических реакций, катализируемых специфическими белками-ферментами. В свою очередь синтез всех биополимеров также требует участия специфических белков. Поэтому основу основ конструктивного обмена составляет биосинтез белков, который находится под контролем генетической системы организма.

Глава 6

Конструктивный обмен (анаболизм). Биосинтез белка

Состав белоксинтезирующей системы

Синтез белка осуществляется с помощью сложной белоксинтезирующей системы. В ее состав входят следующие компоненты.

1. Рибосомные субъединицы 30S и 50S, которые у прокариот и в митохондриях и хлоропластах эукариот образуют рибосому 70S; или субъединицы 40S и 60S, образующие у эукариот рибосому 80S.

2. Матричная РНК (мРНК).

3. Полный комплект двадцати аминоацил-тРНК, для образования которых необходимы соответствующие аминокислоты, аминоацил-тРНК-синтетазы, тРНК и АТФ. Аминоацил-тРНК (аа-тРНК) – это заряженная энергией и связанная с тРНК аминокислота, готовая для подвоза к рибосоме и включения в синтезирующийся на ней полипептид.

4. Белковые факторы инициации (у прокариот – IF-1, IF-2, IF-3).

5. Белковые факторы элонгации (у прокариот – EF-Tu, EF-Ts, EF-G).

6. Белковые факторы терминации (у прокариот – RF-1, RF-2, RF-3).

7. Некоторые другие белковые факторы (ассоциации, диссоциации субъединиц, высвобождения и пр.).

8. Гуанозинтрифосфат (ГТФ).

9. Неорганические катионы: двухвалентные – Mg2+ или Ca2+ – и одновалентные – K+ или HN4+ – в определенной концентрации.

Основным компонентом белоксинтезирующей системы является рибосома. Она объединяет все компоненты в единый комплекс. Рибосомы – «святая святых» клетки, так как именно на них совершается самое удивительное таинство живой материи – биологический синтез белка. Информация, содержащаяся в геноме, расшифровывается и материализуется в виде белков на рибосомах. Без них проявление жизнедеятельности невозможно.

Вирусы и плазмиды потому и являются облигатными внутриклеточными паразитами, что у них отсутствуют собственные рибосомы, и для реализации генетической информации (т. е. для проявления своей жизнедеятельности) они используют рибосомный аппарат клетки-хозяина.

Универсальности генетического кода соответствует универсальность механизма его расшифровки и реализации.

В природе существует только два класса рибосом – 70S и 80S. Они имеют сходную молекулярную структуру и механизм функционирования, хотя и различаются по размерам, составу и специфичности белков и белковых факторов. Схематический состав рибосом 70S и 80S показан на рис. 20.

Далее весь процесс биосинтеза белка будет рассматриваться на примере работы рибосом 70S.

Белковые факторы инициации (англ. initiation factors – IF) получили свое название потому, что они участвуют в организации активного комплекса (70S-комплекса) из субъединиц 30S и 50S, мРНК и инициаторной аминоацил-тРНК (у прокариот – формилметионил-тРНК), который «запускает» (инициирует) работу рибосом – трансляцию мРНК.

Белковые факторы элонгации (англ. elongation factors – EF) участвуют в удлинении (элонгации) синтезируемой полипептидной цепи (пептидила).

Белковые факторы терминации, или освобождения (англ. – release factors – RF) обеспечивают кодон-специфическое отделение полипептида от рибосомы и окончание синтеза белка.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 20. Схематическое изображение структур прокариотических и эукариотических рибосом


Для осуществления трансляции необходимо участие ГТФ. Потребность белоксинтезирующей системы в ГТФ очень специфична: он не может быть заменен ни одним из других трифосфатов.

На биосинтез белка клетка затрачивает энергии больше, чем на синтез любого другого биополимера. Образование каждой новой пептидной связи требует расщепления четырех высокоэнергетических связей (АТФ и ГТФ): двух для того, чтобы нагрузить аминокислотой молекулу тРНК, и еще двух в ходе элонгации – одну при связывании аа-тРНК и другую при транслокации.

Рибосома выполняет следующие функции, необходимые для биосинтеза белка.

1. Функция динамического связывания и удержания всех компонентов белоксинтезирующей системы, благодаря чему создаются условия для встречи и взаимопрочитывания двух основных потоков информации, один из которых запрограммирован в мРНК, а другой – в антикодонах аа-тРНК; одновременно формируется биологическая машина, синтезирующая белок в строгом соответствии с последовательностью поступления в рибосому этой информации.

2. Каталитические функции, в частности образование пептидных связей между аминокислотами в синтезируемом полипептиде и гидролиз ГТФ.

3. Функция механического перемещения (транслокации): транслокация растущего пептида, связанного с тРНК, с одного участка рибосомы на другой и продвижение рибосомы вдоль мРНК. Выполнение этих функций обеспечивается наличием на рибосоме особых активных участков. Таких участков три (см. рис. 25). С одним из них связывается мРНК. Два других разных участка предназначены для связывания молекулы тРНК. В одном из них, получившем название пептидил-тРНК-связывающего участка, или Р-участка, прикрепляется тРНК, присоединенная к растущему концу полипептидной цепи – донорная тРНК. В другом – аминоацил-тРНК-связывающем участке, или А-участке, – связывается только что поступившая молекула тРНК, нагруженная аминокислотой – акцепторная тРНК. В обоих участках молекулы тРНК прочно прикрепляются лишь в том случае, если их антикодоны комплементарны кодонам мРНК и с ними спариваются. А– и Р-участки располагаются очень близко друг от друга, и поэтому связанные с ними молекулы тРНК связываются с двумя соседними кодонами в молекуле мРНК. Благодаря такому близкому расположению донорной тРНК, несущей пептидил, и акцепторной тРНК, несущей активированную аминокислоту, облегчается образование пептидных связей в синтезируемой полипептидной цепи. В процессе элонгации карбоксильный конец растущего пептидила отделяется в Р-участке от молекулы донорной тРНК и образует пептидную связь с аминокислотой, присоединенной к молекуле акцепторной аа-тРНК. Эта реакция катализируется не белковым ферментом, а особым фрагментом РНК большой субъединицы рибосомы (50S), который назвали рибозимом (по аналогии с «энзимом»).


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

где (X)n – аминоацильные звенья пептидил-тРНК, R – радикалы.

Основные этапы биосинтеза белка

Процесс синтеза белка складывается из двух основных этапов: транскрипции и трансляции.

Первичная структура каждого белка (т. е. последовательность расположения в нем аминокислот), от которой зависит его специфичность, запрограммирована в соответствующем гене в виде последовательности расположения в нем кодонов. Перенос этой информации о структуре белка к рибосомам происходит с помощью мРНК. Процесс синтеза мРНК на генах и получил название транскрипции, или переписывания информации с ДНК-гена на мРНК-ген. Транскрипция осуществляется с помощью ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Этот фермент представляет собой сложный белковый комплекс с м. м. около 480 кД. У бактерий он состоит по крайней мере из пяти белковых субъединиц: две α, β, β' и σ. Комплекс субъединиц α2, β, β' (core-энзим), хотя и обладает каталитической активностью, однако не может правильно выбирать точку начала транскрипции. Присоединение к этому комплексу σ-субъединицы превращает его в полноценный фермент РНК-полимеразу (холоэнзим). Сигма-субъединица РНК-полимеразы выполняет две основные функции: вопервых, она завершает формирование полноценной РНК-полимеразы, во-вторых, она наделяет ее способностью распознавать промотор на ДНК, с которого начинается транскрипция. Сигма-фактор освобождается от комплекса холоэнзим-ДНК немедленно после начала синтеза мРНК и может повторно использоваться для образования холоэнзима. Транскрипция является сложным многоступенчатым процессом, который включает в себя следующие основные стадии.

1. Инициация транскрипции, во время которой:

а) core-энзим взаимодействует с σ-фактором, образуя холоэнзим РНК-полимеразы;

б) РНК-полимераза связывается с промотором на ДНК и образует транскрипционный комплекс (ДНК-холоэнзим);

в) начинается синтез мРНК и высвобождается σ-фактор.

2. Собственно транскрипция (элонгация, или удлинение цепи мРНК).

3. Терминация транскрипции, сопровождающаяся диссоциацией транскрипционного комплекса и высвобождением core-энзима.

Процесс транскрипции у эукариот протекает сложнее. У них нет сигма-фактора. Работе РНК-полимеразы у эукариот помогают пять белковых комплексов.

Американский ученый Роджер Корнберг (Roger D. Kornberg) с помощью тонкого рентгеноструктурного анализа установил трехмерную организацию (конформацию) РНК-полимеразы II – сложнейшего комплекса, который состоит из многих белков, включающих в себя 30 000 атомов. Из кристаллографических снимков процесса транскрипции у эукариотной дрожжевой клетки он создал молекулярный портрет РНК-полимеразы в виде цветного рисунка, на котором копируемая нить ДНК, РНКполимераза и синтезируемая мРНК окрашены в разные цвета. Этот и серию поясняющих рисунков Р. Корнберг с соавторами опубликовал в журнале «Science» в 2001 г. (Vol. 292, 8 June 2001, pp. 1876–1882; published online 19 April 2001; 10.1126/science.1059495), а в 2006 г. он был удостоен за свои исследования Нобелевской премии (см. цв. вкл., рис. 119). Рисунки показывают, как РНК-полимераза распознает свой промотор (участок ДНК, с которого начинается транскрипция), вступает с ним в химическую связь, затем расплетает в этом участке нити ДНК и одновременно обеспечивает правильное присоединение рибонуклеотидов к комплементарным нуклеотидам копируемой нити ДНК. По мере того, как рабочий блок РНК-полимеразы сдвигает нить ДНК, открывая для копирования ее новые участки, растущая нить мРНК отходит в сторону от ДНК-матрицы, а ДНК восстанавливает двухцепочечную структуру. Конец синтеза мРНК наступает, когда РНК-полимераза достигает кодона копируемой цепи, определяющего завершение синтеза мРНК. В этом месте происходит отторжение РНК-полимеразы от ДНК. Вновь синтезированная мРНК также отделяется от ДНК и соединяется с особым белком, который и транспортирует ее из ядра клетки в цитоплазму для трансляции рибосомами в белок по той информации, которая заключена в данной мРНК. (У прокариот вновь синтезируемая мРНК подвергается трансляции уже с самого начала транскрипции.)

С помощью своих регуляторных систем бактериальная клетка «решает», какие белки ей необходимы в данных условиях, и запускает транскрипцию соответствующих оперонов. Поскольку многие из них состоят из нескольких структурных генов (цистронов), оперон прочитывается как одна транскрипционная единица. У бактерий существуют моноцистронные и полицистронные мРНК. В результате трансляции полицистронной мРНК синтезируется столько полипептидных цепей, сколько имеется цистронов в данном опероне. Область ДНК, с которой связывается РНК-полимераза, называется промотором. Он представляет собой начальную часть оперона длиной около 80 пар нуклеотидов. Промоторы содержат две характерные нуклеотидные последовательности, локализованные на расстоянии примерно 10 и 35 нуклеотидов перед первым транскрибируемым основанием. Они необходимы для распознавания РНК-полимеразой промотора и связывания с ним.

Расположение этих последовательностей в одной из цепей ДНК указывает РНКполимеразе, какую из нитей необходимо считывать. Матричная РНК представляет собой однонитевую полирибонуклеотидную цепь, комплементарную той нити ДНК, которая послужила матрицей для ее синтеза.

В составе бактериальной мРНК различают следующие участки (рис. 21):

1. 5'-нетранслируемая последовательность (5'-НТП). 5'-концевой нуклеотид содержит, как правило, одно из пуриновых оснований (А или Г), и, если после транскрипции мРНК не подвергалась никаким изменениям, этот нуклеотид несет трифосфатную группировку (5'фффГ…3').

На 5'-конце эукариотических мРНК располагается другая структура, образующаяся посттранскрипционно, – кэп (англ. cap – шапочка), которая необходима для узнавания мРНК эукариотическими рибосомами.

В составе 5'-НТП обнаружена особая последовательность из 3 – 5 нуклеотидов, комплементарная 3'-концу 16S рРНК. Эта последовательность облегчает инициацию трансляции мРНК рибосомами, так как она стабилизирует положение на рибосоме инициаторного кодона мРНК. Вместе с тем 5'-НТП придает этому участку мРНК определенную вторичную структуру, благодаря чему инициаторный кодон (АУГ) занимает положение, которое облегчает его узнавание и взаимодействие с рибосомой.

2. Инициаторный кодон, т. е. кодон, с которого начинается трансляция мРНК. Чаще всего у бактерий им является триплет АУГ, хотя в некоторых мРНК его функции выполняет кодон ГУГ. Однако триплеты АУГ и ГУГ узнаются рибосомами как инициаторные, только если они входят в состав особой вторичной структуры в мРНК. Во всех иных случаях (внутри структурных генов) они прочитываются как метионин (АУГ) и валин (ГУГ).


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 21. Схематическое изображение гипотетической бактериальной мРНК Жирная линия – область, кодирующая полипептид. Объяснение в тексте


3. Область, кодирующая полипептидную цепь (в нее входит и инициаторный кодон). На ее 3'-конце располагаются один или сразу два терминирующих кодона. Узнавая эти кодоны, рибосома прекращает трансляцию, а в случае полицистронной мРНК рибосома приступает к трансляции следующего цистрона.

4. 3'-нетранслируемая последовательность (3'-НТП), длина ее невелика, а функция не известна.

Для обеспечения биосинтеза белка необходимы следующие условия:

1) наличие всех компонентов белоксинтезирующей системы, из которых формируется машина для синтеза белка;

2) наличие соответствующих физико-химических условий (рН, температура, ионы Mg2+, K+ и др.);

3) наличие энергии, уникальным поставщиком которой для синтеза белка является ГТФ;

4) наличие матрицы (мРНК);

5) наличие строительных блоков – аминокислот для синтеза белка в форме активированных и связанных с тРНК аминоацил-тРНК.

Аминокислоты в клетке, как правило, не существуют в свободном виде. Они взаимодействуют с тРНК и сохраняются в виде аминоацилированных тРНК (аа-тРНК). Биологический смысл такой «мобилизации» тРНК заключается в том, что аминокислоты при этом предохраняются от действия окислительных ферментов и не «сгорают» в клетке в качестве источника энергии, а используются для синтеза белка. Лишь при избытке какой-нибудь аминокислоты часть ее вовлекается в энергетический обмен.

Важная регулирующая роль в биосинтезе белка помимо мРНК принадлежит транспортной РНК (тРНК). Она выполняет следующие три функции.

1. С помощью специального фермента (аминоацил-тРНК-синтетазы) тРНК присоединяет на одном из своих концов соответствующую аминокислоту, в результате чего возникает лабильное соединение – аминоацил-тРНК (аа-тРНК) – акцепторная функция тРНК.

2. Транспортная РНК при участии специальных белковых факторов и ГТФ доставляет аминокислоту в форме аа-тРНК в рибосому для включения ее в синтезируемую полипептидную цепь – транспортная функция тРНК.

3. Транспортная РНК с помощью своего антикодона специфически взаимодействует с комплементарным ему кодоном мРНК и таким образом обеспечивает необходимую последовательность включения аминокислот в растущую полипептидную цепь в соответствии с программой, заданной в мРНК – адапторная функция тРНК.

С помощью своих антикодонов тРНК осуществляет дешифровку генетического кода в мРНК и перевод его в аминокислотный код белковой молекулы. Реализация этих функций осуществляется благодаря уникальной структуре молекулы тРНК.

В клетке содержится набор примерно из 60 различных типов тРНК, что соответствует количеству значащих кодонов.

Первичная структура (нуклеотидная последовательность) изучена почти у всех типов тРНК. Все они имеют константу седиментации около 48S, а длина их варьирует в зависимости от вида клеток и аминокислотной специфичности от 73 до 93 нуклеотидов.

Характерной особенностью всех типов тРНК является высокое содержание в них необычных оснований, например, инозина (И), дигидроуридина (дигидро-У), псевдоуридина (Ψ); всего в разных типах тРНК обнаружено более 50 вариантов модифицированных оснований. В зависимости от их специфичности к аминокислотам, которые они транспортируют к рибосомам, различают аланиновые тРНК (тРНКала), тирозиновые (тРНКтир), валиновые (тРНКвал) и т. д.

Изучение первичной структуры тРНК показало, что они представляют собой семейство сходных молекул (рис. 22). Все они без исключения имеют универсальный 3'-концевой тринуклеотид – ЦЦА-3'; фенилаланиновые и метиониновые тРНК у всех млекопитающих обладают идентичной структурой. Еще более консервативными являются инициаторные тРНК.

Все тРНК имеют сходную вторичную структуру, напоминающую лист клевера. При этом образуются характерные для молекул тРНК двунитевые (ветви) и однонитевые (петли) участки (см. рис. 22). У всех тРНК последовательности нуклеотидов, соответствующие антикодону, находятся в середине петли, расположенной напротив ЦЦА-ветви. Например, в тРНКала роль антикодона выполняет триплет ИГЦ, тРНКсер – ИГА, тРНКлей – ЦАГ и т. д. В процессе взаимодействия тРНК с мРНК первые два основных кодона по принципу комплементарности образуют водородные связи с двумя последними основаниями антикодона. Третий элемент антикодона может образовывать пары с тремя различными основаниями: У, Ц и А. Поэтому антикодон может распознавать несколько кодонов для одной и той же аминокислоты, например, антикодон тРНКала ИГЦ может распознавать все три триплета, которые кодируют аланин (ГЦУ, ГЦЦ и ГЦА). Обладая большим сходством структуры, различные тРНК вместе с тем характеризуются строгой индивидуальностью, которая определяется специфичностью набора минорных оснований, последовательностью нуклеотидов в варьирующих участках молекулы, содержанием оснований в антикодоне и другими особенностями.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 22. Обобщенное изображение молекулы тРНК в виде клеверного листа, характерное для неинициаторных тРНК

Заглавными буквами обозначены нуклеотиды, постоянно или почти постоянно встречающиеся в данном месте цепи. Пу – пурин; Пи – пиримидин; Н – гипермодифицированный пурин.

Кружками обозначены основания, различающиеся у разных тРНК; линии между ними – водородные связи. I, II, III – нуклеотиды антикодона


Обладая сходной первичной структурой, все тРНК имеют и сходную пространственную структуру (рис. 23). Молекула тРНК содержит два сегмента двойных спиралей, закрученных по длине. Они ориентированы друг к другу почти под прямым углом, образуя структуру, напоминающую букву Г. Псевдоуридиновая ветвь (ТΨЦ) располагается в углу молекулы, близко к ней примыкает дигидроуридиновая ветвь (Н2У). На коротком конце молекулы располагается акцепторный участок – ЦЦА (место присоединения аминокислоты). Длинный конец молекулы заканчивается триплетом оснований, образующих антикодон.

Добавочная ветвь молекулы у разных тРНК содержит различное количество нуклеотидов (4 – 21).

Ветвь, содержащая акцепторный конец, свободна от контактов с остальной частью молекулы. Благодаря этому она может изменять свою ориентацию, что, возможно, существенно для выполнения функций тРНК, связанных с присоединением аминокислот или с их передачей на рибосомы.

Аминокислоты всегда присоединяются к акцепторному триплету ЦЦА. Присоединение происходит путем образования ковалентной связи между карбоксильной группой аминокислоты и гидроксильной группой третьего углеродного атома рибозы – 3'-OH. Связь между аминокислотой и тРНК получила название аминоацильной (рис. 24). Из факта образования аминоацильной связи вытекают два важных следствия. Во-первых, поскольку тРНК связывается с карбоксильной группой ( – COOH) аминокислоты, то прежде, чем карбоксил сможет образовать пептидную связь со следующей аминокислотой во время синтеза полипептидной цепи, тРНК должна отделиться от аминокислоты. Следовательно, эти два процесса – отделение тРНК от аминокислоты и образование пептидной связи (см. формулу на с. 69) – должны происходить согласованно (рис. 25).


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 23. Структура дрожжевой фенилаланиновой тРНК


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 24. Присоединение аминокислоты эфирной связью к 3'-гидроксилу аденозина тРНК


Во-вторых, аминоацильная связь относится к типу связей, богатых энергией. Следовательно, образование аминоацил-тРНК можно рассматривать как активирование аминокислоты. Источником энергии, необходимой для образования этой связи, является АТФ.

Процесс образования аминоацил-тРНК складывается из двух реакций. Вначале происходит взаимодействие свободной аминокислоты с АТФ. В результате этой реакции образуется аминоациладенилат (аминокислота, соединенная богатой энергией связью с АМФ). Затем сразу же происходит вторая реакция – присоединение активированного аминокислотного остатка к акцепторному триплету тРНК, в результате чего образуется аминоацил-тРНК, а АМФ высвобождается.

Обе эти реакции катализируются аминоацилтРНК-синтетазой. Этот фермент обладает строгой специфичностью. Для каждой аминокислоты существует своя специфическая аминоацил-тРНК-синтетаза, которая узнает только данную аминокислоту, активирует ее и затем перебрасывает на акцепторный конец тРНК. В клетке содержится 20 специфических аминоацил-тРНК-синтетаз. Ферменты обладают специфичностью не только в отношении аминокислоты, но и тРНК. Правда, у бактерий этот фермент не различает изоакцепторных тРНК, т. е. один фермент обслуживает все действующие для данной аминокислоты тРНК.

Благодаря высокой специфичности аминоацил-тРНК-синтетаз обеспечивается индивидуальный выбор соответствующей аминокислоты совершенно определенной тРНК.

Из факта специфичности аминоацил-тРНК-синтетаз по отношению к аминокислотам и тРНК следует, что фермент имеет два различных центра связывания: один – для взаимодействия с аминокислотой, а другой – со специфической тРНК. В свою очередь, каждая тРНК имеет также два специфических участка: один – для узнавания фермента, а другой – кодона мРНК. Таким образом, на уровне аминоацил-тРНКсинтетаз происходит переключение трехбуквенного генетического кода в двадцатибуквенный аминокислотный код белков и, наоборот, аминокислотного кода белков в триплетный генетический код.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 25. Схематическое изображение трех главных участков связывания, в которых молекулы тРНК присоединяются к рибосоме

Слева – ненагруженная рибосома; справа – нагруженная (по Б. Альбертсу [и др.])


Трансляция

Трансляция – процесс расшифровки генетического кода в мРНК и овеществление его в виде полипептидной цепи, последовательность расположения аминокислот в которой определяется порядком расположения кодонов в данной мРНК. Трансляция, таким образом, – это процесс собственно биосинтеза белка на рибосомах. Он состоит из следующих основных этапов:

1. Инициации (начала) трансляции.

2. Элонгации, или удлинения полипептидной цепи (собственно трансляция).

3. Терминации (окончания) трансляции.

4. Модификации полипептидной цепи.

Каждый из этих этапов представляет собой сложный многоступенчатый процесс и находится под жестким контролем, осуществляемым прежде всего компонентами самой белоксинтезирующей системы.

Инициирующие кодоны и инициаторная транспортная РНК

Рост полипептидной цепи на рибосоме происходит таким образом, что каждая новая пептидная связь образуется между карбоксильной группой предшествующего и аминогруппой присоединяемого аминокислотных остатков, т. е. в направлении COOH→NH2. Поэтому у первой (начальной) аминокислоты полипептидной цепи свободной будет NH2-группа, ее обозначают как N-концевую аминокислоту, а у последней остается свободной COOH-группа (C-концевая аминокислота).

Биосинтез белка у прокариот и эукариот происходит таким образом, что N-концевое положение в полипептидной цепи всегда занимает метионин. Иначе говоря, синтез белка начинается с включения метионина – инициаторной аминокислоты. Для транспорта инициаторной аминокислоты, т. е. метионина, когда он занимает N-концевое положение, используется специальная строго специфическая инициаторная тРНК – тРНКф-мет. Она отличается от той тРНКмет, которая поставляет метионин в любое другое место полипептидной цепи, тем, что переносит его только в N-концевое положение. У бактерий после связывания метионина с инициаторной тРНК группа NH2 аминокислоты с помощью особого фермента формилируется, т. е. соединяется с формильным остатком ( – CHO), который ее блокирует. Причем фермент узнает не просто метионин, а особую структуру специфической инициаторной тРНК, с которой метионин уже связан. Таким образом, тРНКф-мет отличается от обычной тРНКмет, которая также акцептирует метионин, но без последующего его формилирования.

У эукариот инициаторной аминоацил-тРНК является особая метионил-тРНК с неблокированной NH2-группой.

Триплетами, кодирующими присоединение инициаторных аминокислот (формилметионил-тРНК и метионил-тРНК), являются АУГ и ГУГ, получившие название инициаторных кодонов. Однако они выполняют функцию инициирующего кодона лишь в том случае, когда являются начальными триплетами при считывании мРНК. Их роль как инициаторных кодонов определяется рибосомами благодаря особой вторичной структуре, которая образуется на мРНК в районе расположения этих триплетов. Если же эти кодоны располагаются внутри цепи мРНК, то каждый из них распознается как кодон для метионина (АУГ) или валина (ГУГ).

Инициация трансляции

Под инициацией трансляции понимают процесс формирования функционально активного комплекса рибосома 70S – мРНК, постановки формилметионил-тРНК на Р-участок рибосомы и освобождения А-участка для очередной аминоацил-тРНК. В результате вся белоксинтезирующая система переводится в состояние, позволяющее соединять аминокислоты в полипептидную цепь в той последовательности, которая задается мРНК.

В образовании инициаторного комплекса принимают участие: мРНК с инициирующим кодоном АУГ (ГУГ); обе субъединицы (30S и 50S); белковые факторы инициации (IF-1, IF-2, IF-3), фактор ассоциации (AF); формилметионил-тРНК и ГТФ. Процесс инициации складывается из нескольких стадий, катализируемых белковыми факторами инициации. Каждая 70S рибосома собирается на мРНК из двух субъединиц 30S и 50S. Вначале присоединяется 30S субъединица, предварительно нагруженная инициаторной тРНК, узнающей инициаторный кодон АУГ и несущей метионин. Этот процесс катализируется IF-2. 30S субъединица присоединяется к инициаторному кодону путем спаривания антикодона соединенной с ней инициаторной тРНК с инициаторным кодоном АУГ мРНК. В молекуле мРНК обычно имеется много кодонов АУГ, и каждый из них кодирует метионин. Выбор инициаторного кодона АУГ облегчается особой структурой бактериальной мРНК (см. рис. 21). Инициаторным кодоном всегда служит АУГ, ближайший к 5'-НТП. После завершения этого процесса все факторы инициации, остававшиеся до этого момента связанными с 30S субъединицей, отделяются от нее, к ней присоединяется 50S субъединица, и формируется функционально активная рибосома 70S. Молекула инициаторной тРНК с метионином оказывается связанной с Р-участком рибосомы. Поэтому синтез полипептидной цепи может начинаться сразу же после присоединения к свободному А-участку рибосомы второй молекулы аа-тРНК, выбор которой определяется кодоном, расположенным в молекуле мРНК сразу же после инициаторного АУГ-кодона. Далее начинается стадия элонгации.

Элонгация

Элонгация представляет собой процесс удлинения растущей на рибосоме полипептидной цепи за счет включения в нее аминокислотных остатков в последовательности, соответствующей порядку расположения кодонов в мРНК.

После присоединения к формилметионину очередной аминоацил-тРНК растущая полипептидная цепь превращается в пептидил-тРНК.

Для осуществления элонгации, помимо уже сформировавшегося активного комплекса 70S-рибосома – мРНК – формилметионил-тРНК (пептидил-тРНК), необходимо участие белковых факторов элонгации (у прокариот – EF-Тu, EF-Ts, EF-G) иГТФ.

Элонгация протекает как многократно повторяющийся (по числу кодонов в мРНК) циклический процесс, складывающийся из трех отдельных этапов (рис. 26).

Первый этап – связывание молекулы аа-тРНК со свободным А-участком рибосомы. При этом Р-участок занят тРНК, несущей пептидил. Связывание происходит путем спаривания нуклеотидов антикодона аа-тРНК с кодоном мРНК, расположенным в А-участке.

Второй этап – образование очередной пептидной связи. Карбоксильный конец растущего пептидила отделяется в Р-участке от молекулы донорной тРНК (т. е. тРНК, несущей пептидил) и образует пептидную связь с аминокислотой, присоединенной к молекуле акцепторной тРНК (т. е. служащей акцептором для растущего пептидила) в А-участке (см. формулу на с. 69).

Третий этап – транслокация. Образовавшаяся новая пептидил-тРНК переносится из А-участка в Р-участок рибосомы, а сама рибосома продвигается вдоль мРНК ровно на один кодон (три нуклеотида). Это событие требует затраты энергии. Движущей силой транслокации служит ряд конформационных изменений, вызываемых в одном из белков рибосомы в результате гидролиза связанной с ним ГТФ. В момент транслокации происходит отделение освободившейся во время второго этапа от пептидила в Р-участке тРНК и возвращение ее в цитоплазму. По завершении третьего этапа рибосома возвращается в состояние, аналогичное исходному. Ее А-участок свободен и может принять новую молекулу аа-тРНК, отбираемую очередным кодоном мРНК, т. е. рибосома может снова повторить цикл элонгации.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 26. Схематическое изображение основных фаз элонгации, протекающей на рибосомах

Объяснение в тексте (по Б. Альбертсу [и др.])


Таким образом, каждый цикл работы рибосомы означает присоединение одной аминокислоты (трансляцию одного кодона). В ходе элонгации рибосома совершает последовательно столько циклов, сколько кодонов она транслирует, т. е. сколько аминокислот она включает в полипептидную цепь.

Терминация трансляции

Терминация трансляции – процесс завершения синтеза полипептидной цепи и освобождение ее из связи с последней донорной тРНК и с рибосомой. Функцию сигнала, означающего конец трансляции цистрона мРНК, выполняет один из 3 кодонов – УАА, УАГ и УГА. Эти триплеты не кодируют ни одной из 20 аминокислот («стоп-кодоны»). После завершения трансляции происходит отделение от рибосомы не только полипептидной цепи и тРНК, но и мРНК, и диссоциация 70S рибосомы на 50S и 30S субъединицы.

Помимо стоп-кодонов, в этих реакциях принимают участие различные белковые факторы освобождения, а также обе субъединицы рибосомы.

Вновь синтезированная полипептидная цепь отделяется от рибосомы, когда рибосома достигает одного из трех стоп-кодонов. Со стоп-кодоном, поступившим на А-участок, в этом случае связывается не антикодон аа-тРНК, а особый белок – фактор освобождения. В результате его присоединения происходит изменение активности расположенного по соседству фермента пептидилтрансферазы. Измененный фермент присоединяет к пептидил-тРНК не свободную аминогруппу аминокислоты, а молекулу H2O. Это приводит к гидролизу сложноэфирной связи между С-концевым карбоксилом пептидила и 3'-рибозы ЦЦА последней донорной тРНК. В результате гидролиза полипептид, удерживаемый на рибосоме только посредством его связи с молекулой тРНК, отделяется от рибосомы. Это влечет за собой отделение от рибосомы последней донорной тРНК, освобождение мРНК и диссоциацию 70S рибосомы на ее 30S и 50S субъединицы.

Модификация полипептидной цепи

Заключительным этапом биосинтеза белка является модификация полипептидной цепи, вслед за которой белковая молекула приобретает свою окончательную структуру и конформацию, определяющую ее функциональные свойства.

Реакция модификации чаще всего сводится либо к отделению только формильной группы метионина (у бактерий), и тогда N-концевой аминокислотой становится метионин; либо к отделению метионина (у животных) или формила и метионина (у бактерий), и тогда N-концевой становится аминокислота, располагающаяся вслед за метионином (формилметионином). В реакции модификации участвуют специальные ферментные системы – пептиддеформилаза (отделяет формильную группу от формилметионина), аминопептидаза (отщепляет метионин) или другие ферменты.

Реакции модификации осуществляются уже после освобождения полипептидной цепи из рибосомы.

В связи с тем что у бактерий хромосомы и плазмидные ДНК располагаются в цитоплазме и не отграничены от нее никакими мембранами, процессы транскрипции, трансляции и деградации мРНК протекают одновременно, т. е. трансляция мРНК может начинаться раньше, чем завершится транскрипция, а деградация мРНК начинается раньше, чем закончится ее полная трансляция.

Определение скорости биосинтеза белка у бактерий, проведенное с помощью различных методов, показало, что она соответствует включению рибосомой в полипептидную цепь в 1 с при температуре 37 °C 15 – 30 аминокислот.

Это означает, что рибосома продвигается вдоль мРНК со скоростью 45 – 90 нуклеотидов в 1 с. Следовательно, время для выбора каждой очередной аа-тРНК из среды и включения ее в полипептидную цепь, т. е. время полного рабочего цикла рибосомы, составляет около 0,03 – 0,06 с. За этот короткий срок на рибосоме осуществляется серия сложных и взаимообусловленных событий, обеспечивающих высокую точность процесса трансляции. Все это говорит о существовании специфических и надежных систем регуляции биосинтеза белка на уровне не только транскрипции, но и трансляции.

Синтез всех компонентов белоксинтезирующей системы, в том числе рибосом, контролируется соответствующими генами. Существенно, что у бактерий имеется по нескольку копий оперонов рибосомальных РНК, например, у E. coli их шесть. Это позволяет бактериям значительно изменять скорость биосинтеза рРНК, а следовательно и рибосом, в зависимости от условий среды. Поэтому содержание рибосом у них не является постоянным, а может варьировать, например, у E. coli от 10 тыс. до 100 тыс. и более на клетку. Чем богаче среда, тем больше в клетке синтезируется рибосом. Для бактерий характерна следующая фундаментальная закономерность: общая интенсивность биосинтетических процессов (а следовательно, и скорость роста) определяется суммарной скоростью биосинтеза белка, а она, в свою очередь, непосредственно зависит от содержания в клетке рибосом. Поэтому регуляция содержания рибосом является одним из важнейших механизмов, с помощью которых осуществляются адаптация бактерий к изменяющимся условиям среды и эволюционное сохранение видов бактерий в природе.

Таким образом, основными особенностями метаболизма бактерий являются: высокая интенсивность обмена веществ, разнообразие типов метаболизма, способность к саморегуляции активности биосинтетических процессов в зависимости от условий существования. Кроме того, гены бактерий, в отличие от генов вирусов и эукариот, не содержат интронов, поэтому у бактерий отсутствует процесс сплайсинга при синтезе мРНК.

Сплайсинг мРНК (англ. splice – сращивать) – сложный процесс, при котором происходит вырезание интронов (некодирующих последовательностей у генов, имеющих интрон-экзонную структуру) из первичных РНК-транскриптов и сшивание экзонов, в результате которого образуется и затем транслируется зрелая мРНК.

Размер интронов у эукариот варьирует приблизительно от 100 до 10 000 нуклеотидов. Основное отличие интронов от экзонов (кодирующих последовательностей) состоит в том, что большую часть нуклеотидов интрона можно искусственно изменить, не нарушая функции гена.

На каждом из концов интрона находятся короткие нуклеотидные последовательности (почти одинаковые у всех интронов), которые служат сигналами для сплайсинга РНК. Предполагается, что вырезание интронов и сращивание экзонов происходит с участием специфических последовательностей РНК, называемых донорными (5'-конец) и акцепторными (3'-конец) контактами (сайтами) сплайсинга. Процесс выщепления интрона должен происходить с большой точностью, так как ошибка, которая приведет к появлению хотя бы одного неправильного нуклеотида, вызовет изменение рамки считывания и, следовательно, структуры белка или прекращение трансляции из-за образования стоп-сигнала.

Сплайсинг в ядре протекает с участием особых малых ядерных рибонуклеопротеиновых частиц (мяРНП), или частиц U1. Эта частица содержит небольшую молекулу РНК длиной 165 нуклеотидов, в составе которой имеются последовательности, комплементарные нуклеотидным последовательностям пограничных экзон-интронных и интрон-экзонных сайтов молекулы первичного РНК-транскрипта. Благодаря комплементарному спариванию оснований РНК U1 и РНК-транскрипта происходят сближение донорного и акцепторного сайтов, затем их разрывы и воссоединение цепи в области донорного и акцепторного контактов, формирование единой молекулы зрелой РНК и выщепление интронных последовательностей.

Наличие аппарата сплайсинга наделяет эукариотные клетки дополнительной генетической гибкостью, связанной с тем, что сплайсинг одного и того же первичного транскрипта (особенно при наличии в гене нескольких интронов), осуществляемый разными способами, может привести к образованию нескольких молекул мРНК, кодирующих разные белки. Такая неоднозначность сплайсинга присуща и вирусам, например аденовирусам, ретровирусам, вирусу гепатита В и др. Геном аденовируса направляет синтез нескольких очень длинных РНК-транскриптов, каждый из которых содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие целый ряд различных белков. У вируса иммунодефицита человека 9 генов кодируют 15 вирусспецифических белков. Таким образом, благодаря механизму сплайсинга обеспечивается повышение информационной емкости генома без увеличения его размера. Это особенно важно для вирусов, у которых размер генома жестко ограничен величиной вириона.

Глава 7 Особенности энергетического обмена (катаболизма)

Сущность энергетического обмена заключается в обеспечении организма энергией, необходимой для проявления жизни. Как уже было отмечено выше, основным источником энергии служит солнечный свет, его энергию улавливают с помощью фотосинтеза растения и фотосинтезирующие бактерии, преобразуя ее в энергию химических структур – глюкозы и других органических соединений. В последующем энергия этих соединений мобилизуется с помощью реакций окисления-восстановления и консервируется в форме АТФ. Молекулы АТФ синтезируются в результате переноса электрона от его первичного донора до конечного акцептора. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, различают аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов служит молекулярный кислород (О2), а при анаэробном – различные неорганические соединения: NO3, SО42–, SO32–. Таким образом, энергия мобилизуется в реакциях окисления и восстановления. Окисление – отдача электронов, восстановление – присоединение электронов. Когда отнятие пары электронов или атомов водорода от органического субстрата сопряжено с восстановлением кислорода до воды, это сопровождается значительным изменением свободной энергии (ΔG0). Оно примерно равно изменению энергии при сжигании одной молекулы водорода (ΔG0 = – 57,04 ккал). Перенос электронов по цепи позволяет этой энергии выделяться порциями и превращать часть ее в богатые энергией связи АТФ. Чтобы такая цепь переноса действовала, в ней должен существовать градиент способности к окислению. Способность вещества отдавать электрон или присоединять его (т. е. окисляться или восстанавливаться) количественно выражается в виде его окислительно-восстановительного потенциала.

Переносчики электронов в цепи их переноса участвуют в последовательных реакциях с постепенно увеличивающимися значениями ΔE'0 (ΔE'0 – разность между потенциалами двух полуреакций) и увеличением окислительно-восстановительного потенциала.

Принципиальная схема цепи переноса электронов от первичного донора электронов (атома водорода) до конечного его акцептора О2 выглядит так:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Окислительно-восстановительный потенциал указан в вольтах при стандартных условиях (25 °C, рН = 7,0, все реагенты в концентрации 1,0 М). Однако у бактерий встречаются самые разнообразные варианты этой общей схемы. В связи с этим они по типу дыхания подразделяются на следующие четыре группы:

1) строгие аэробы (размножаются только в присутствии кислорода);

2) микроаэрофилы (нуждаются в уменьшенной концентрации свободного кислорода);

3) факультативные анаэробы (могут потреблять глюкозу и размножаться как в аэробных, так и в анаэробных условиях);

4) строгие анаэробы (размножаются только в бескислородных условиях, т. е. не используют О2 в качестве конечного акцептора электронов).

Максимальная мобилизация энергии из глюкозы происходит при ее окислении через цикл лимонной кислоты (цикл Кребса). Один моль глюкозы С6Н12О6 содержит около 690 ккал (такое количество энергии выделяется при сжигании 180 г глюкозы). На первом этапе потребления глюкозы в отсутствие кислорода (при гликолизе) из одной ее молекулы образуются две молекулы молочной кислоты и синтезируются всего две молекулы АТФ. Каждая молекула АТФ имеет одну богатую энергией (10 ккал) пирофосфатную химическую связь. После расщепления глюкозы до молочной кислоты последняя в присутствии кислорода окисляется и превращается в пировиноградную кислоту, которая далее полностью окисляется через цикл Кребса до СО2 и Н2О. Каждая молекула лактата (пирувата) отдает 6 пар электронов. При переносе каждой пары электронов по цепи переноса часть их энергии используется для образования 3 молекул АТФ (рис. 27).

Таким образом, полное окисление одного моля глюкозы сопровождается синтезом 38 молекул АТФ с общим запасом энергии в 380 ккал, или около 55 % всей энергии моля глюкозы (690 ккал); остальная энергия подвергается диссипации, т. е. бесполезному рассеиванию в виде тепла. Однако и такой выход полезной энергии является достаточно высоким. Выход для многих бактерий известен, как и урожай клеток, который составляет около 10 г сухого вещества на 1 моль образовавшегося АТФ. Для объяснения механизма мобилизации энергии, т. е. синтеза АТФ при переносе электронов, предложен ряд гипотез, в том числе химио-осмотическая гипотеза Митчелла. Она исходит из того, что цепь переноса электронов, локализованная в мембране (у бактерий в ЦМ), ориентирована поперек нее, а электроны переносятся последовательно от одного носителя к другому в направлении возрастающего окислительно-восстановительного потенциала. Окисление переносчиков электронов сопровождается одновременным переносом протонов (Н+) с внутренней поверхности мембраны на ее внешнюю поверхность (рис. 28). Поскольку мембрана во всех других случаях непроницаема для протонов, возникает градиент концентрации протонов (рН+) между внутренним и внешним слоями мембраны, и она становится «энергизованной». Энергия градиента протонов используется клеткой для различных процессов, в том числе для активного транспорта питательных веществ, вращения жгутиков и синтеза АТФ. Протоны могут проникать обратно через мембрану лишь в определенных участках ее через особые каналы, с которыми связаны специфические ферменты АТФазы, катализирующие реакцию синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфора (Фн):


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Перемещение протонов по их электрохимическому градиенту с помощью мембранной АТФ-азы служит источником энергии для образования АТФ. Реакция поддерживается градиентом протонов. Однако АТФаза может вызывать и гидролиз АТФ. Это также приведет к перемещению протонов из клетки и созданию их градиента, энергия которого может быть использована для процессов, требующих ее затраты. Некоторые энергообразующие реакции являются общими для аэробных и анаэробных механизмов дыхания. К ним относятся три пути превращения сахаров в основной энергетический метаболит – пировиноградную кислоту: путь Эмбдена – Мейергофа (гликолиз), пентозофосфатный путь (или гексозофосфатный шунт) и путь Энтнера – Дудорова, обнаруженный лишь у некоторых прокариот.

В первом случае (путь Эмбдена – Мейергофа, гликолиз, рис. 29) вначале затрачиваются две молекулы АТФ на образование фруктозо-1,6-дифосфата, который затем расщепляется на фосфоглицериновый альдегид и диоксиацетонофосфат. В результате окисления последних, сопряженного с восстановлением НАД, из каждой образуется по молекуле 1,3-дифосфоглицериновой кислоты. На последующих этапах превращения ее в пировиноградную кислоту происходит так называемое субстратное фосфорилирование, т. е. обе фосфатные группы переносятся на АТФ и, таким образом, на каждую молекулу глюкозы образуются 4 молекулы АТФ. Поскольку две из них затрачиваются на начальных этапах превращения глюкозы, общий выход энергии составляет 2 молекулы АТФ на моль глюкозы.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 27. Цикл Кребса, или цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) (по А. Ленингеру)


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 28. Энергизация мембраны. Объяснение в тексте


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 29. Путь Эмбдена–Мейергофа: превращение глюкозы в пировиноградную кислоту


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 30. Пентозофосфатный путь окисления глюкозы


Пентозофосфатный путь (рис. 30) обеспечивает окисление одного из углеродных атомов глюкозы и не приводит непосредственно к образованию пировиноградной кислоты. Он представляет сложный цикл, при прохождении через который шести молекул происходит полное окисление одной молекулы глюкозо-6-фосфата до СО2 и восстановление шести молекул НАДФ+ в НАДФ • Н. Значение этого пути потребления глюкозы заключается в том, что он обеспечивает образование рибозо5-фосфата, необходимого для синтеза нуклеиновых кислот, и большей части НАДФ • Н, нужного для многих биосинтетических реакций.

В случае превращения глюкозы по пути Энтнера – Дудорова (рис. 31) образуется промежуточный продукт, характерный только для этого пути, – 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовая кислота, которая далее расщепляется на молекулу пировиноградной кислоты и молекулу 3-фосфоглицеринового альдегида. Последний подвергается дальнейшему превращению по пути Эмбдена – Мейергофа в пировиноградную кислоту. В результате из одной молекулы глюкозы образуются две молекулы пировиноградной кислоты, одна молекула АТФ и две молекулы НАДФ • Н.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 31. Путь Энтнера–Дудорова: превращение глюкозы в пировиноградную кислоту и 3-фосфоглицериновый альдегид


Путь Эмбдена – Мейергофа наиболее широко используется различными бактериями при потреблении глюкозы. От образующегося при этом конечного продукта – пировиноградной кислоты, а также от таких промежуточных продуктов, как эритрозо-4-фосфат и рибозо-5-фосфат, идут различные метаболические пути синтеза двадцати аминокислот (рис. 32). Общая схема обмена веществ у микроорганизмов, обладающих аэробным дыханием и потребляющих гексозы, показана на рис. 33. Поскольку в аэробных условиях высвобождается гораздо больше энергии, чем при брожении, некоторые бактерии осуществляют такой тип дыхания, при котором акцептором водорода (электронов) является связанный кислород. Его носители – нитраты (нитратное дыхание) или сульфаты (сульфатное дыхание). При этом за счет водорода окисляемого субстрата нитраты восстанавливаются до молекулярного азота, а сульфаты – до H2S (рис. 34). Способность таких бактерий переносить электроны на нитраты и сульфаты связана с наличием у них цитохромов и системы переноса электронов. Это позволяет им осуществлять достаточно полное окисление субстрата и получать таким путем гораздо больше энергии, чем при брожении.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 32. Пути образования двадцати аминокислот, необходимых для синтеза белков, из промежуточных продуктов обмена (по Г. Шлегелю)


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 33. Схема обмена веществ у микроорганизмов, потребляющих О2 и гексозы (по Г. Шлегелю):

1 – ФДФ-путь; 2 – ПФ-путь; 3 – КДФГ-путь; 4 – ЦТК; 5 – дыхательная цепь; 6 – фосфорилирование на уровне субстрата; 7 – окислительное фосфорилирование в дыхательной цепи; 8 – синтез мономеров; 9 – синтез полимеров


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 34. Аэробные и анаэробные процессы дыхания (по Г. Шлегелю)


Строгие анаэробы

Главная особенность строгих анаэробов заключается в том, что их энергетический обмен происходит без участия свободного кислорода. Синтез АТФ при потреблении глюкозы в анаэробных условиях (гликолиз) происходит за счет фосфорилирования субстрата. Из одной молекулы глюкозы в этих условиях образуются две молекулы молочной кислоты, а выход энергии составляет всего 20 ккал (синтезируются две молекулы АТФ) на моль глюкозы, т. е. во много раз меньше, чем при полном окислении этого основного носителя энергии. Хотя анаэробы также мобилизуют энергию в результате окислительно-восстановительных процессов, т. е. в результате переноса водорода (электронов), но кислород для них не служит конечным акцептором электронов. Более того, молекулярный кислород оказывает на них токсическое действие, причины которого следующие:

1) у анаэробных бактерий кислород угнетает анаэробные энергообразующие реакции (эффект Пастера);

2) у строгих анаэробов отсутствует фермент каталаза, поэтому накапливающаяся в присутствии кислорода Н2О2 оказывает на них бактерицидное действие;

3) у строгих анаэробов отсутствует система регуляции окислительно-восстановительного потенциала (редокс-потенциала) – rH2. Окислительно-восстановительный потенциал представляет собой показатель окислительно-восстановительного равновесия всех компонентов системы, находящейся в равновесии с электродами; rH2 – отрицательный логарифм гипотетического давления водорода, когда данная окислительно-восстановительная система находится в состоянии равновесия:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

где Ehk – найденный потенциал среды; 250 mv – разница потенциалов между каломельным и нормальным водородным электродом (считается, что каломельный электрод при температуре 20 °C на 250 mv положительнее водородного).

Показатель rH2 может варьировать от минимума – 0 (среда насыщена водородом) до максимума 41 (среда насыщена кислородом); при rH2 = 28 оба процесса находятся в динамическом равновесии.

Направление и напряженность окислительно-восстановительных реакций, протекающих в бактериальной клетке, зависят от состава среды. Eh нормальной питательной среды, находящейся в контакте с воздухом, равен 0,2 – 0,4 В при рН = 7,0. Eh культуры бактерий определяется в результате конкуренции скоростей двух процессов – скорости образования восстановленных веществ и скорости образования компонентов, окисленных кислородом. Присутствие в среде окисляющих веществ повышает rH2, а наличие веществ, обладающих восстановительными свойствами (аскорбиновая кислота, цистеин и др.), снижает его. Существуют определенные границы rH2 и рН среды, внутри которых клетки способны осуществлять метаболические реакции с определенной скоростью.

Строгие аэробы, факультативные анаэробы и микроаэрофилы обладают системами, которые позволяют им при высоком содержании О2 снижать уровень rH2 до показателей, при которых они могут эффективно размножаться. Установлено, что у таких бактерий размножение совпадает с быстрым падением окислительно-восстановительного потенциала. Существуют предельные значения rH2 для роста бактерий и, в частности, анаэробов. Обычно рост их угнетается, если начальная Eh среды выше –0,2 В. Строгие анаэробы, у которых отсутствуют системы регуляции rH2, в присутствии О2 расти не могут. Зависимость их роста от уровня rH2 подтверждается тем, что если с помощью восстанавливающих веществ снизить уровень rH2, строгие анаэробы начинают расти и в присутствии кислорода. Строгий анаэроб Clostridium perfringens хорошо растет на аэрируемой среде, если Eh ее снижен аскорбиновой кислотой до –0,125 В.

По-видимому, у разных видов строгих анаэробов чувствительность к молекулярному кислороду опосредуется разными факторами. В связи с высокой чувствительностью строгих анаэробов к молекулярному кислороду для их культивирования с помощью различных способов создаются бескислородные условия. С этой целью используются механические, физические, химические и биологические способы удаления кислорода: посевы в глубокие столбики агара; кипячение (регенерация) жидкой питательной среды (Китта – Тароцци), содержащей глюкозу и кусочки печени (для связывания растворенного кислорода), и заливка ее стерильным вазелиновым маслом; добавление в атмосферу роста химических веществ, поглощающих кислород (например, щелочного пирогаллола); совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов на кровяном агаре с глюкозой в запарафинированной чашке Петри (вначале растут строгие аэробы, а после снижения содержания кислорода – анаэробы) – способ Фортнера – и т. п. Наилучшим методом является применение специальных анаэростатов, из которых воздух откачивается и (или) замещается каким-либо инертным газом или смесью азота и углекислого газа.

Глава 8

Механизмы саморегуляции

Для своего роста (увеличения биомассы) и размножения бактериальная клетка должна получать из окружающей среды, как минимум, источники углерода, энергии и различные химические элементы. Источником углерода и энергии могут быть одна и та же молекула (чаще всего глюкоза) или же различные молекулы, например СО2 как источник углерода, а NH3 – источник энергии. Клетки, у которых отсутствуют какие-либо биосинтетические процессы, должны получать их конечные продукты, т. е. «факторы роста», из внешней среды. Если же клетка может получать некоторые конечные продукты извне, она будет их использовать преимущественно, «выключив» их эндогенный синтез. Для осуществления реакций окисления среда должна обеспечить клетку конечным акцептором водорода (электронов): для аэробов им является О2, а для анаэробов им могут быть или органические вещества, или органические субпродукты расщепления углеводов, или неорганические соединения (NO3, SО42– и т. п.). Например, многие бактерии растут за счет расщепления глюкозы как источника углерода, энергии и акцептора водорода. Благодаря обмену источников углерода бактерии синтезируют промежуточные продукты, необходимые для образования основных биополимеров. Окисление источников энергии приводит к накоплению АТФ, что позволяет бактериям обеспечивать себя энергией, необходимой для биосинтеза субъединиц биополимеров и их активации. Активированные субъединицы полимеризуются и образуют макромолекулы, которые саморегулируются, формируя субклеточные и клеточные структуры. В результате биомасса клетки удваивается за определенный срок (клеточный цикл), и она размножается путем бинарного деления. В одно и то же время в бактериальной клетке совершается огромное количество биохимических процессов, завершающихся, в конечном счете, увеличением ее биомассы. Это предполагает наличие у нее совершенных механизмов саморегуляции, чутко реагирующих на все изменения условий ее жизни. В настоящее время представляется возможным условно разделить эти механизмы на две основные группы: а) группа неспецифических механизмов регуляции роста и размножения; б) группа специфических механизмов саморегуляции.

К неспецифическим механизмам относится совокупность действия различных физико-химических факторов, регулирующих общую скорость всех основных процессов жизнедеятельности. К ним относятся: температура, рН, rH2, концентрация ионов, степень обеспечения среды кислородом, давление и др. Неспецифический характер этой формы регуляции заключается в том, что она влияет прежде всего на общую кинетику биосинтетических процессов. Обеспечивая оптимальное соотношение всех указанных факторов, можно получить максимальную скорость размножения бактерий и максимальный выход биомассы в соответствующих производствах. Однако действие физико-химических факторов опосредуется через специфические механизмы клеточной саморегуляции. Она носит многоступенчатый характер и отличается выраженной универсальностью, вытекающей из того, что специфическая саморегуляция связана прежде всего с ферментами, катализирующими биохимические реакции, а все ферменты имеют одинаковую химическую природу. Взаимодействие на уровне фермент – субстрат является важнейшим пусковым моментом всей клеточной системы саморегуляции. Именно на этом уровне происходит интеграция неспецифических и специфических механизмов саморегуляции клетки. Специфичность взаимодействия фермента с субстратом детерминирована генетически – она обусловлена последовательностью расположения аминокислот в белковой молекуле и определяемой ею вторичной, третичной и четвертичной структурой молекулы фермента. В связи с этим никаких дополнительных механизмов регуляции на уровне фермент – субстрат не требуется. Синтезированный фермент готов в любой момент, если не изменена его аллостерическая структура, вступить в реакцию с соответствующим субстратом. Как известно, скорость ферментативной реакции можно выразить уравнением:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

где E0 – начальная концентрация фермента; S – концентрация субстрата.

При увеличении концентрации [S], когда [S] > Km, скорость ферментативной реакции (V) будет стремиться к некоторой постоянной величине Vмакс– максимальной скорости реакции:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Поэтому зависимость между скоростью ферментативной реакции и концентрацией субстрата можно выразить следующим уравнением Михаэлиса – Ментен:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Из уравнения следует, что при малых величинах концентрации субстрата скорость реакции будет находиться в линейной зависимости от [S], а при очень высокой концентрации субстрата скорость реакции (V) будет стремиться к максимальной (Vмакс) и мало зависит от дальнейшего увеличения концентрации [S]. В свою очередь, при условии, когда [S] > (E), скорость реакции будет пропорциональна концентрации фермента. Основными кинетическими константами уравнения Михаэлиса являются максимальная скорость реакции (Vмакс) и константа Михаэлиса (Km). Величина последней определяется соотношением трех констант скорости. В случае, когда K+2 < K– 1, Km ≈ K– 1/K+1 = Ks.

Константа Ks получила название константы субстрата и служит мерой сродства фермента к субстрату. Поскольку скорость реакции, катализируемой ферментом, зависит от относительного сродства фермента к субстрату, константа (Ks) является важной характеристикой фермента. Поэтому уравнение Михаэлиса – Ментен может быть выражено следующим образом:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

где Vмакс – предел, к которому стремится скорость реакции с повышением концентрации субстрата; Ks – константа, численно равная концентрации субстрата при V=Ммакс/2.

Колебание температурного режима оказывает на ферментативные реакции влияние таким же образом, как и на другие химические реакции. Отношение констант реакций при более высокой (Т2) и более низкой (Т1) температурах получило название температурного коэффициента: Q = K2/K1. Значение его обычно дается для интервала в 10 °C (Q10). Величину Q10 легко вычислить для любого температурного интервала ΔT по формуле:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Скорость ферментативных реакций зависит также от концентрации водородных ионов. Величина оптимальной рН и ее границы варьируют в зависимости от типа и свойств ферментов. Даже изоферменты, имеющие одинаковую субстратную специфичность, могут различаться по оптимуму рН.

Отличаясь высокой специфичностью действия, ферменты, вместе с тем, обладают многими общими свойствами, вытекающими из их белковой природы. Благодаря последним создаются условия, которые позволяют использовать опять-таки универсальные механизмы для контроля активности ферментов.

В частности, существует специфический механизм саморегуляции скоростей отдельных биохимических реакций, вытекающий из аллостерической природы белков-ферментов: конечный продукт реакции (в случае накопления некоторого избытка его), взаимодействуя с молекулой фермента, так изменяет ее конформацию, что она временно утрачивает свою активность. Этот принцип саморегуляции, получивший название регуляции по типу отрицательной обратной связи, или торможения конечным продуктом, носит универсальный характер. С его помощью создаются идеальные условия для саморегуляции, так как он не требует никакой дополнительной затраты энергии и вещества. Запуск реакций, ведущих к превращению субстрата, осуществляется самим субстратом, а их остановка – конечным продуктом. Как только содержание конечного продукта достигает определенного уровня, дальнейший синтез его прекращается. Конечный продукт выступает в роли регулятора собственного синтеза. Так осуществляется саморегуляция многих биохимических процессов и, как следствие, координация их, так как многие из них взаимозависимы по участвующим в реакциях различным продуктам. Помимо этого уровня саморегуляции, определяющего кинетику единичных ферментативных реакций, а также общую скорость и координацию большинства биохимических процессов, существует высшая форма клеточной саморегуляции, осуществляемая на генетическом уровне. В соответствии с химическими сигналами, поступающими как из внешней среды, так и эндогенным путем, клетка автоматически запускает (индуцирует) или подавляет (репрессирует) синтез соответствующих ферментов. Нетрудно видеть, что, хотя эффекты индукции и репрессии противоположны по своим проявлениям, они представляют собой две стороны одного и того же процесса, а именно – регуляции образования ферментов. Благодаря механизмам индукции и репрессии, осуществляемым с помощью соответствующих генов (регуляторов, операторов, промоторов, аттенуаторов и т. п.) и белков (репрессоров, активаторов, апорепрессоров и т. п.), клетка, в соответствии с химическими сигналами, осуществляет автоматический контроль биосинтеза необходимых ей в данное время ферментов.

Одним из проявлений регуляции синтеза ферментов на уровне генома служит так называемая постоянная или временная катаболитная репрессия. Суть ее состоит в том, что некоторые источники углерода, принимающие участие в энергетическом обмене, например глюкоза, способны подавлять биосинтез определенных ферментов. Существует предположение, что синтез биосинтетических ферментов контролируется по механизму отрицательной обратной связи – репрессией конечным продуктом, а биосинтез ферментов, участвующих в катаболизме, контролируется механизмом индукции и катаболитной репрессии.

Бактерии, как и все живые организмы, не могут существовать в природе, не получая информации из внешней среды и от себе подобных. Обмен информацией (коммуникацию) они осуществляют разными способами, например путем непосредственого контакта при конъюгации (с помощью донорных ворсинок), при формировании колоний и при других процессах. Особое значение имеет способность бактерий вступать в контакт с клетками организма человека и животных. Распознавание клеток и присоединение к ним – важнейший начальный этап реализации бактериями патогенных свойств. Другой важной формой межклеточной коммуникации служат УФ (митогенетическое излучение), электромагнитные волны светового и инфракрасного диапазонов. Дистантное взаимодействие существенно важно в регуляции переходных процессов или в стрессовых ситуациях, когда клетке надо «решить», как вести себя в необычных условиях. Важную информацию бактерии получают через посредство физико-химических факторов внешней среды (температура, pH среды и т. п.), а также специальных химических сигналов. Установлено, что бактерии синтезируют и выделяют во внешнюю среду много биологически активных соединений, которые координируют их коллективное поведение, физиологическое состояние и т. п.

У бактерий обнаружены различные системы, способные воспринимать из внешней среды физические и химические сигналы. У многих патогенных бактерий (E. coli, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и др.) обнаружены термоиндуцибельные системы, контролирующие синтез факторов патогенности. Например, у E. coli при температуре 18 – 20 °C практически не происходит синтеза факторов адгезии (пилей). Повышение температуры до 37 °C индуцирует их образование. Такой же температурозависимый контроль синтеза факторов патогенности обнаружен у возбудителей чумы (Y. pestis), дизентерии (Shigella flexneri) и других заболеваний. Целесообразность действия этих систем очевидна: факторы патогенности необходимы бактериям для обеспечения их существования в организме человека или животных, т. е. при температуре 37 °C. В иных условиях эти системы бактериям не нужны. Другим примером того, как бактерии реагируют на физические сигналы, является феномен «теплового шока», описанный еще в 1952 г. Ф. Ритоссой. Он лучше всего изучен у E. coli. Суть его заключается в том, что нагревание среды до 42 °C активизирует работу ряда генов, вследствие чего в 5 – 20 раз увеличивается синтез почти 20 белков, играющих ключевую роль в жизни клеток. Главную роль в системе теплового шока играет ген (позитивный регулятор) htpR (англ. – heat temperature protein regulator), картированный на 76-й минуте хромосомной карты E. coli. Он является представителем особой группы генов, продукты которых необходимы для роста только при температуре выше 35 °C. Продукт гена htpR – σ-белок, который играет роль σ-субъединицы РНК-полимеразы. Последняя и определяет выбор промоторов тех генов, которые входят в систему теплового шока.

Интересно, что генетический контроль споруляции также реализуется через изменение σ-субъединицы РНК-полимеразы. Фактором, запускающим споруляцию у B. subtilis, служит аденозин-бис-трифосфат р3Ар3. Его синтез осуществляет фермент аденозин-бис-трифосфат-синтетаза. В нормальных условиях синтез этого фермента репрессирован. Когда же клетка получает соответствующий химический сигнал из внешней среды (например, об истощении источника энергии), репрессия синтеза фермента снимается, накапливается р3Ар3, и это каким-то образом приводит к замене σ-субъединицы РНК-полимеразы. В результате этого последняя начинает распознавать промоторы генов, продукты которых и обусловливают спорообразование.

Помимо системы теплового шока у бактерий обнаружена система и «холодового шока»: снижение температуры роста с 37 до 10 °C у E. coli вызывает увеличение в 3 – 300 раз синтеза 13 белков, изменяющих ход ее биосинтетических процессов в новых условиях роста. Обе эти системы связаны друг с другом и с другими системами, в том числе с системой, регулирующей клеточное деление, и через RecA белок с жизненно важной системой генов – SOS-системой (см. часть 2 «Генетика бактерий»).

Восприятие химических сигналов бактериями осуществляется с помощью так называемых сенсорно-регуляторных систем. Простейшая схема их такова (рис. 35). Вначале сигнал воспринимается рецептором клеточной мембраны и передается мембранным ферментам. Затем образуется вторичный посредник (мессенджер – англ. messenger – посыльный), который через системы киназ и фосфатаз взаимодействует с эффекторным аппаратом клетки, в том числе с ее генами. Этот процесс передачи сигнала обычно включает в себя обратимую посттрансляционную модификацию белков посредством их фосфорилирования. В простейшем случае сенсорно-регуляторная система состоит из белка-рецептора (сенсора), который располагается, как правило, но не всегда, в мембране, и белка-регулятора, локализованного в цитоплазме. Примером такой системы является система осмотической регуляции у E. coli: ее сенсором является белок EnvZ, а регулятором – белок OmpR (система EnvZ/OmpR). Белок EnvZ получает информацию из периплазмы, в которой располагается его N-концевой домен. С-концевой домен располагается в цитоплазме и обладает ауто– и протеинкиназной активностью. В присутствии АТФ С-домен аутофосфорилируется, а затем передает фосфорильную группу белку-регулятору – OmpR. В свою очередь белок OmpR контролирует работу двух генов – оmpC и оmpF, кодирующих синтез белков-поринов наружной мембраны – OmpC и OmpF. Белок OmpF имеет больший диаметр пор, чем белок OmpC. Регулятор ответа – белок OmpR – также состоит из двух доменов: N-концевой домен фосфорилируется белком-сенсором, а С-концевой домен взаимодействует с промоторами генов ompC и ompF с различной активностью в зависимости от того, фосфорилирован ли этот белок (OmpR). Таким образом, от активности транскрипции генов ompC и ompF будет зависеть соотношение белков-поринов OmpC и OmpF в наружной мембране, а следовательно, и степень проницаемости мембраны для воды и низкомолекулярных гидрофильных соединений. По такому же принципу устроены и работают и другие сенсорно-регуляторные системы. С-концевые домены разных сенсорных белков имеют сходное строение, а N-концевые домены регуляторных белков также оказались гомологичными. Поэтому механизмы взаимодействия между белками-сенсорами и соответствующими им белками-регуляторами, вероятно, одинаковы. У бактерий уже обнаружено около 30 таких сенсорно-регуляторных систем, воспринимающих различные химические сигналы и обеспечивающих на них адекватный ответ. Специфичность их зависит от передачи сигнала на соответствующий эффекторный аппарат (на гены). Функции, выполняемые регуляторами ответа, – получение сигнала от сенсора, взаимодействие с промоторами соответствующих генов и активация их транскрипции – разделены между доменами белка-регулятора. Сходство в механизме функционирования этих систем указывает на то, что их функции также должны быть скоординированы.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 35. Этапы внутриклеточной передачи сигналов (по Д. Эриксону. В мире науки. 1993, вып. 1):

1 – связывание внеклеточного сигнального агента; 2 – клеточный рецептор; 3 – белок-передатчик; 4 – мембранный фермент; 5 – вторичный мессенджер; 6 – киназы и фосфатазы


Важнейшим механизмом восприятия информации из внешней среды служит изменение топологического состояния ДНК, степени ее суперспирализации, от которой зависит работа генов бактерий, в том числе систем теплового и холодового шока. В отличие от сенсорных систем этот механизм реагирует не на специальные химические сигналы, а на разнообразные изменения физико-химического состояния внешней среды и поэтому выполняет роль общего регулятора экспрессии генов.

Таким образом, при большом количестве взаимодействующих систем для их согласованности, т. е. для саморегуляции жизненных процессов клетки, решающее значение имеет соблюдение трех основных условий: во-первых, согласованность скоростей реакций; во-вторых, строгое регулирование последовательностей их включения; в-третьих, регулирование количественного и качественного состава самих ферментов в строгом соответствии с сигналами, поступающими из окружающей среды. Приспособляемость, если под ней понимать корреляцию между степенью физиологической активности клетки и условиями среды, возникает как неизбежное следствие установления взаимосвязи между динамическими системами клетки. Внешние условия – наличие необходимых субстратов, температуры, рН, rН2 и других факторов – индуцируют одни системы и лимитируют активность других систем. Целесообразность поведения живой системы складывается из совокупности согласованно протекающих в ней саморегулируемых и взаимосвязанных реакций, т. е. она обусловлена самой организацией живой системы. Конечным результатом регуляции протекающих в клетке биосинтетических и катаболических процессов является произведение потомства, а показателем сбалансированности функционирующих систем служит скорость роста бактерий.

Рост и размножение бактерий

Различают рост индивидуальных клеток и рост популяции. Каждый из них характеризуется своими особенностями и закономерностями. Под ростом индивидуальной клетки понимают увеличение ее биомассы, наступающее в результате синтеза клеточного материала. Объем клетки можно вычислить, если известны ее продольные и поперечные размеры. Для шаровидных клеток он определяется по формуле:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

а для цилиндрических


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

где r – радиус клетки; a – длина клетки.

Рост палочек происходит в длину, поэтому удельная поверхность (отношение поверхности к объему) остается примерно постоянной, и скорость роста в определенных условиях может быть постоянной.

У сферических клеток рост происходит во всех направлениях, поэтому удельная поверхность непрерывно уменьшается с ростом клетки, вследствие чего скорость роста у кокков постепенно замедляется. Удлинение клеток происходит благодаря удлинению клеточной стенки за счет включения в различные ее слои новообразованных структурных единиц. У стрептококков включение их происходит в области «экватора» клеточной стенки. У некоторых грамотрицательных бактерий этот процесс происходит без четкой локализации, т. е. в различных участках клеточной стенки. У E. coli рост наружной мембраны происходит исключительно в области ее полюсов, а рост пептидогликанового слоя – за счет включения новыхединиц в различных его участках. В условиях скоординированного роста деление клетки происходит, когда она удваивает свою биомассу, строго посередине. Процесс деления клетки сопряжен с процессом сегрегации (распределения) дочерних хромосом и дочерних плазмид в дочерние клетки. У бактерий обнаружены белкигомологи белков ParA и ParB (они осуществляют равномерное распределение плазмид между дочерними клетками) и белок MucB. Вместе с белками мембраны они образуют комплекс, растаскивающий хромосомы в дочерние клетки перед образованием межклеточной перегородки. Связь между вегетативной репликацией хромосомы и клеточным делением включает три следующих последовательных события:

1) подготовку к инициации репликации;

2) цикл репликации хромосомы (и плазмиды);

3) интервал времени между завершением репликации хромосомы и клеточным делением. Клеточный цикл бактерий можно выразить следующей формулой:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

где T – время удвоения; С – время цикла репликации; D – время между завершением цикла репликации и клеточным делением.

При благоприятных условиях роста Т для E. coli и многих других бактерий составляет около 30 мин. Деление бактериальной клетки находится также под строгим генетическим контролем, нарушение которого приводит и к нарушению механизма клеточного деления.

Деление бактерий наступает в результате формирования межклеточной перегородки, которое происходит следующим образом. В том участке ЦМ, с которым связана с помощью особого рецептора молекула ДНК (хромосома, плазмида), происходят события, инициирующие процесс репликации, в результате которого вновь образующаяся дочерняя молекула ДНК прикрепляется также к рецептору на ЦМ. Область последней между двумя рецепторами, к одному из которых прикреплена родительская, а к другому – дочерняя ДНК, начинает удлиняться, в результате этого расстояние между ними все время увеличивается в течение времени С (рис. 36). По завершении процесса репликации строго по экватору между отделившимися друг от друга хромосомами начинает формироваться межклеточная перегородка путем встречной инвагинации (врастания навстречу друг к другу) ЦМ и связанной с ней области клеточной стенки (рис. 37).


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 36. Модель К. Ларка, объясняющая механизм регулирования равномерности распределения хромосом (и плазмид) между дочерними клетками

Одна из нитей хромосомы прикреплена к особому рецептору мембраны (1). После инициации репликации вторая нить также разрывается (2) и прикрепляется к соседнему рецептору мембраны (3). Рост (удлинение) мембраны постепенно отделяет хромосомы друг от друга. Когда клетка удвоит свою длину, точно по ее экватору между дочерними хромосомами формируется межклеточная перегородка, и клетка делится


В результате слияния инвагинирующих участков ЦМ и КС образуется межклеточная перегородка, и родительская клетка разделяется на две дочерние клетки равной длины. Функцию аппарата митоза у бактерий выполняет ЦМ путем своего удлинения, которое раздвигает хромосомы (и плазмиды) таким образом, что они оказываются по ту и другую стороны формирующейся межклеточной перегородки в равных соотношениях.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 37. Модель участия ЦМ в регуляции репликации и равномерности распределения хромосом и плазмид между дочерними клетками


Результатов нарушения генетического контроля клеточного деления может быть по крайней мере два. Если формирования межклеточной перегородки не происходит, возникают длинные нитевидные формы. Однако при восстановлении нарушенного механизма такого контроля нити делятся на фрагменты, равные по длине нормальным клеткам. В некоторых случаях нарушение контрольных механизмов приводит к тому, что вместо одной межклеточной перегородки, формирующейся по экватору, происходит образование одной или двух перегородок, каждая из которых локализована ближе к своему полюсу. Поскольку в этом случае формирование перегородки не связано с сегрегацией хромосом, образуются так называемые мини-клетки, лишенные хромосом, которые остаются в родительской клетке. Мини-клетки могут осуществлять различные биохимические процессы, поскольку они содержат ферменты, но они не способны к размножению, так как лишены хромосом.

Помимо мини-клеток вследствие различных неблагоприятных воздействий из бактерий могут образовываться так называемые нанно-клетки, т. е. мельчайшие клетки размером 0,2 – 0,3 мкм. Их описывали под различными названиями: фильтрующиеся формы бактерий, элементарные тельца, ультрамикробактерии. Чаще всего они образуются при L-трансформации бактерий. Поскольку размеры таких клеток удобнее выражать в нанометрах, а не в долях микрометра, их стали называть нанно-клетками. Образование нанно-клеток – универсальная ответная реакция бактерий на неблагоприятные условия существования.

Питательные среды

Для выращивания бактерий применяют различные питательные среды. Они могут быть жидкими, твердыми (лучше называть их плотными) или полужидкими. Жидкие среды готовят на основе водных растворов каких-либо веществ, чаще всего мясной воды, различных гидролизатов, иногда жидких естественных продуктов (молока, крови и др.). Для получения плотных сред к ним добавляют или агар, или желатин, или силикагель в соответствующих концентрациях. Агар представляет собой полисахарид сложного состава, получаемый из морских водорослей. Он имеет плотную волокнистую структуру. Агар плавится при температуре 100 °C, но при охлаждении сохраняет жидкую консистенцию до 45 °C. Для получения плотных сред его добавляют в концентрации 1,5 – 3,0 %. Полужидкие среды имеют вязкую консистенцию благодаря добавлению к ним небольшого количества агара (0,3 – 0,7 %). По происхождению среды делят на естественные (кровяные, молочные, картофельные, яичные) и искусственные, получившие особенно широкое распространение. Они представляют собой искусственные сбалансированные смеси питательных веществ в концентрациях и сочетаниях, необходимых для роста и размножения микроорганизмов. В них в качестве универсального источника азота и углерода для патогенных бактерий применяют пептоны – продукты неполного расщепления белков с помощью ферментов (пепсина), различные гидролизаты (рыбный, казеиновый, дрожжевой и т. п.). Питательные среды обязательно отвечают трем основным требованиям:

1) они должны содержать в достаточном количестве все необходимые питательные вещества (источники энергии, углерода, азота), соли и ростовые факторы;

2) должны иметь оптимальную для роста данного вида бактерий рН;

3) должны иметь достаточную влажность (при их усыхании повышается концентрация питательных веществ, особенно солей, до уровней, тормозящих рост бактерий). Кроме того, питательные среды для лучшего определения культуральных свойств бактерий должны быть по возможности прозрачными. Наконец, они должны быть стерильными, не содержать посторонней микрофлоры. По назначению питательные среды подразделяют на следующие основные категории.

Универсальные – среды, на которых хорошо растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий. К ним относятся: мясо-пептонный бульон (МПБ = = мясная вода + 1 % пептона + 0,5 % NaCl), мясо-пептонный агар (МПА = МПБ + + 2 – 3 % агара).

Дифференциально-диагностические – среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям. К ним относятся среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса и многие др.

Селективные (син.: избирательные, элективные, обогатительные) – среды, содержащие вещества, используемые микроорганизмами определенных видов и не благоприятствующие или даже препятствующие росту других микроорганизмов. Селективные среды позволяют направленно отбирать из исследуемого материала определенные виды бактерий. Сюда относятся среды Мюллера, селенитовая, Рапопорт, 1 %-ная пептонная вода и др.

Дифференциально-селективные – среды, сочетающие в себе свойства дифференциально-диагностических и селективных сред. Они используются, в частности, для ускорения обнаружения и идентификации бактерий, относящихся к большому числу широко распространенных видов энтеробактерий и псевдомонад (среды Сиволодского).

Специальные – среды, специально приготовленные для получения роста тех бактерий, которые не растут или очень плохо растут на универсальных средах. К ним относятся среды Мак-Коя – Чепина (для получения роста возбудителя туляремии), кровяной МПА (для получения роста патогенных стрептококков), среда Левенштейна – Иенсена (для выделения возбудителя туберкулеза) и др.

Синтетические – среды строго определенного химического состава, представляющие собой растворы неорганических солей с добавлением химических соединений, которые служат источником углерода или азота. Примером такой синтетической среды является минимальная среда М-9, в которой источником энергии и углерода является глюкоза, а азота – NH4Cl. Синтетические среды могут быть и более сложного состава с включением различных аминокислот, оснований и витаминов.

Полусинтетические – синтетические среды, к которым добавляют какой-либо продукт природного происхождения, например сыворотку крови. Существует много различных вариантов питательных сред, сконструированных с учетом потребностей соответствующих видов бактерий и диагностических целей.

Способы культивирования

Для выращивания бактерий используют следующие способы их культивирования: стационарный, глубинный с аэрацией и с использованием проточных питательных сред.

Стационарный способ: питательные среды сохраняются постоянными, с ними никаких дополнительных манипуляций не производят. Однако при таком способе культивирования в жидких питательных средах, где преобладают анаэробные энергетические процессы, выход биомассы незначителен. Поэтому в связи с развитием микробиологической промышленности были разработаны принципиально новые способы культивирования, позволяющие получать гораздо больший выход биомассы или биологически активных соединений. К их числу относятся метод глубинного культивирования с аэрацией и метод использования проточных сред.

Метод глубинного культивирования с аэрацией. Для выращивания с помощью этого способа применяют специальные устройства – реакторы. Они представляют собой герметические котлы (приспособленные автоклавы), в которые заливается жидкая питательная среда. Реакторы снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальные рН иrН, дозированное поступление необходимых дополнительных питательных вещест2в. Однако главная особенность таких реакторов в том, что они постоянно продуваются стерильным воздухом и в них установлены мешалки, с помощью которых среда постоянно перемешивается. Поэтому во всей питательной среде создается такая концентрация свободного кислорода, при которой энергетические процессы происходят в аэробных условиях, т. е. достигается максимальное использование энергии, заключенной в глюкозе, а следовательно, и максимальный выход биомассы. Для примера: выход биомассы при стационарном методе культивирования E. coli в МПБ через 18 – 20 ч составляет 1 – 2 млрд клеток на 1 мл среды, а при глубинном методе через 12 – 14 ч – 50 – 60 млрд клеток/мл среды.

Использование проточных питательных сред позволяет создать условия, при которых клетки имеют возможность длительное время находиться в определенной фазе роста (экспоненциальной) при постоянной концентрации питательных веществ и в одних и тех же условиях, обеспечивающих непрерывный рост культуры. Методы получения непрерывных культур основаны на том, что в аппарат, где растут клетки, непрерывно добавляют свежую питательную среду и одновременно из него удаляют соответствующее количество бактерий.

Различают два типа таких аппаратов: хемостаты и турбидостаты. Хемостат – аппарат, в который постоянно из особого резервуара добавляется свежая питательная среда. Благодаря механическому перемешиванию и аэрации среды в ней создаются оптимальные условия для снабжения бактерий кислородом и вновь добавляемыми питательными веществами, по мере поступления которых часть популяции бактерий из аппарата удаляется.

Принцип работы турбидостата основан на поддержании постоянной плотности (мутности) бактериальной популяции в аппарате. Степень мутности контролируется с помощью фотоэлементов, которые через систему реле регулируют поступление питательных веществ в аппарат. Все питательные вещества в ней содержатся в избытке, и скорость роста приближается к максимальной. В таких аппаратах непрерывного культивирования микроорганизмов (АНКМ) все необходимые параметры для роста соответствующего вида микроорганизма задаются и поддерживаются с помощью специальных автоматических приборов. Благодаря сохранению неизменных условий среды непрерывная культура постоянно находится в наиболее желательной фазе роста, при которой обеспечивается максимальный выход биологически важных соединений (антибиотики, витамины, аминокислоты и т. п.) либо биомассы. Таким образом, в соответствии со способами культивирования различают периодические (при стационарном и глубинном методах культивирования) и непрерывные (при проточном способе) культуры микроорганизмов. Кроме того, при определенных условиях получают синхронные культуры, т. е. культуры, в которых все клетки одновременно (синхронно) делятся. Однако такая синхронность сохраняется, как правило, в течение 2 – 3 циклов деления, а затем она нарушается. Синхронные культуры используют в основном для изучения тех или иных стадий клеточного цикла бактерий и роли отдельных генов (и их продуктов) в их осуществлении.

Особенности роста популяции бактерий

Кинетика роста бактериальной популяции не устанавливается кинетикой роста индивидуальной клетки, хотя между ними, несомненно, существует взаимосвязь. Скорость увеличения объема индивидуальной клетки можно рассматривать как функцию времени, которое позволяет объему клетки удвоиться к концу периода между делениями. Между скоростью роста и размером клеток существуют определенные математические отношения.

Для количественной характеристики ростовых процессов в микробной популяции пользуются двумя показателями: абсолютной (валовой) скоростью и относительной (удельной) скоростью роста. Среднюю валовую скорость роста (Vср) за отрезок времени (t1 – t0) можно определить по абсолютному приросту биомассы по формуле:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

где m0 – величина биомассы в начале исследуемого отрезка времени; m1 – величина биомассы в конце исследуемого отрезка времени.

Под удельной скоростью роста (μ) понимают часовой прирост, пересчитанный на единицу растущей массы:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Скорость размножения бактерий ν (число удвоений за единицу времени) описывают уравнением:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

где n – число поколений.

Продолжительность жизни одного поколения (время генерации) g в среднем составляет:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

В результате логарифмирования приведенных формул и их сопоставления установлена связь удельной скорости роста с продолжительностью времени генерации и скоростью размножения клеток:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Как видно из последних формул, между временем генерации (продолжительностью жизни одного поколения) g и удельной скоростью роста μ существует обратно пропорциональная зависимость. Скорость роста микробной популяции не является величиной неизменной. В развитии микробной популяции различают следующие последовательные стадии (рис. 38): лаг-фаза; фаза положительного ускорения; фаза логарифмического роста; фаза отрицательного ускорения; стационарная фаза; фаза ускоренной гибели; фаза логарифмической гибели и фаза уменьшения скорости отмирания. Они отражают сложные процессы адаптации бактерий, привнесенных из одной среды обитания в другую, как правило, оптимальную для их размножения. Природа лаг-фазы во многом связана с тем, что в этот период происходит активный синтез всех компонентов белоксинтезирующей системы и прежде всего такого количества рибосом, которое позволило бы обеспечить максимальную активность всех биосинтетических процессов. Последующие стадии развития периодических культур отражают высокую скорость размножения бактерий. Затем, в силу постепенного истощения источника энергии и других жизненно важных метаболитов, скорость размножения бактерий уменьшается, и в стационарной фазе наступает период некоторого равновесия – количество вновь образующихся клеток становится сопоставимым с числом погибающих клеток. Вслед за этим наступает стадия, характеризующаяся постепенным уменьшением количества жизнеспособных бактерий. Это является следствием ряда причин – истощения источников энергии и других жизненно важных метаболитов, невозможности эффективно регулировать рН и rH2 среды, накопления продуктов метаболизма, тормозящих рост, и, возможно, каких-то других факторов. Очевидно, что популяция бактерий – это тоже саморегулирующаяся система, очень зависящая от среды, истощение которой оказывает на нее отрицательное действие. Жизнеспособные клетки, перенесенные из такой среды в новую питательную среду, вновь повторяют полностью весь цикл развития популяции.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 38. Стадии роста периодической культуры:

I – лаг-фаза; II – фаза положительного ускорения; III – фаза логарифмического роста; IV – фаза отрицательного ускорения; V – стационарная фаза; VI – фаза ускоренной гибели; VII – фаза логарифмической гибели; VIII – фаза уменьшения скорости гибели.

На оси ординат показаны скорость размножения бактерий в условных единицах (слева) и величина популяции бактерий, выраженная логарифмом от числа живых клеток на 1 мл среды


Некоторые культуральные свойства бактерий

При росте на жидких питательных средах бактерии чаще всего вызывают равномерное помутнение, иногда – выпадение осадка: крошковатого (стрептококки), хлопьевидного (стрептобациллы), бульон при этом остается прозрачным. Некоторые бактерии образуют пленку на поверхности жидкой среды: сухую чешуйчато-бородавчатую (туберкулезная палочка), тонкую, нежную (холерный вибрион), рыхлую, с отходящими вниз отростками – «сталактитами» (возбудитель чумы). Еще более разнообразен рост бактерий на плотных питательных средах. Образуемые при этом колонии различаются по многим признакам: размерам, форме, консистенции, структуре, прозрачности, цвету и др.

Колонии бывают очень мелкими (0,1 – 0,5 мм), мелкими (0,5 – 3,0 мм), средних размеров (3 – 5 мм) и крупными (более 5 мм в диаметре). Они могут быть круглыми (дисковидными); плоскими; иметь форму, напоминающую львиную гриву («голову Медузы»); ризоидными и т. п. (рис. 39). Края колонии могут быть гладкими, зазубренными, фестончатыми, изрезанными. Поверхность колонии бывает гладкая или шероховатая, влажная или сухая, ровная или складчатая, плоская или выпуклая, а ее консистенция – плотная, рыхлая, слизистая. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными, непрозрачными и различаться по другим признакам, например у некоторых бактерий центр мутный, а периферическая зона полупрозрачна.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 39. Типы колоний различных видов бактерий:

1 – Bacillus pseudoanthracis; 2 – Clostridium novyi; 3 – Clostridium sporogenes; 4 – Escherichia coli; 5 – Corynebacterium diphtheriae; 6 – Fusobacterium; 7 – Brucella melitensis


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 40. Колония Salmonella paratyphi B


Все эти признаки, как правило, видоспецифичны, поэтому они имеют важное диагностическое значение, т. е. их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры. Например, при определенных условиях роста колонии Salmonella paratyphi B имеют характерный слизистый валик по периферии, напоминая пуговицу с валиком (рис. 40).

Колонию бактерий можно рассматривать как своеобразный сложный организм. Изучение организации колонии выявило морфологическую и физиологическую гетерогенность входящих в нее клеток. В колониях сосуществуют популяции активно размножающихся, покоящихся клеток и клеток лизирующихся. Видовое своеобразие свойств колоний указывает на регулируемый характер процесса их формирования. Он управляется с помощью контактных, дистантных и, вероятно, иных сигналов и служит проявлением у бактерий апоптоза.

Апоптоз (греч. apoptosis – опадание лепестков цветов или листьев дерева) – форма запрограммированной клеточной гибели у эукариот, благодаря которой удаляются определенные клоны дифференцирующихся клеток или «излишки» биологического материала. Апоптоз у бактерий – аналог апоптоза эукариот – пример запрограммированного контроля над клетками на уровне популяции (колония, стационарная культура, популяции в других природных условиях). Суть его сводится к тому, что при исчерпании питательного субстрата голодающая популяция разделяется на две субпопуляции, одна из которых гибнет и подвергается автолизу, а клетки другой субпопуляции, используя продукты автолиза как субстрат, продолжают размножаться. Механизм генетического контроля апоптоза у E. coli установлен. Он осуществляется особым опероном из 2 генов: mazE и mazF. Продукт гена mazF – стабильный цитотоксический белок-киллер, а продукт гена mazE – нестабильный белок MazE, разрушающий белок-киллер. Истощение фонда аминокислот в питательной среде приводит к блокированию оперона maz, в результате этого синтез белка MazE прекращается, а белок-киллер вызывает гибель и автолиз части популяции. Фонд аминокислот в среде за счет этого пополняется, синтез белка MazE у оставшихся живых клеток активируется, и они продолжают размножаться. Таким образом, апоптоз регулирует формирование колоний и поведение клеток в стационарных культурах. Возможно, этот механизм причастен и к образованию НФБ.

Культуры некоторых видов бактерий обладают характерным запахом, иногда он связан с разложением органических веществ, которое сопровождается образованием скатола, индола, сероводорода, меркаптана, масляной кислоты, аммиака и т. п. Культуры дизентерийных бактерий при росте на МПА издают запах, напоминающий запах мужского семени. Продукты жизнедеятельности ряда других видов бактерий обладают приятным ароматным запахом, который связан с образованием различных эфиров: уксусно-этилового, уксусно-амилового или диацетила. Возбудитель мочки льна, например, издает запах ананаса. Особые расы молочнокислых бактерий придают аромат пищевым продуктам.

В природе существуют так называемые фосфоресцирующие бактерии, т. е. бактерии, культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым светом. Такие фосфоресцирующие бактерии встречаются, главным образом, в морской и речной воде. Фосфоресценция (люминесценция) продолжается иногда несколько часов и даже суток. Она представляет собой особую форму освобождения энергии возбужденных электронов. Такие бактерии нередко обнаруживаются на мясе, чешуе рыб и других объектах. К светящимся бактериям – фотобактериям – относятся физиологически сходные, но морфологически отличающиеся аэробные бактерии (вибрионы, палочки, кокки).

Пигментные микроорганизмы

Способность образовывать пигмент присуща многим видам микроорганизмов. Как уже выше упоминалось, цианобактерии, некоторые виды архебактерий, а также серные и пурпурные бактерии имеют пигменты типа хлорофилла или бактериородопсина, с помощью которых они улавливают энергию Солнца. Различные виды других бактерий образуют пигменты желтого, оранжевого, красного, синего или черного цвета. Окраска колонии может быть связана как с пигментацией самих клеток, так и с выделением окрашенных веществ в питательную среду. Интенсивность образования пигментов зависит от состава питательной среды и условий культивирования микроорганизмов. Если пигмент не растворим в воде, окрашивается только культуральный налет; если же он водорастворим, окрашивается и питательная среда. Химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды относятся к ненасыщенным углеводородам, антоцианы и меланины – к ароматическим соединениям. Биологическая роль этих пигментов заключается, во-первых, в том, что они защищают бактерии от губительного действия солнечных лучей, поэтому в воздухе так много пигментных бактерий; а во-вторых, пигменты участвуют в обмене веществ этих бактерий.

Часть вторая

ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ

Глава 9

Некоторые общие понятия о генетической системе

Существование генов как дискретных единиц наследственности было установлено в 1865 г. Г. Менделем, а в 1869 г. Ф. Мишер впервые выделил ДНК. Однако прошло около 80 лет, прежде чем было установлено, что носителем генов является не белок, а ДНК. Это было сделано в опытах с пневмококками. В 1928 г. Ф. Гриффитс впервые осуществил трансформацию (превращение) невирулентных пневмококков в вирулентные. Он заразил белых мышей смесью живых, но не образующих капсул невирулентных пневмококков с убитыми капсульными вирулентными пневмококками. В организме мышей бескапсульные пневмококки превратились в капсульные, вызвали их заболевание и смерть. Механизм такой трансформации оставался неясным в течение 16 лет. В 1944 г. О. Эйвери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти осуществили трансформацию бескапсульных пневмококков в капсульные in vitro. Они добавили к культуре бескапсульных пневмококков ДНК, выделенную из капсульных пневмококков, в результате чего бескапсульные превратились в капсульные и стали вирулентными для мышей. Так впервые убедительно было доказано, что носителем единиц наследственности (генов) является ДНК. Через 9 лет после этого, в 1953 г., Ф. Крик и Дж. Уотсон определили структуру гена, основанную на двойной спирали ДНК. Это открытие позволило понять, каким образом ген выполняет свои три фундаментальные функции: 1) непрерывность наследственности – благодаря полуконсервативному механизму репликации ДНК; 2) управление структурами и функциями организма – с помощью генетического кода, использующего запас всего из четырех букв (оснований): А (аденин), Т (тимин), Г (гуанин) и Ц (цитозин); 3) эволюцию организмов – благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям. Работами Ф. Крика, M. Ниренберга, С. Очоа и Х. Кораны к 1966 г. генетический код был полностью расшифрован. Он характеризуется следующими основными свойствами:

1. Код триплетный. Это означает, что кодон (функциональная единица, кодирующая аминокислоту) состоит из трех букв (оснований).

2. Код неперекрывающийся, т. е. соседние кодоны представлены отдельными самостоятельными триплетами.

3. Код вырожденный, т. е. каждая аминокислота кодируется более чем одним кодоном.

4. Число триплетов, которые не кодируют ни одной аминокислоты, т. е. «бессмысленных», мало – всего три из 64.

5. Последовательность расположения кодонов в гене определяет последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи, кодируемой данным геном.

6. Код универсален, т. е. все живые существа используют один и тот же код для записи генетической информации. Это служит прямым доказательством единства происхождения живой материи. Полный словарь РНК-аминокислотного кода представлен на рис. 41.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 41. Генетический код


Одновременно с расшифровкой генетического кода происходило и изучение механизмов, с помощью которых осуществляется реализация генетической информации, заключенной в генах. Было обнаружено, что биосинтез белка осуществляется на особых структурах – рибосомах, а информация к ним от генов поступает через особых посредников – матричные РНК (мРНК), расположение кодонов в которых и несет программу сборки аминокислот в полипептидную цепь. Было установлено также, что хромосома состоит из особых функциональных единиц – оперонов, и в общих чертах были выяснены механизмы, с помощью которых регулируется их работа. В результате всех этих исследований стало очевидным, что генетическая система обладает уникальными свойствами, во многом обусловленными двунитевой структурой молекулы ДНК. Эти свойства заключаются в способности генетической системы к: 1) самоудвоению с помощью механизма саморепликации; 2) самовыражению (экспрессии) с помощью регулируемого синтеза мРНК; 3) самообновлению с помощью мутаций, рекомбинаций и транспонируемых элементов; 4) самозащите (самоисправлению) с помощью механизмов ревизии, репарации, супрессии и др.

Примечательно, что все эти функции контролируются специальными собственными генами соответствующей генетической системы. Исключительное значение, которое принадлежит генам в происхождении и эволюции жизни, диктует необходимость дать этому понятию определение.

В узком и специальном понимании ген представляет собой структурную единицу ДНК, расположение кодонов в которой детерминирует первичную структуру соответствующей полипептидной цепи. Но это определение не очень точно, так как существуют гены не только ДНКовые, но и РНКовые. Кроме того, некоторые гены вирусов и эукариот состоят из экзонов (кодирующих участков) и интронов (нетранслируемых участков). Например, сборка полных генов иммуноглобулинов и рецепторов Т-лимфоцитов происходит в результате сложной внутригенной рекомбинации в эмбриональном периоде. Кроме того, в одном и том же фрагменте ДНК может быть по крайней мере два гена с разными рамками считывания. Следовательно, структура гена сложнее, чем ранее предполагалось. Он не всегда является строго ограниченным и пространственно фиксированным участком хромосомы. Так называемые транспонируемые генетические элементы способны в интактной форме перемещаться из одного генома в другой. Наконец, для функционирования структурных генов требуется участие особых регуляторных генетических элементов – регуляторов, операторов, промоторов и т. п. Однако гены – это структуры, свойственные только живой материи. Поэтому в определении понятия гена следует исходить из той фундаментальной роли, которую он играет в живой материи.

Ген представляет собой универсальную организующую структурную единицу живой материи, которая, благодаря содержащейся в ней закодированной информации, обеспечивает единство и многообразие всех форм существования жизни, ее непрерывность и эволюцию. Ген является единственным носителем и хранителем жизни, а его продукт – белок – определяет способ и форму существования жизни (А. И. Коротяев). Любой объект природы, имеющий набор собственных генов, следует рассматривать как живой организм. В связи с этим главным критерием, отличающим живое от неживого, является наличие у живого собственной генетической системы. Именно она обусловливает ту целесообразность поведения живых существ, которая отличает их от неживых систем. С этих позиций жизнь можно определить как форму существования всех объектов природы, обладающих собственными геномами, которые и определяют многообразие организмов, их наследственность и эволюцию (А. И. Коротяев). В основе единства и многообразия форм жизни лежит единство генетического кода и многообразие геномов живых существ. Под генетической системой понимают совокупность всех генов данного живого существа, характеризующуюся определенным уровнем структурной организации и особенностями экспрессии, т. е. реализации заложенной в генах информации. В соответствии с этим можно выделить следующие основные этапы эволюции генетической системы: кодон → ген → оперон → геном вирусов и плазмид → хромосома прокариот (нуклеоид) → хромосомы эукариот (ядро).

Очень часто, говоря о генетической системе, употребляют термин «геном». Под геномом понимают всю совокупность нуклеотидов, содержащихся в хромосоме или в наборе хромосом данного индивидуума. Объем генома у представителей различных царств жизни очень сильно варьирует. Именно от объема генома, который определяет возможное количество генов, и зависит степень сложности структурной организации данного индивидуума и, соответственно, уровень и характер проявления им своей жизни.

Под генотипом понимают всю совокупность имеющихся у данного существа индивидуальных генов. У плазмид, вирусов и бактерий бQольшая часть нуклеотидов ДНК входит в состав генов, поэтому размеры геномов у них выражают либо в молекулярной массе соответствующей геномной нуклеиновой кислоты, либо в количестве нуклеотидных пар, содержащихся в геномной нуклеиновой кислоте, либо в количестве имеющихся у них генов. Все эти значения сопоставимы, так как в среднем каждый ген состоит примерно из 1000 пар нуклеотидов, а вес одного нуклеотида ДНК составляет около 500 дальтон. Например, геном вируса гепатита В представлен двунитевой ДНК с м. м. 1,6 МД. Этот вирус имеет самое маленькое число генов среди возбудителей заболеваний человека. Его геном состоит всего из четырех генов (S, C, P и X). Геном вируса – возбудителя СПИДа представлен двумя идентичными молекулами РНК, которые состоят из 9213 нуклеотидов, образующих 9 генов. Геном бактериофага φХ174 состоит из 9 генов, у бактериофага Т4 – из 200 генов, у F-плазмиды – из 90 генов (94,5 тысяч пар нуклеотидов); у хламидий – из 400 – 600 генов, у риккетсий – из 1000 генов. Хромосома E. coli имеет молекулярную массу 2,8 ⋅ 109 дальтон и содержит около 4,3 тысяч генов.

ДНК большинства растений и животных состоит из нескольких миллиардов пар нуклеотидов. Отличительная черта их геномов состоит в наличии в составе хромосомной ДНК помимо кодирующих последовательностей структурных генов некодирующих последовательностей и большого объема так называемых повторяющихся последовательностей нуклеотидов. На долю повторяющихся последовательностей, функция которых не известна, приходится от 10 до 70 % всего генома; у млекопитающих эта доля составляет в среднем 30 – 50 %.

Общий объем ДНК (генома) варьирует у разных ветвей эукариот. Геном человека составляет около 3 ⋅ 109 нуклеотидных пар (н. п.). Этого количества достаточно для образования 3,0 ⋅ 106 генов. В действительности же, согласно последним данным, генотип человека содержит около 30 000 – 35 000 генов, многие их которых уже картированы. Следовательно, понятия «геном» и «генотип» не равнозначны.

Под фенотипом данного индивидуума понимают всю совокупность реализованных у него генетически детерминированных признаков, т. е. индивидуальное проявление генотипа. При изменении условий существования фенотип (например, у бактерий) изменяется при сохранении генотипа.

Особенности генетики бактерий

Генетическая система бактерий имеет по крайней мере четыре особенности, присущие только этим организмам:

1. Хромосомы бактерий (и соответственно плазмид) располагаются свободно в цитоплазме, не отграничены от нее никакими мембранами, но связаны с определенными рецепторами на цитоплазматической мембране. Поскольку длина хромосомы (у E. coli около 1,6 мм) во много раз превышает длину бактериальной клетки (1,5 – 3,0 мкм в среднем), хромосома особым компактным образом в ней упакована: молекула хромосомной ДНК находится в суперспирализованной форме и свернута в виде петель, число которых составляет 12 – 80 на хромосому. Петли в центре нуклеоида объединяются за счет связывания ДНК с сердцевинной структурой, представленной молекулами особого класса РНК – 4,5S РНК. Такая упорядоченная упаковка обеспечивает постоянную транскрипцию отдельных оперонов хромосомы и не препятствует ее репликации. Возможно, что петли упакованной хромосомы способствуют компартментализации рибосом.

2. Хотя бактерии являются гаплоидными организмами, т. е. имеют один набор генов, содержание ДНК у них непостоянно, оно может при благоприятных условиях достигать значений, эквивалентных по массе 2, 4, 6 и даже 8 хромосомам. У всех прочих живых существ содержание ДНК постоянное, и оно удваивается (кроме вирусов и плазмид) перед делением.

3. У бактерий в естественных условиях передача генетической информации происходит не только по вертикали, т. е. от родительской клетки дочерним, но и по горизонтали с помощью различных механизмов: конъюгации, сексдукции, трансдукции, трансформации.

4. У бактерий очень часто помимо хромосомного генома имеется дополнительный плазмидный геном, наделяющий их важными биологическими свойствами, нередко – специфическим (приобретенным) иммунитетом к различным антибиотикам и другим химиопрепаратам.

Содержание ДНК у бактерий зависит от условий их роста: при благоприятных условиях оно возрастает до величин, соответствующих массе нескольких хромосом. Это уникальное свойство бактериального генома. Биологическое значение его состоит в том, что, регулируя содержание копий своих генов (а оно будет определяться количеством копий синтезируемых хромосом), бактерии одновременно приспосабливают скорость своего размножения к условиям роста. Наряду с увеличением содержания ДНК у бактерий в этом случае существенно возрастает и количество рибосом. Благодаря этому создаются необходимые условия для транскрипции и трансляции (а у бактерий они происходят одновременно) нескольких копий генов одновременно, возрастает суммарная скорость биосинтеза всех субклеточных и клеточных структур и соответственно скорость размножения бактерий. Время клеточного цикла бактерий сокращается от нескольких часов до 20 – 30 мин. Скорость размножения определяет возможность накопления в окружающей среде большого запаса клеток данного вида. Это и является причиной существования бактерий в природе многие миллионы лет. Возможность регулировать скорость собственного размножения – одно из главных условий, обеспечивающих выживание бактерий в окружающей среде, а следовательно, и сохранение вида в природе.

Особенности репликации бактериальной ДНК

У бактерий различают следующие типы репликации ДНК: вегетативную, конъюгативную, репаративную и стабильную. Вегетативная репликация хромосомной и плазмидной ДНК обусловливает передачу генетической информации по вертикали, т. е. по наследству – от родительской клетки дочерним. Она контролируется соответственно хромосомными и плазмидными генами. Конъюгативная репликация осуществляется при конъюгативном способе обмена генетическим материалом и контролируется только плазмидными генами. При конъюгативной репликации происходит достройка нити ДНК, комплементарной нити, передаваемой от донора реципиенту. Репаративная репликация является механизмом, посредством которого осуществляется устранение из ДНК структурных повреждений или заключительный этап генетической рекомбинации. Эти процессы контролируются хромосомными и плазмидными генами. Стабильная репликация так названа потому, что происходит независимо от наличия или отсутствия синтеза белка.

Вегететивная репликация. Репликация ДНК у бактерий начинается со строго фиксированного сайта хромосомы – оriC. Он включает в себя участки с так называемыми ДНК-боксами и расположенными между ними короткими последовательностями. Оба элемента примыкают к гену dnaA. У B. sublilis на oriC расположено 15 ДНК-боксов, с которыми связывается продукт гена dnaA. Это и служит сигналом для действия ДНК-хеликазы. Репликация имеет полуконсервативный характер, идет одновременно в двух направлениях и заканчивается также в строго фиксированной точке – terminus. Поскольку цепи ДНК антипараллельны (если одна нить начинается с 5'-конца, другая – с 3'-конца), а ДНК-полимераза III осуществляет синтез ДНК только в направлении 5' → 3', репликация происходит своеобразно (рис. 42): на одной из расплетенных нитей – «прямой», или лидерной, или ведущей, – она идет непрерывно, а на другой – отстающей – ДНК-полимераза III должна возвращаться, чтобы наращивать нить тоже в направлении 5' → 3', прерывисто, через образование сегментов Оказаки, длиной у бактерий около 1000 нуклеотидов (у эукариот – около 200 – 300 нуклеотидов).

Синтез каждого сегмента Оказаки происходит последовательно через следующие стадии (рис. 43):

1. Раскручивание нитей ДНК.

2. Расплетение (разделение нитей).

3. Стабилизация однонитевых участков.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 42. Схематическое изображение репликации ДНК прерывистой (отстающей) и непрерывной (ведущей) цепей


4. Формирование праймосомы. Праймосома – мультиферментный комплекс, в который входят фермент ДНК-праймаза и ряд других белков.

5. Синтез с участием ДНК-праймазы (англ. prime – подготавливать) затравочной РНК. Затравочная РНК необходима для синтеза каждого сегмента Оказаки потому, что сама ДНК-полимераза не способна инициировать синтез ДНК, для этого ей нужна специальная затравка, роль которой и выполняют короткие, длиной не более 10 нуклеотидов, фрагменты РНК, комплементарные ДНК-матрице.

6. Синтез сегмента Оказаки.

7. Вырезание затравочной РНК и замещение ее дезоксирибонуклеотидами, комплементарными основаниям ДНК-матрицы.

8. Сшивание сегмента Оказаки с предсуществующей нитью ДНК с помощью лигазы.

9. Суперспирализация вновь синтезированных участков нитей ДНК.

10. Ревизия ДНК-полимеразой вновь синтезированного фрагмента ДНК – нет ли ошибочного включения нуклеотидов.

Если произошла ошибка, то ошибочно включенный нуклеотид с частью этой нити вырезается и образовавшаяся брешь заполняется правильными нуклеотидами. Благодаря такой ревизии процент ошибок при репликации ДНК не превышает 1 ⋅ 10– 9.

Скорость репликации ДНК у E. coli при температуре 37 °C соответствует включению 2 ⋅ 103 пар нуклеотидов в 1 с. Участок хромосомы, в котором происходит разделение нитей и начинается репликация, имеет форму вилки, последовательно продвигающейся вдоль хромосомы. При благоприятных для роста бактерий условиях, когда еще не закончился один цикл репликации, могут возникать вторичные и третичные репликативные вилки, благодаря чему в клетке и происходит увеличение массы ДНК и числа копий хромосом.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 43. Схематическое изображение состава и функционирования компонентов репликативного комплекса


В осуществлении процессов репликации ДНК участвует целый комплекс ферментов, образующих единую структуру – реплисому. Наиболее важные из них указаны на рис. 43. Генетический контроль репликации ДНК осуществляется большим количеством генов (у E. coli не менее 25), локализованных в самой ДНК; это процесс саморегулируемый. Комплекс генов обеспечивает строгую временну́ю и пространственную координацию функционирования ферментов, участвующих в репликации.

Глава 10

Особенности регуляции выражения генетической информации у бактерий

В отличие от вегетативной репликации, цель которой – обеспечить передачу по наследству всех генов и которая происходит последовательно от начала до конца хромосомы, выражение генетической информации, т. е. работа генов, подчиняется другой цели, а именно – осуществлению за короткий срок жизненного цикла клетки. Поскольку он включает в себя множество биохимических реакций, сопряженных между собой, это предполагает хорошо согласованную во времени работу генов. Такая их согласованность возможна лишь при определенном жестком и четком управлении ими. Действительно, как было давно установлено, основной структурнофункциональной единицей хромосомы является оперон. Он представляет собой группу структурных генов-цистронов, физически сцепленных друг с другом и с геном-оператором, который управляет их выражением. В состав оперона, как правило, входят структурные цистроны, определяющие синтез ферментов, которые участвуют в цикле связанных между собой биохимических реакций. Ген-оператор управляет одновременно всей группой структурных генов, которые образуют оперон, иначе говоря, оперон функционирует как самостоятельная единица. В свою очередь, оперон или их группа находится под управлением одного гена-регулятора. Так возникает более сложная структурно-функциональная единица – регулон. Регулон представляет собой систему, состоящую из гена-регулятора и одного или нескольких оперонов, находящихся под контролем одного гена-регулятора.

Важным структурным элементом оперона является промQотор – область, с которой взаимодействует РНК-полимераза. В составе оперонов могут быть и различные другие регуляторные элементы – энхансеры, аттенуаторы, терминаторы и т. п.

Энхансер (англ. enhance – усиливать) – генетический элемент, усиливающий транскрипцию оперона.

Аттенуатор (англ. attenuate – разрежать, разбавлять) – генетический элемент, ослабляющий работу оперона. Аттенуатор – последовательность нуклеотидов, расположенная между промоторным операторным участком оперона и его первым структурным опероном; она кодирует лидерную РНК, ее длина около 150 пар нуклеотидов.

Терминатор (англ. terminate – заканчивать) – особый участок в структуре аттенуатора (лидерной последовательности), от которого зависит образование участка мРНК, блокирующего синтез лидерной РНК перед началом первого структурного гена соответствующего оперона.

Очень важным для понимания того, как регулируется выражение генетической информации, содержащейся в хромосоме, является вопрос о том, в какой последовательности работает оперон. До 1960-х гг. предполагали, что транскрипция сопряжена с репликацией, поскольку для той и другой необходимо разделение нитей. В соответствии с этой моделью транскрипция начиналась из той же точки, что и репликация, и осуществлялась последовательно вдоль всей ДНК. В 1969 г. А. И. Коротяевым было постулировано и обосновано положение о том, что репликация и транскрипция идут независимо друг от друга, поскольку скорости их не сопоставимы, и поэтому каждый оперон имеет равную возможность для своего выражения в ходе жизненного цикла клетки – гипотеза равновероятностного выражения оперонов. Образно говоря, хромосому клетки можно сравнить с пианино. В хромосоме гены располагаются последовательно один за другим, контролируя разные реакции. У пианино клавиши располагаются также последовательно – в соответствии с нотами и октавами. Законченное музыкальное произведение создается не путем последовательного извлечения звуков вдоль клавиатуры, а путем их избирательной композиции. Выбор композиции – это и есть произведение. Точно так же для того, чтобы в клетке осуществлялось такое сочетание биохимических процессов, которое бы приводило к образованию законченных продуктов-белков, необходим правильный выбор соответствующих генов, ибо совокупность биохимических реакций, ведущих к синтезу необходимого продукта (продуктов), – это и есть законченное произведение «генетического пианино». Партитура этих произведений написана эволюцией живой материи.

Классическим примером организации и работы оперона служит модель лактозного оперона. Лактоза – дисахарид, она состоит из галактозы и глюкозы, соединенных β-галактозидной связью. Поэтому фермент, разрушающий эти связи, получил название β-галактозидазы. Лактозный оперон (рис. 44) содержит гены, которые контролируют синтез ферментов, участвующих в превращении лактозы: β-галактозидазу (z), галактозидпермеазу (y) и тиогалактозидтрансацетилазу (a). Ген-оператор (о) управляет одновременно выражением всей группы этих генов. В его составе содержится промотор (р), с которым взаимодействует РНК-полимераза. Лактозный оперон содержит 5500 нуклеотидных пар, в том числе: область о + р – 50 нуклеотидных пар; цистрон z – 3700 нуклеотидных пар; цистрон y – 900 нуклеотидных пар; цистрон a – 900 нуклеотидных пар.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 44. Схема функционирования lac-оперона:

1 – работа оперона блокирована репрессором; 2 – оперон активно работает, молекулы репрессора инактивированы индуктором


Работа оперона находится под негативным контролем гена-регулятора (i), который контролирует синтез белка-репрессора. Белок-репрессор имеет м. м. около 150 – 200 кД. Он состоит из четырех субъединиц, имеющих м. м. 38 кД. Репрессор имеет два активных участка: с одним из них взаимодействует индуктор (лактоза или ее структурный аналог), а с помощью другого он прикрепляется к оператору. В отсутствие лактозы белок-репрессор связывается с оператором и блокирует выражение этого оперона. Когда в среде появляется лактоза, она связывается со вторым активным участком репрессора, это приводит к изменению его конформации по типу аллостерического эффекта, и он становится неактивным, репрессия оперона снимается, происходит активный синтез ферментов.

Негативный контроль работы лактозного оперона хорошо объясняет сущность феномена индукции: нет индуктора – оперон молчит, его работа заблокирована. Появился индуктор – оперон разблокирован и активно работает.

В основе другого феномена – феномена репрессии – лежит тот же принцип регуляции. Однако в репрессируемой системе ген-регулятор контролирует синтез апорепрессора, т. е. неактивного репрессора. Апорепрессор также имеет два активных центра: один – для взаимодействия с метаболитом (корепрессором), а другой – для специфического связывания с геном-оператором. Апорепрессор становится активным и подавляет работу оперона лишь после взаимодействия с соответствующим корепрессором (метаболитом).

Типичным примером репрессируемой системы является система синтеза ферментов пути образования триптофана у E. coli (рис. 45). В отсутствие триптофана апорепрессор неактивен и не блокирует работы триптофанового оперона. При избыточном содержании триптофана в среде, в которой размножается E. coli, он, выполняя роль корепрессора, связывается с апорепрессором и вызывает его аллостерическое превращение в активный репрессор. Последний связывается с геном-оператором, что и приводит к прекращению дальнейшей транскрипции структурных цистронов этого оперона и подавлению синтеза ферментов. Особенностью триптофанового оперона является наличие в нем между промоторно-операторным участком и его первым структурным цистроном особой последовательности приблизительно из 150 пар нуклеотидов, получившей название лидерной последовательности, или аттенуатора. Роль аттенуатора состоит в регуляции активности РНК-полимеразы. Суть феномена аттенуации заключается в том, что даже при незначительном избытке триптофана в клетке транскрипция оперона большинством молекул РНК-полимераз преждевременно обрывается в области аттенуатора (его терминатора). По мере же снижения концентрации триптофана все больше и больше молекул РНК-полимераз «проскакивают» этот участок и становятся способными транскрибировать весь оперон. Наоборот, при большом избытке триптофана его молекулы переводят апорепрессор в корепрессор, и транскрипция оперона подавляется. Следовательно, при наличии аттенуатора синтез ферментов может происходить как по правилу «все или ничего», так и по типу «больше – меньше». Аттенуаторы обнаружены и в других оперонах, осуществляя более экономичную их регуляцию.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 45. Функционирование триптофанового оперона:

а – аттенуатор; о – оператор; р – промотор


Помимо негативных, существуют и позитивные механизмы контроля выражения генетической информации. Они были обнаружены при изучении арабинозного оперона у E. coli (рис. 46). Этот оперон включает три гена – araA, araB, araD (1 мин), кодирующих синтез ферментов, и три гена – araE (61 мин), araF, araG (45 мин), кодирующих транспортные белки. Они расположены в разных участках хромосомы и образуют три самостоятельных оперона, один из которых состоит из трех сцепленных структурных генов (araBAD).

Выражение всех оперонов контролируется геном araC, расположенным рядом с проксимальным концом araBAD-оперона и отделенным от него общей регуляторной областью. Продукт гена araC – аллостерический белок, который может существовать в двух альтернативных конформациях: Р1 – сам белок; Р2 – белок в комплексе с арабинозой. Белок Р1 является репрессором для всех оперонов (araBAD, araE и araG). Белок Р2 в результате взаимодействия с арабинозой изменяет свою конформацию (аллостерический эффект) и выступает в качестве активатора araBAD-оперона. Следовательно, продукт гена araC осуществляет как негативную, так и позитивную регуляцию транскрипции.

В регуляторной области имеются следующие участки: промотор; инициатор (с ним связывается Р2); участок, с которым связывается белок-активатор катаболизма (БАК) в комплексе с цАМФ и оператор (место связывания Р1). При наличии в среде арабинозы Р1 связывается с ней и превращается в активатор Р2. Поэтому комплекс БАК – цАМФ присоединяется к соответствующему участку ДНК. В результате этого Р2 стабильно связывается с инициатором и стимулирует присоединение к промотору все новых молекул РНК-полимеразы, а последние осуществляют многократную транскрипцию araBAD-оперона и соответственно происходит многократная трансляция. При отсутствии арабинозы или при ее полном потреблении Р2 возвращается в репрессорную форму Р1 и блокирует оператор.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 46. Модель негативно-позитивного контроля выражения L-арабинозной системы.

Цифры обозначают число пар нуклеотидов в генах


Система позитивного контроля является необходимым атрибутом координированного управления различными оперонами. Так, например, в арабинозной системе пермеазный ген (araE) пространственно разобщен со всеми остальными генами. Если он является частью какого-то другого оперона (оперона Х), он требует позитивного контроля в форме активатора (Р2), чтобы вывести его из-под контроля, осуществляемого опероном Х.

Таким образом, благодаря сочетанию механизмов индукции и репрессии, негативного и позитивного контроля выражения генетической информации, обеспечивается определенная координация между различными функциональными группами оперонов.

В конце XX в. был обнаружен еще один механизм регуляции передачи генетической информации. Он получил название РНК-интерференция (RNA-interference), или РНК-и, а проще назвать этот процесс контролем, или цензурой потока генетической информации с помощью двухцепочечной РНК, поскольку именно такую, «цензорную» функцию выполняет двухцепочечная РНК.

Еще в начале 80-х гг. XX в. в опытах с E. coli было установлено, что введение в клетку синтетических фрагментов одноцепочечной РНК может приводить к блокированию некоторых генов. В 1997 г. американские ученые Эндрю Файер (Andrew Z. Fire) и Крэйг Мелло (Craig C. Mello) с группой соавторов в опытах с червем Caenorhabditis elegans установили, что такое блокирование генов происходит значительно эффективнее, если вводить короткие фрагменты не одно-, а двухцепочечной РНК. (Статья об этом открытии была опубликована в журнале «Nature», Vol. 391, 19 February 1998, pp. 806 – 811). К. Мелло дал этому феномену название «РНК-интерференция». Механизм РНК-интерференции пока полностью не изучен и заключается, по-видимому, в следующем. При попадании в клетку молекулы двухцепочечной РНК индуцируют работу группы ферментов, которые разрезают РНК на очень короткие фрагменты, затем расплетают их на отдельные нити и с помощью этих нитей удаляют из мРНК соответствующие участки. В результате этого содержащаяся в них информация утрачивается и не доходит до рибосом. Этот механизм оказался универсальным. Им владеют все живые существа от бактерий до млекопитающих. С помощью этого механизма прицельного блокирования (генной цензуры), осуществляемого РНК-и, разрушается попавшая в организм чужеродная генетическая информация (например, различных вирусов) и контролируется работа собственных генов, т. е. подавляется работа тех из них, в которых возникли опасные мутации, или вырезаются и уничтожаются транспозоны, которые могут вызвать опасные мутации. За открытие этого фундаментального механизма регуляции переноса генетической информации Э. Файер и К. Мелло в 2006 г. были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины. Эти исследования помогут разработке более эффективных способов профилактики и лечения тех заболеваний, от которых в настоящее время умирает больше всего людей, а именно: сердечно-сосудистых, онкологических и вирусных (в том числе ВИЧ-инфекции и гепатитов).

Глава 11

Формы обмена генетическим материалом у бактерий

Помимо основного механизма передачи генов – по наследству (по вертикали), у бактерий существуют следующие формы обмена генетическим материалом по горизонтали, т. е. между отдельными особями в популяции клеток: трансформация, трансфекция, трансдукция, конъюгация и сексдукция.

Трансформация – перенос генетического материала, заключающийся в том, что бактерия-реципиент захватывает (поглощает) из внешней среды фрагменты чужеродной ДНК. Трансформация может быть спонтанной или индуцированной. Индуцированная (искусственно получаемая) трансформация происходит при добавлении к культуре бактерий очищенной ДНК, полученной из культур тех бактерий, генетические признаки которых стремятся передать исследуемой культуре. Спонтанная трансформация происходит в естественных условиях и проявляется в возникновении рекомбинантов при смешивании генетически различающихся клеток. Она протекает за счет ДНК, выделяющейся клетками в окружающую среду вследствие их лизиса или в результате активного выделения ДНК жизнеспособными клетками-донорами. Как спонтанная, так и индуцированная трансформация сводится, по сути, к поглощению трансформирующей ДНК и образованию рекомбинантов, причем спонтанная трансформация может происходить в результате взаимного обмена ДНК. Эффективность индуцируемой трансформации во многом зависит от физиологического состояния клеток-реципиентов. Они должны находиться в состоянии своеобразной компетентности для этого процесса. Предполагается, что в фазе компетентности происходят значительные изменения поверхностных слоев клетки, которые способствуют поглощению ДНК. В частности, аутолитические ферменты клетки растворяют клеточную стенку в тех участках, где происходит ее синтез. При этом мезосомы через образовавшиеся отверстия соприкасаются с внешней средой, адсорбируют и втягивают внутрь клетки трансформирующую ДНК, где она и вступает в рекомбинацию с ДНК реципиента. В результате этого образуется мерозигота, клетка делится, и ее потомки наследуют признаки, полученные от донора и реципиента. Однако в других случаях поглощенные фрагменты ДНК разрушаются нуклеазами клетки-реципиента, и трансформации не происходит. Ее эффективность зависит также от размеров трансформирующей ДНК: высокомолекулярная ДНК поглощается труднее, чем менее крупные ее фрагменты. Способность к трансформации обнаружена у ряда родов бактерий, но, по-видимому, роль ее в обмене генетическим материалом среди бактерий в естественных условиях менее существенна, чем роль других механизмов. Дело в том, что у многих бактерий имеются особые системы рестрикции и модификации. Эти системы модифицируют свою ДНК (чаще всего путем ее метилирования) и разрушают чужеродную ДНК, если она подобным образом не модифицирована, с помощью особых ферментов – рестрикционных эндонуклеаз.

Эффективность метода генетической трансформации во много раз повышается в том случае, если смесь ДНК и трансформируемых клеток с помощью специального прибора подвергнуть обработке электрическим импульсом. Метод электротрансформации является универсальным, он применим к любым видам бактерий. С помощью этого метода осуществлена трансформация более 100 видов бактерий, и он может стать важным инструментом получения ценных рекомбинантных штаммов бактерий.

Трансфекция – вариант трансформации бактериальных клеток, лишенных клеточной стенки, осуществляемый вирусной (фаговой) нуклеиновой кислотой.

С помощью трансфекции удается вызвать у таких бактерий (без клеточной стенки)

вирусную инфекцию. Трансфекцию можно осуществить и с другими (не бактериальными) клетками, если ввести в них чужеродную ДНК, способную рекомбинировать с ДНК этих клеток, или воспроизводить вирионы, или самостоятельно реплицироваться.

Трансдукция – перенос генетического материала от клетки-донора клетке-реципиенту с помощью бактериофагов. Различают трансдукцию неспецифическую и специфическую.

Неспецифическая трансдукция – случайный перенос фрагментов ДНК от одной бактериальной клетки к другой.

Специфическая трансдукция осуществляется только умеренными фагами, обладающими способностью включаться в строго определенные участки хромосомы бактериальной клетки и трансдуцировать определенные гены.

Механизмы неспецифической и специфической трансдукции описаны в главе 47.

Конъюгация – это процесс обмена генетическим материалом (хромосомным и плазмидным), осуществляемый при непосредственном контакте клеток донора и реципиента. Процесс контролируется только конъюгативными плазмидами, имеющими совокупность генов, называемую tra-опероном (англ. transfer – перенос). Этот оперон контролирует синтез аппарата переноса, конъюгативную репликацию и явление поверхностного исключения. Аппаратом переноса являются специальные донорные ворсинки, с помощью которых устанавливается контакт между конъюгирующими клетками. Донорные ворсинки представляют собой длинные (1 – 20 мкм) тонкие трубчатые структуры белковой природы с внутренним диаметром около 3 нм. Число донорных пилей у каждой F+-клетки невелико и, очевидно, соответствует числу копий конъюгативной плазмиды в клетке. Донорные ворсинки обнаруживают с помощью донорспецифических фагов, которые, адсорбируясь на них, проникают в клетку и вызывают ее лизис. Для каждой группы конъюгативных плазмид существуют свои донорспецифические фаги. Ворсинки выполняют следующие функции: 1) с их помощью устанавливается контакт между донорной и реципиентной клетками; 2) они облегчают перенос нити ДНК (она, вероятно, протаскивается через ворсинку); 3) стягивают спаривающиеся клетки, что повышает эффективность конъюгации.

Процесс конъюгации протекает через следующие стадии: установление контакта между донором и реципиентом, протаскивание нити ДНК от донора к реципиенту, достройка перенесенной нити ДНК комплементарной ей нитью в реципиентной клетке и рекомбинация между переданной хромосомой (ее фрагментами) и хромосомой клетки-реципиента, размножение мерозиготы и образование клеток, несущих признаки донора и реципиента.

Сущность поверхностного исключения заключается в том, что под контролем traгенов синтезируются белки наружной мембраны, препятствующие (исключающие возможность) проникновению в клетку, несущую плазмиду, другой, но близкородственной ей плазмиды, или подавляющие конъюгативную репликацию ее ДНК.

Конъюгативная репликация переносимой нити хромосомной или плазмидной ДНК осуществляется также под контролем плазмидных генов. Классическим примером конъюгативной плазмиды является половой фактор, или F-плазмида (F – англ. fertility – плодовитость). Эта плазмида представляет собой двунитевую кольцевидную молекулу ДНК, состоящую из 94,5 тыс. п. н.

Главная функция этой плазмиды – контроль конъюгации у бактерий кишечной группы. Ее tra-оперон содержит больше тридцати генов, которые контролируют процесс конъюгации. Эта плазмида может как находиться в автономном состоянии, так и интегрироваться в хромосому клетки. Находясь в автономном состоянии, она контролирует только собственный перенос, при котором F--клетка (клетка, лишенная F-плазмиды) превращается в F+-клетку (клетку, содержащую F-плазмиду). F-плазмида может интегрироваться в определенные участки бактериальной хромосомы, в этом случае она станет контролировать конъюгативный перенос хромосомы клетки. При этом одна из нитей ДНК хромосомы в месте интеграции F-плазмиды разрезается, и ее 5'-конец через донорный мостик начинает протягиваться в клеткуреципиент. Репликация ДНК в этом случае протекает по принципу «крутящегося кольца» (рис. 47). Таким образом, конъюгация начинается с установления контакта между донором и реципиентом с помощью донорной ворсинки. Последняя смыкается с рецептором клеточной мембраны клетки-реципиента. Нередко такой контакт устанавливается не только между двумя клетками, а между многими клетками, образуя агрегаты спаривания. Предполагают, что нить ДНК в процессе конъюгации протаскивается через канал донорной ворсинки. Поскольку донорный мостик является непрочным, процесс конъюгации может в любой момент прерваться. Поэтому при конъюгации может переноситься или часть хромосомы, или, реже, полная хромосома. С помощью F-плазмид частота переноса генов между бактериями существенно возрастает. Поэтому клетки, у которых F-плазмида интегрирована в хромосому, обозначают как клетки Hfr (Hfr – англ. high frequency recombination – клетки, обеспечивающие высокую частоту рекомбинаций).


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 47. Конъюгационный перенос бактериальной ДНК


В некоторых случаях интегрированная в хромосому F-плазмида может из нее исключаться и, подобно умеренному фагу, «выхватывать» из хромосомы ее ген или даже целую группу генов. Такая плазмида, содержащая в своей ДНК часть генов хромосомы клетки, называется F'-плазмидой.

Сексдукция – перенос генетического материала между бактериальными клетками, осуществляемый F'-плазмидой с помощью механизма, аналогичного специфической трансдукции.

Глава 12

Генетические рекомбинации у бактерий

Заключительным этапом при любой форме обмена генетическим материалом является рекомбинация между привнесенной ДНК и хромосомой клетки-реципиента. Если переносится одна нить ДНК, то она вначале достраивается комплементарной ей нитью; рекомбинируют между собой только двунитевые ДНК. Различают общую рекомбинацию, сайт-специфическую рекомбинацию и рекомбинацию, контролируемую транспонируемыми элементами. Общая рекомбинация происходит между гомологичными ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация происходит за счет наличия специфических участков у рекомбинируемых молекул ДНК. Ее примером является специфическая рекомбинация между умеренным фагом λ и хромосомой E. coli. Как в бактериальной хромосоме, так и в ДНК фага λ имеются специфические участки (attB и attP соответственно), между которыми и происходит сайт-специфическая рекомбинация. Общая и сайт-специфическая рекомбинация контролируется геном recA.

Рекомбинации, осуществляемые транспонируемыми элементами, тоже являются сайт-специфическими, но специфичность этих сайтов связана с особыми нуклеотидными последовательностями, и эта форма рекомбинации не зависит от recA-гена.

Главным генетическим детерминантом всех путей рекомбинации является ген recA. Его повреждение полностью исключает возможность образования рекомбинантов. Основной способ recA-рекомбинации осуществляется с участием продуктов генов recB и recC (они кодируют синтез эндонуклеазы V). В случае мутации по recB и recC выход рекомбинантов составляет около 20 % от rec+. Однако эти мутации могут быть исправлены путем супрессии в двух генах: sbcA- и sbcB-. Супрессии sbcAоткрывают дополнительный путь рекомбинации через ген recE (его продукт – экзонуклеаза VIII). Супрессии sbcB- реализуют рекомбинации через ген recF (структурный ген экзонуклеазы I). Таким образом, генетический контроль рекомбинаций носит сложный характер.

Изучение его механизма – одна из центральных задач молекулярной генетики. Особый интерес представляет изучение механизма гомологической рекомбинации. Это определяется перспективами развития молекулярной медицины. Одной из важнейших стратегических задач, поставленных перед программой «Геном человека», является обнаружение изменений первичной структуры ДНК, которые приводят к нарушению функции генов и, как следствие этого, к развитию наследственных заболеваний человека. Идеальным методом лечения их является генотерапия, основанная на замене поврежденного («больного») гена здоровым. Такая замена может быть осуществлена только с помощью гомологической рекомбинации, механизмы которой у бактерий и эукариот, очевидно, во многом сходны. У бактерий выявлены два способа такой рекомбинации, осуществляемых двумя типами рекомбиназ: АТФ-зависимым белком RecA и АТФ-независимой ренатуразой. Соответственно, и у эукариот обнаружены АТФ-зависимые и АТФ-независимые ДНК-трансферазы, среди которых найдены белки, функционально сходные с RecA-белком бактерий.

Решающая роль в гомологической рекомбинации у бактерии, как указано выше, принадлежит гену recA. Его продукт – белок RecA c м. м. 38 кД – выполняет ряд уникальных функций: 1) прочно связывается с одиночными нитями ДНК; 2) способствует высвобождению разорванной нити из двойной спирали ДНК; 3) одновременно может присоединяться и к двойной спирали ДНК, и к одиночной нити и удерживать их вместе; 4) обладает свойством ДНК-зависимой АТФазы. Благодаря этому свойству обеспечивается серия конформационных изменений, которые обусловливают превращение трехнитевого комплекса с неспаренными основаниями в трехнитевый комплекс со спаренными основаниями. С помощью этой реакции происходит прямое комплементарное взаимодействие между одиночной нитью ДНК и двойной спиралью – главное событие в процессе рекомбинации. Энергия гидролиза АТФ RecA-белком используется последним для продвижения одиночной нити вдоль двойной спирали ДНК с целью нахождения того ее участка, который имеет гомологичную последовательность нуклеотидов, необходимую для замыкания водородных связей, т. е. для спаривания.

Для объяснения механизма гомологической рекомбинации предложены разные модели. В соответствии с наиболее популярной моделью, рекомбинация инициируется с помощью однонитевого разрыва в одной из двух гомологичных молекул ДНК, вызываемого эндонуклеазой, которая кодируется генами recB и recC. Образующийся при этом конец (3'– или 5'-конец) однонитевой ДНК (онДНК) атакует двойную спираль другой молекулы ДНК, отыскивая в ней гомологичный участок, и образует временную трехнитевую структуру (рис. 48, 1). В результате спаривания атакующей молекулы онДНК с комплементарной нитью другой молекулы ДНК происходит выталкивание ее освобождающейся нити (рис. 48, 2), которая в свою очередь спаривается с комплементарной нитью другой молекулы ДНК. Во время этих событий часто наблюдается удаление некоторого количества нуклеотидов, репарация образующейся бреши и лигирование ДНК, но в конечном счете образуется (рис. 48, 3) предсказанная Р. Холидеем полухиазма (греч. chiasmos – расположение в виде греческой буквы Х – хи). Парными стрелками указаны места «разрешения» полухиазмы (см. рис. 48, 3). Разрешение в одном варианте (полые стрелки) приведет к обмену фрагментами онДНК между спаривающимися молекулами ДНК, в другом (черные стрелки) – к полному кроссинговеру на уровне двунитевых ДНК.

В случае обмена с перекрещиванием нитей обе гомологичные спирали ДНК после начального этапа спаривания удерживаются вместе благодаря перекрестному обмену нитями из имеющихся четырех – по одной нити от каждой спирали. Структура, образующаяся при этом, обладает двумя важными свойствами:

1. Точка обмена между двумя гомологичными спиралями, т. е. место, где скрещиваются две их нити, может быстро мигрировать по спирали. Этот процесс получил название миграции ветвей. Миграция может значительно увеличивать области спаривания между двумя взаимодействующими нитями, изначально принадлежавшими разным молекулам ДНК.

2. Эта структура, благодаря вращению составляющих ее элементов относительно друг друга, может находиться в различных изомерных формах. Изомеризация изменяет положение двух пар нитей: две ранее перекрещивающиеся нити становятся неперекрещивающимися, и наоборот. Для прекращения процесса спаривания в каждой из двух нитей должен произойти разрыв. Если он произойдет до изомеризации, то у каждой спирали будет заменена только одна из нитей и только на коротком отрезке. Если же разрыв произойдет после изомеризации, наступит полный кроссинговер.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 48. Образование полухиазмы Холидея при асимметричном характере инициирования рекомбинации (по В. А. Ланцову):

1 – однонитевый разрыв в одной из двух гомологичных молекул ДНК; 2 – выталкивание высвобождающейся при спаривании нити ДНК и спаривание последней с комплементарной нитью другой молекулы ДНК; 3 – образование полухиазмы


Фермент ренатураза (33 кД) кодируется у E. coli геном recE. Он относится к классу «гомологических ДНК-синаптаз», которые, в отличие от RecA-белка, не обладают ДНК-трансферазной активностью и не зависят от АТФ. Эти белки участвуют в реакциях гомологической рекомбинации, индуцированных двунитевыми разрывами ДНК.

Ген recA участвует не только в процессе рекомбинации, его продукт необходим для пострепликативной репарации, индукции профага, клеточного деления и ряда других жизненно важных для бактерий функций. Рецессивные мутации в этом гене неизбежно отражаются на всех этих функциях, поэтому они получили название SOS-функций, а их совокупность объединена в единую SOS-систему (англ. SOS – сигнал бедствия: save our souls – спасите наши души или save our ship – спасите наш корабль).

Выражение любой SOS-функции зависит от активности продукта recA-гена. SOSсистема срабатывает после любых воздействий на ДНК агентами, которые повреждают ее структуру, или нарушают нормальный процесс ее репликации, или нарушают другие функции. Поэтому recA-гену принадлежит ведущая роль в обеспечении самозащиты генетической системы бактериальной клетки.

Глава 13

Молекулярные механизмы изменчивости бактерий. Организация геномов

Бактерии в силу относительной простоты их организации и короткого срока жизни подвергаются изменчивости быстрее, чем многие другие организмы. В основе их изменчивости лежат мутации и генетические рекомбинации, особенно протекающие с участием транспонируемых элементов.

Мутации – изменения в генотипе, которые стабильно наследуются. Мутации могут быть спонтанными или индуцированными. Спонтанные мутации возникают без каких-либо специальных воздействий, они происходят в результате ошибок при репликации и репарации. Средняя частота спонтанных мутаций составляет около 1 ⋅ 10-6 (одна мутантная клетка на 1 млн клеток).

Индуцированные мутации происходят с гораздо большей частотой, они возникают в результате воздействия различных мутагенов. К ним относятся физические и химические факторы, повреждающие ДНК (ионизирующая радиация, УФ-облучение, различные аналоги оснований ДНК, алкилирующие соединения, акридины, антибиотики и т. п.). Молекулярные механизмы спонтанных и индуцированных мутаций одинаковы. Точечные мутации могут быть обусловлены заменой оснований, выпадением (делецией) основания или появлением дополнительного основания (вставки). Различают простую замену оснований, или транзицию, при которой пурин заменяется на пурин, а пиримидин – на пиримидин, и сложную, или трансверсию, при которой происходит замена пурина на пиримидин или наоборот. Точечные мутации могут иметь три последствия: замена одного кодона на другой, а стало быть, одной аминокислоты на другую;

сдвиг рамки считывания, что приведет к изменению целой серии последовательностей аминокислотных остатков; возникновение «бессмысленного» кодона (УАГ, УГА, УАА), что приведет к прекращению трансляции в данной точке. В результате таких точечных мутаций синтез белка может быть полностью заблокирован за счет «бессмысленного» кодона, либо будет синтезироваться измененный (неактивный) белок, что приведет либо к утрате какого-то фенотипического признака у мутанта, либо, реже, к появлению у него нового признака. Получение индуцированных мутаций (мутантов) – один из основных способов изучения генетики микроорганизмов.

Эффекты мутаций могут быть устранены либо путем репарации поврежденного участка гена, либо с помощью супрессорных мутаций, т. е. мутаций в других генах, устраняющих или нейтрализующих эффект первичной мутации. Помимо точечных мутаций, нарушение генома может быть следствием протяженных делеций, инверсии (поворот сегмента хромосомы на 180°) или транслокации (перемещение участка хромосомы из одной позиции в другую). Все это также будет приводить к изменению и нарушению различных функций клетки (организма).

Судьба мутантных организмов зависит от степени сохранения их жизнеспособности. Мутации у микроорганизмов, связанные с приобретением лекарственной устойчивости, придают им важные селективные преимущества в условиях повсеместного применения антибиотиков и различных других химиопрепаратов.

Известно, что многие белки близки по своим функциям и аминокислотной последовательности. Поэтому вполне вероятно, что они могли возникнуть от какого-то единственного предкового гена в результате процессов его дупликации и дивергенции. Возникновение новых генов путем дивергенции также играло важную роль в эволюции организмов.

Большая роль в изменчивости бактерий и других организмов принадлежит так называемым транспонируемым генетическим элементам, т. е. генетическим структурам, способным в интактной форме перемещаться внутри данного генома или переходить от одного генома к другому, например от плазмидного генома к бактериальному и наоборот. Различают три класса транспонируемых элементов: IS-элементы, транспозоны и эписомы.

IS-элементы, или вставочные последовательности (англ. insertion sequence), имеют обычно размеры, не превышающие 2 тыс. пар оснований, или 2 кб (килобаза – тысяча пар оснований). IS-элементы несут только один ген, кодирующий белок транспозазу, с помощью которой IS-элементы встраиваются в различные участки хромосомы. Их обозначают цифрами: IS1, IS2, IS3 и т. д.

Транспозоны (Tn) представляют собой более крупные сегменты ДНК, фланкированные инвертированными IS-элементами. Транспозоны также способны встраиваться в различные участки хромосомы или переходить от одного генома в другой, т. е. ведут себя как IS-элементы, но помимо генов, обеспечивающих их транспозиции, они содержат и другие гены, например гены лекарственной устойчивости.

Очень часто транспозоны содержатся в составе R-плазмид. Транспозоны обнаружены в геномах плазмид, вирусов, прокариот и эукариот, поэтому с их способностью переносить гены из одного генома в другой связывается исключительно важная роль, которую играют транспозоны и вообще транспонируемые элементы в эволюции живой материи. Транспозоны, как и IS-элементы, обозначают порядковым номером: Tn1, Tn2, Tn3 и т. д.

Эписомы. К эписомам относятся еще более крупные и сложные саморегулирующиеся системы, содержащие IS-элементы и транспозоны и способные реплицироваться в любом из двух своих альтернативных состояний – автономном или интегрированном – в хромосому клетки-хозяина.

К эписомам относят различные умеренные лизогенные фаги; они отличаются от всех других транспонируемых элементов наличием собственной белковой оболочки и более сложным циклом репродукции. Собственно эписомы – это вирусы, обладающие, подобно другим транспонируемым элементам, способностью в интактной форме переходить из одного генома в другой.

Таким образом, природа использовала все возможности, вытекающие из особенностей структуры ДНК, для эволюции живой материи: мутации генов, их дупликации, генетические рекомбинации и мобильность некоторых генетических элементов.

Хромосомная карта бактерий

Хромосомы бактерий, как правило, имеют кольцевидную структуру. Исключение составляют Borrelia burgdorferi и некоторые фитопатогенные бактерии – у них хромосомы линейные. Гены во всех хромосомах располагаются линейно, и их последовательность можно установить. Это позволит создать генетическую энциклопедию бактерий и других организмов, т. е. связать все жизненные процессы с конкретными генами. Хромосомную карту у E. coli начали составлять, изучая время переноса генов при конъюгации, которую прерывают через разные промежутки времени. Поэтому локализацию генов на хромосоме определяют в минутах их переноса от 0 до 100 мин (время полного переноса хромосомы у E. coli). За начало переноса условно принято положение гена thr (треонинового оперона). Определение локализации генов на хромосоме называется их картированием, а их расположение – хромосомной картой, масштаб которой выражается в минутах (рис. 49). К 1961 г. у E. coli было картировано 60 генов, а к 1988 г. – уже более 1000. Одновременно проводилось картирование генов и у других микроорганизмов.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 49. Сокращенная хромосомная карта E. coli K-12


Изучение организации геномов

В настоящее время изучение геномов не ограничивается только картированием генов, стало возможным изучать последовательность расположения нуклеотидов в составе любого гена. Решающими шагами на пути к решению этой проблемы явились применение особых ферментов – рестрикционных эндонуклеаз – и разработка метода клонирования генов.

Рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы) – ферменты, расщепляющие ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей, которые они распознают. Эти ферменты обнаружены у многих бактерий. Они распознают и разрушают чужеродные молекулы ДНК, попадающие в клетку, в том числе при инфицировании их фагами или при трансформации. Таких ферментов обнаружено более 100, и каждый из них распознает в ДНК специфическую последовательность из 4 – 6 нуклеотидов. Каждая рестриктаза способна разрезать двойную спираль ДНК любой длины. При этом образуется серия фрагментов, называемых рестрикционными фрагментами. Сравнение размеров этих фрагментов, полученных при обработке бактериальных или плазмидных геномов (а также ДНК хромосом эукариот), позволяет создавать рестрикционные карты, в которых отмечается локализация каждого разреза участка относительно соседних участков других таких разрезов (рестрикций). Существенно, что многие рестриктазы вносят разрывы в обе цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов. Вследствие этого на конце нити одного фрагмента образуется участок, нуклеотидные последовательности которого оказываются комплементарными нуклеотидным последовательностям другой нити с другого конца фрагмента. Такие концевые последовательности, комплементарные друг другу, получили название липких концов. С их помощью образовавшиеся рестрикционные фрагменты будут вновь образовывать кольца в результате спаривания липких концов.

Способность рестрикционных нуклеаз разрезать ДНК с образованием липких концов широко используется в технологии создания рекомбинантных ДНК, так как при помощи липких концов можно соединить два любых фрагмента ДНК, если они получены с помощью одной и той же рестриктазы и, следовательно, имеют комплементарные липкие концы. После замыкания последних путем образования комплементарных пар оснований образовавшееся кольцо из фрагментов разных ДНК можно сшить ковалентными фосфодиэфирными связями между противоположными концами каждой нити ДНК с помощью ДНК-лигазы. В этом заключается суть технологии получения рекомбинантных молекул ДНК.

Метод клонирования состоит в том, что выделенный фрагмент ДНК (ген) с помощью технологии создания рекомбинантных молекул вводится в состав самореплицирующейся генетической структуры. Чаще всего для этого используются плазмиды или вирусы. При использовании плазмид в качестве векторов для клонирования молекулы плазмидной ДНК разрезают рестриктазой, а затем сшивают с фрагментом ДНК – геном, который подлежит клонированию, т. е. накоплению. Затем такие гибридные плазмиды выделяют из клеток и, обрабатывая той же рестриктазой, вырезают из них копии исходного гена. Таким способом можно получить большое количество любого гена. Уже разработаны технологии производства трансгенных растений и животных и даже клонирования животных. Однако использовать эти достижения, конечно, нужно, только если они не причинят ущерба здоровью человека и благополучию человечества.

Последовательность расположения нуклеотидов в клонированном фрагменте ДНК изучают с помощью особой технологии секвенирования, суть которой состоит в одновременном разрезании специфическими агентами четырех образцов одной и той же ДНК по каждому из четырех оснований (А, Т, Ц и Г) с последующим разделением образующихся фрагментов в геле. С помощью этой методики можно определить полную нуклеотидную последовательность (НП) любого гена, а на основе генетического кода – аминокислотную последовательность соответствующего белка. Разработка и совершенствование методов клонирования и секвенирования позволяют изучить геном любого организма, в том числе и человека. Ранее всего был изучен геном бактериального вируса φХ174. Он состоит из 5400 нуклеотидов и содержит 9 генов. Высочайшая эффективность созданного природой генетического кода видна из следующего сопоставления. Вирус φХ174 можно увидеть только с помощью электронного микроскопа, а запись его генетической информации, содержащейся в 9 генах, в виде линейной последовательности через буквы (А, Т, Г, Ц) занимает целую страницу текста. Запись в таком же виде информации, имеющейся в хромосоме животной клетки, составит книгу объемом более 500 000 страниц!

Уже полностью изучена н. п. хромосомных ДНК у более чем сотни микроорганизмов, включая Escherichia coli, Yersinia pestis, Mycobacterium tuberculosis и др. Хромосома E. coli К-12 состоит из 4 639 000 п. н. (4288 генов), из них на кодирующую часть генома приходится 88,6 %. У других бактерий доля кодирующей части генома варьирует от 85 до 91 %. Средний размер гена – 1 к. б., у E. coli – 0,951 к. б. Хотя на некодирующие НП приходится малая часть генома, роль их, в особенности IS-элементов, транспозонов и т. п., в некоторых генетических процессах очень велика. Есть в геноме бактерий и «серые дыры», т. е. НП с неизвестной функцией. Большая чать оперонов у E. coli состоит не более чем из 3 генов, лишь 6 % оперонов состоят из 4 и большего числа генов. В хромосомах разных видов бактерий обнаружены гены-гомологи, т. е. гены с идентичной последовательностью нуклеотидов. Идентичные (=гомологичные) гены у разных видов называют ортологами. Например, около 1000 генов Bacillus subtilis имеют ортологов в геноме E. coli. Наличие ортологов – доказательство общности происхождения видов.

Для изучения генома человека, которое началось в 80-х гг. ХХ в., была создана международная организация по изучению генома человека – HUGO (англ. Human Genome Organization – Организация генома человека). Ее основная задача – определить последовательное расположение всех нуклеотидов (а их около 3 ⋅ 109 пар) во всех 23 парах хромосом – была успешно решена к концу 2000 г. Предстоит теперь выяснить функции всех генов, молекулярные основы наследственных и иных болезней, связанных с нарушением работы генов, и определить пути лечения таких болезней, в том числе с использованием методов генной инженерии. Рано или поздно генотерапия станет вполне реальной. Полное осуществление программы «Геном человека» – новое блестящее достижение науки в области биологии и медицины.

Глава 14

Плазмиды бактерий как наипростейшие организмы

Впервые обнаруженные у E. coli генетические элементы, которые передавались у нее по наследству во внехромосомном состоянии, получили название просто генетических факторов. Раньше всего были обнаружены Col-фактор (фактор, контролирующий у E. coli синтез бактерицидных белков, А. Грациа, 1925) и F-фактор (фактор, контролирующий примитивный половой процесс у бактерий – конъюгацию, У. Хэйс, 1953). Интерес к этим факторам сильно возрос после того, как в 1963 г. японский ученый Т. Ватанабе сообщил, что передача множественной лекарственной устойчивости у дизентерийных бактерий происходит также при участии независимых от хромосомы генетических элементов, названных R-факторами (англ. resistance – устойчивость). В 1976 г. всем подобного рода генетическим элементам было дано название плазмид и следующее определение: «Плазмида (экстрахромосомный генетический элемент) представляет собой репликон, который стабильно наследуется в экстрахромосомном состоянии». Однако это определение обходит вопрос о том, являются ли плазмиды организмами или нет, оно оставляет открытым вопрос о месте плазмид в живой природе.

Поскольку плазмиды имеют собственные гены, которые наделяют их специфическими наследственными признаками и способностью к размножению, они должны быть несомненно отнесены к живым организмам. Плазмиды обладают большим сходством с вирусами, поэтому их следует объединить с ними в одно царство в качестве самостоятельного класса. С вирусами их объединяют следующие общие фундаментальные признаки: 1) подобно вирусам, плазмиды не имеют собственной белоксинтезирующей системы; 2) как и у вирусов, у них нет собственной системы мобилизации энергии; 3) плазмиды, как и вирусы, не способны к росту и бинарному делению, они размножаются путем воспроизведения себя из собственного генома (путем саморепликации его); 4) плазмиды, подобно вирусам, являются абсолютными внутриклеточными паразитами.

Вместе с тем плазмиды существенным образом отличаются от вирусов, и поэтому они должны рассматриваться как самостоятельная, обособленная от вирусов группа организмов. Главные отличия плазмид от вирусов следующие:

1. Геном плазмид представлен только двунитевой ДНК, у вирусов же имеется более 10 вариантов РНК– и ДНК-геномов. Правда, у некоторых грамположительных бактерий плазмиды существуют не только в виде двунитевых молекул ДНК, но и в виде однонитевых. Однако каждая из них соответствует одной из двух нитей плазмидной ДНК (на долю таких однонитевых молекул приходится не более 1/3 общего количества копий плазмиды), и в результате репликации, происходящей по типу «крутящегося кольца» (см. главу 11), однонитевая молекула превращается в двунитевую молекулу плазмидной ДНК.

2. Плазмиды, в отличие от вирусов и других микроорганизмов, вообще не имеют никакой оболочки. Они представляют собой «голые» геномы. Это их главная биологическая особенность.

3. В связи с отсутствием белковой оболочки размножение плазмид происходит только путем саморепликации их ДНК и не требует синтеза структурных белков и процессов самосборки.

4. Средой обитания вирусов являются клетки бактерий, растений и животных. Средой обитания плазмид – только бактерии.

5. Плазмиды обладают системами генов, которые наделяют их способностью к самопереносу или к мобилизации на перенос из клетки в клетку.

6. Плазмиды и вирусы отличаются друг от друга и по тем последствиям, к которым приводит инфицирование ими клеток. Заражение вирусами в большинстве случаев приводит к подавлению функционирования клеточного генома. Вирулентный вирус размножается в клетке и вызывает ее гибель или нарушает нормальное функционирование (при персистировании). Только умеренные фаги при лизогенизации бактерий наделяют их дополнительными свойствами.

В отличие от вирусов, плазмиды, проникая в бактериальную клетку, не размножаются в ней бесконтрольно и не подавляют функции бактериальной хромосомы, а сосуществуют с ней и сами контролируют образование числа возможных своих копий на хромосому клетки. В отличие от вирусов, плазмиды не только не вызывают гибели клеток, которые являются для них естественной средой обитания, а, наоборот, очень часто наделяют их важными дополнительными (селективными) свойствами. Это основное принципиально важное биологическое различие между плазмидами и вирусами. Зараженная вирусом клетка ценой собственной жизни способствует размножению вирусов. Плазмиды, наоборот, своим присутствием обеспечивают размножение бактерий в неблагоприятных для них условиях (например, в присутствии химиопрепаратов) и, спасая от гибели бактерии, обеспечивают собственное существование.

По уровню молекулярно-генетической организации плазмиды занимают еще более низкое, по сравнению с вирусами, место в иерархии живой материи. С учетом всех этих обстоятельств им можно дать следующее общебиологическое определение: плазмиды – наипростейшие организмы, лишенные оболочки, собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии и представляющие собой особый класс абсолютных внутриклеточных паразитов, наделяющих своих бактерий-хозяев полезными для них свойствами (А. И. Коротяев).

В соответствии с теми свойствами, которыми плазмиды наделяют своих носителей, их подразделяют на различные группы (табл. 4).

У бактерий очень часто обнаруживают криптические плазмиды, т. е. плазмиды, функции которых еще не установлены. Поэтому классификация их, несомненно, будет уточняться. Уже сейчас известны плазмиды, контролирующие различные факторы патогенности бактерий (факторы адгезии, инвазии и т. п.).

Существуют два основных способа определения плазмид у бактерий:

1) биологический – по тем дополнительным признакам, которыми они наделяют своего хозяина;

2) биофизический – по выявлению плазмидных ДНК.

Для изучения биологии плазмид и их молекулярно-генетической организации широко используют различные генетические методы, методы клонирования, выделения чистых плазмидных ДНК, определения их молекулярных масс, составление рестриктограмм путем разрезания различными эндонуклеазами и определения размеров получаемых фрагментов, а также секвенирования. Сами по себе плазмиды, благодаря их относительно малым размерам и способности к саморепликации, часто используются в качестве векторов для клонирования различных генов и их последующего изучения.

Все известные плазмиды представляют собой кольцевидные суперспирализованные молекулы двунитевой ДНК, размеры которых варьируют от 1,5 до 200 МД и более (от 1500 до 400 000 пар нуклеотидов). Однако чаще всего встречаются плазмиды с м. м. 3 – 6 или 50 – 70 МД.


Таблица 4

Классификация плазмид по свойствам, которыми они наделяют своих носителей

Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

В соответствии с размерами плазмидной ДНК ее молекулярно-генетическая организация характеризуется определенным уровнем сложности. Чем больше молекулярная масса, тем больше и сложнее набор генов, тем многообразнее функции плазмид. Они несут гены саморепликации; гены, контролирующие самоперенос или мобилизацию на перенос; другие гены, определяющие специфические функции самой плазмиды.

Кроме того, в ДНК плазмид могут быть гены, которые наделяют клетку-хозяина многими другими свойствами. Очень часто эти гены интегрируются в плазмидную ДНК в виде транспозонов, поэтому молекулярно-генетическая организация плазмид, особенно высокомолекулярных, очень сложна. Часть генетической карты одной из наиболее часто используемых для изучения генетики плазмид – плазмиды рКМ101, представлена на рис. 50. Для плазмид как живых существ характерны следующие свойства, частью присущие только им и контролируемые их специфическими генами:

1. Саморегулируемая репликация. Эта функция свойственна всем живым организмам. В составе плазмидных ДНК имеются фиксированная точка ori (точка начала репликации) и соответствующие гены, контролирующие репликацию. Репликация мелких плазмид требует, очевидно, дополнительного участия генов клетки-хозяина.

2. Явление поверхностного исключения. Этот механизм не позволяет проникнуть в клетку, уже содержащую плазмиду, другой родственной ей плазмиде. Поверхностное исключение обеспечивается синтезом под контролем генов плазмиды особых белков наружной мембраны, которые препятствуют установлению контакта этой клетки с клеткой, несущей такую же плазмиду, или подавляют конъюгативный метаболизм ДНК этой плазмиды.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 50. Молекулярная организация плазмиды pKM101. Конъюгативная плазмида pKM101 IncN-группы является производной плазмиды R46, у которой утрачена область генов, контролирующая устойчивость к антибиотикам. Широко используется для изучения механизмов генетической регуляции плазмидных функций


3. Явление несовместимости. Суть его заключается в том, что две близкородственные плазмиды не могут стабильно сосуществовать в одной клетке, одна из них подвергается элиминации (удалению).

4. Контроль числа копий плазмиды на хромосому клетки. Различают малокопийные (1 – 4 копии) и многокопийные плазмиды (12 – 38 копий, например у плазмиды R6K). Наличие собственных генов репликации позволяет плазмиде осуществлять последнюю независимо от каких-либо событий хромосомной репликации или клеточного цикла клетки-хозяина.

Информация, необходимая для осуществления репликации плазмиды, обычно заключена в небольшой участок ее ДНК, получивший название основного, или базового, репликона. У малокопийных плазмид он состоит из 2,0 – 2,5 т. п. н., а у многокопийных – из 1 т. п. н. Система, которая регулирует репликацию, контролирует также и число копий, и явление несовместимости. Этот контроль осуществляется путем саморегуляции процессов транскрипции и трансляции генов репликации, опосредуемой продуктами их собственных генов: «антисмысловыми» РНК и особыми белками.

5. Контроль стабильного сохранения плазмид в клетке-хозяине (контроль стабильного поддержания).

6. Контроль равномерного распределения дочерних плазмид в дочерние бактериальные клетки. Последние две функции тесно взаимосвязаны. Природные бактериальные плазмиды стабильно сохраняются в клетке-хозяине. Это указывает на то, что их распределение между дочерними клетками происходит не рандомически, т. е. не по принципу случайности, а существует генетический механизм контроля не только репликации, но и равномерного распределения (сегрегации) вновь синтезированных плазмид при клеточном делении. Гены, осуществляющие этот контроль, независимы от системы контроля репликации. Более того, эти гены даже взаимозаменяемы у разных плазмид без утраты своих функций. Функции стабильного поддержания и равномерного распределения опосредуются различными механизмами. Взаимосвязь этих функций с жизнью клеткихозяина настолько важна для плазмид и клеток, что клетки, утратившие плазмиду, погибают. Плазмида «вынуждает» клетку-хозяина даже ценой собственной жизни обеспечивать ее воспроизводство и распространение по вертикали и горизонтали. У F-плазмиды обнаружены гены типа hok (англ. host killing – убивающие хозяина), продукты которых вызывают быструю гибель клетки, утратившей плазмиду (в содержащих плазмиды клетках действие этих продуктов репрессировано другим геном плазмиды). Следовательно, носительство плазмид для клетки-хозяина становится генетически необходимым, благодаря этому обеспечивается существование плазмид как организмов.

7. Способность к самопереносу (у конъюгативных плазмид).

8. Способность к мобилизации на перенос (у неконъюгативных плазмид).

9. Способность наделять клетку-хозяина дополнительными важными для него биологическими свойствами, способствующими выживанию бактерий, а следовательно, и плазмид в природе.

Жизненный цикл плазмид складывается из двух главных процессов: вегетативной (или конъюгативной) репликации и равномерного распределения между дочерними клетками. Оба эти процесса относительно независимы друг от друга и контролируются специфическими системами плазмид. Однако вегетативная репликация плазмид и распределение их между дочерними клетками скоординированы с клеточным делением так, что дочерняя клетка стабильно получает необходимое число копий данной плазмиды.

Распространение плазмид

Плазмиды распространяются среди бактерий двумя способами: путем передачи от родительской клетки дочерним клеткам в процессе клеточного деления, т. е. по вертикали, и путем переноса между клетками в популяции бактерий независимо от клеточного деления, т. е. по горизонтали. Существует несколько генетических механизмов переноса плазмид между бактериальными клетками:

а) путем трансформации;

б) с помощью трансдуцирующих фагов;

в) путем мобилизации на перенос с помощью конъюгативных плазмид;

г) с помощью механизма самопереноса, контролируемого системой генов, объединенных в tra-оперон.

В зависимости от наличия или отсутствия этого оперона плазмиды делятся на конъюгативные и неконъюгативные. Основную роль в широком распространении плазмид играет механизм конъюгационной передачи.

Системы tra-оперонов у разных конъюгативных плазмид имеют определенное сходство, что свидетельствует о том, что они возникли, очевидно, из одного общего предшественника. Однако у разных конъюгативных плазмид они существенно различаются как по количеству tra-генов, так и по характеру их локализации (рис. 51; см. рис. 50). Наиболее подробно система tra-оперона изучена у F-плазмиды, которая является наиболее типичным представителем конъюгативных плазмид. Ее главное биологическое назначение у энтеробактерий – обеспечение их донорными функциями. Именно F-плазмиды контролируют у них конъюгативный обмен генетическим материалом. F-плазмида состоит из 94,5 тыс. пар нуклеотидов и имеет около 90 генов (см. рис. 51). Система tra-генов у F-плазмиды имеет следующий состав: oriT finO traO traM finP traJ traY traA traL traE traK traB traP traV traW traC traU traN traF traQ traH traG traS traT traD traI traZ.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 51. Генетическая карта F-плазмиды


Область oriТ – точка начала переноса F-плазмиды при конъюгации. Гены traY – traZ (21 ген) образуют оперон переноса. Область traJ finP traM traO finO участвует в регуляции транскрипции и конъюгативного метаболизма ДНК плазмиды; traО – оператор для гена traJ (белок TraJ участвует в позитивной, а белок FinP вместе с finO – в негативной регуляции tra-оперона). Продукты генов traT и traS опосредуют поверхностное исключение. В системе tra-генов F-плазмиды три самостоятельных оперона: traY – traZ, traJ finP и traM.

Классификация плазмид

В основу современной классификации плазмид положено такое их уникальное генетическое свойство, как несовместимость – неспособность родственных плазмид стабильно сосуществовать в одной клетке. Она проявляется после проникновения плазмиды в клетку, уже содержащую близкородственную ей плазмиду.

Плазмиды, несовместимые друг с другом, но совместимые с другими, объединяются в одну Inc-группу (англ. incompatibility – несовместимость); Inc-группа соответствует биологическому виду в других группах организмов. Плазмиды энтеробактерий разделены на 39 Inc-групп (табл. 5).

Многочисленными наблюдениями установлено, что плазмиды, относящиеся к одной и той же Inc-группе, обладают многими общими признаками, в то время как плазмиды, принадлежащие к разным Inc-группам, существенно отличаются по свойствам. В частности, плазмиды одной и той же группы имеют сходную молекулярную массу, высокую степень гомологии ДНК, показывают одинаковые или очень сходные рестриктограммы при обработке их соответствующими рестриктазами. Плазмиды одной и той же группы наделяют клетку способностью синтезировать морфологически подобные и серологически родственные донорные ворсинки, которые не только служат аппаратом конъюгационного переноса плазмид, но и являются специфическими рецепторами для донорспецифических фагов. Такие фаги прикрепляются либо к кончикам ворсинок, либо по их сторонам и вызывают лизис плазмидсодержащих клеток. О близком родстве плазмид, принадлежащих к одной и той же Inc-группе, свидетельствует также изучение их физических и генетических карт. В частности, области репликации плазмид, относящихся к одной и той же Inc-группе, также очень сходны структурно и функционально. Поскольку внутри Inc-групп выявляется тесное филогенетическое родство между ее членами, группа несовместимости как таксономическая единица приравнивается к такой категории как вид. Принадлежность выявленных плазмид к той или иной Inc-группе определяется с помощью метода ДНК-зонда; донорспецифических фагов, а также путем конъюгации бактерий, несущих прототипные плазмиды, с бактериями, несущими исследуемую плазмиду, и последующего установления факта их сосуществования (совместимости) или вытеснения одной из них (несовместимости). Обязательным условием для последнего метода является наличие селективных признаков у каждой из скрещиваемых бактерий – хозяев этих плазмид. Селективными являются признаки, которыми плазмида специфически наделяет клетку-хозяина.


Таблица 5

Inc-группы, выявленные среди плазмид энтеробактерий

Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Медицинское и общебиологическое значение плазмид

Значение плазмид для медицины состоит в том, что они контролируют синтез различных факторов патогенности у многих видов бактерий, в том числе у возбудителей чумы, сибирской язвы, иерсиниозов, дизентерии, эшерихиозов и др. Не вызывает сомнения, что возникновение диареегенных кишечных палочек (энтеротоксигенных, энтеропатогенных, энтероинвазивных и др.) является следствием приобретения ими плазмид, которые наделяют их факторами адгезии, инвазии и способностью синтезировать термолабильные и термостабильные энтеротоксины. Наличие в природе таких плазмид (особенно с широким кругом хозяев) может стать причиной образования новых вариантов патогенных бактерий.

Не менее важную роль играют R-плазмиды. В условиях широкого применения антибиотиков и других химиопрепаратов происходит естественный отбор тех штаммов патогенных бактерий, которые являются носителями R-плазмид. Среди них формируются новые эпидемические клоны патогенных бактерий. В настоящее время они играют ведущую роль в эпидемиологии инфекционных болезней, и от их распространения во многом зависит эффективность антибиотико– и химиотерапии, а в итоге – здоровье и жизнь людей.

Общебиологическое значение плазмид заключается в том, что они выполняют по крайней мере три важнейшие функции для бактерий, обеспечивая одновременно существование как бактерий, так и собственное. Во-первых, они контролируют у бактерий обмен генетическим материалом. Во-вторых, контролируя синтез факторов патогенности, они обусловливают благоприятные возможности для размножения патогенных бактерий в естественных для них условиях (в организме животного и человека), а следовательно, для сохранения этих видов в природе. В-третьих, плазмиды являются уникальным биологическим средством самозащиты бактерий, так как они обеспечивают их приобретенным и наследуемым специфическим иммунитетом против различных химических (лекарственных и иных веществ) и других агентов.

Таким образом, представляя собой особую группу наиболее просто организованных живых существ, плазмиды сохраняются в природе благодаря взаимовыгодным отношениям, сложившимся между ними и бактериями. Бактерии для них – естественная среда обитания, а они для бактерий – дополнительные свободно циркулирующие между ними геномы с наборами таких генов, которые благоприятствуют сохранению бактерий в природе.

Часть третья

МИКРОФЛОРА БИОСФЕРЫ

Глава 15

Распространение микробов в природе и роль их в обеспечении динамического равновесия биосферы

«Мириады микробов населяют стихии и повсюду окружают нас. Незримо они сопутствуют человеку на всем его жизненном пути, властно вторгаясь в его жизнь то в качестве врагов, то как друзья. В громадном количестве они встречаются в пище, которую мы принимаем, в воде, которую пьем, и в воздухе, которым мы дышим. Окружающие нас предметы, наша одежда, поверхность нашего тела, все это буквально кишит микробами, среди которых встречаются и болезнетворные виды», – так образно охарактеризовал микрофлору, которая нас окружает, выдающийся русский микробиолог В. Л. Омелянский. По-видимому, в биосфере нет такой среды, в которой не встречались бы микроорганизмы. Всюду, где есть хотя бы какие-то источники энергии, углерода и азота, обязательно встречаются и микроорганизмы, различающиеся по своим физиологическим потребностям и свойствам. Именно это разнообразие, в основе которого лежит способность использовать любые, даже минимальные возможности для своего существования, исторически обусловило вездесущность микроорганизмов. С другой стороны, активная жизнедеятельность мириадов микроорганизмов, их гигантская роль в круговороте веществ в природе имеют исключительное значение для поддержания (сохранения) динамического равновесия всей биосферы, нарушение которого привело бы к катастрофическим последствиям.

Естественной средой обитания микроорганизмов служат в первую очередь почва, вода и воздух. Они заселяют также кожные покровы и сообщающиеся с внешней средой слизистые оболочки человека и животных.

Везде и всюду микроорганизмы сосуществуют в виде сложных ассоциаций – биоценозов, представленных многими и разнообразными видами, между которыми складываются своеобразные взаимоотношения. Особенности этих взаимоотношений таковы, что они обеспечивают существование всех многочисленных видов бактерий и в конечном счете всего царства прокариот, которое, в свою очередь, сосуществует с другими царствами жизни на Земле.

Микрофлора почвы

Почва – среда обитания многочисленных видов микроорганизмов и крупнейший резервуар их в природе. Количество микробов в 1 г почвы измеряется обычно сотнями и тысячами миллионов клеток. Оно варьирует от 200 млн в глинистой почве до 5 млрд в черноземной почве. В 1 г пахотного слоя почвы содержится 1 – 10 млрд бактерий, а в слое ее толщиной 15 см на площади в 1 га может содержаться от 1 до 5 – 6 тонн микробной массы. Даже в песках пустынь, где почти отсутствует влага, содержится до 100 000 микробов в 1 г. Численность и видовой состав их в почве зависят от содержания в ней органических веществ и влаги, структуры почвы, способа ее сельскохозяйственной обработки, климатических условий, характера растительного покрова, степени загрязнения почвы отходами хозяйственной деятельности человека и многих других факторов. Состав микрофлоры почвы складывается из различных комбинаций бактерий (сотни и тысячи видов), грибов, простейших и вирусов. Фактически она содержит представителей всех царств жизни – вирусов, архебактерий, эубактерий и эукариот во всем их многообразии, которое зависит от действия многих факторов.

Самый поверхностный слой почвы содержит ограниченное число микробов из-за действия солнечных лучей и высушивания. Главная масса микробов содержится на глубине 10 – 20 см, в нижележащих ее горизонтах количество микроорганизмов уменьшается, и на глубине 5 – 6 метров почва может быть уже стерильной, так как распространению микробов в глубину препятствует высокая поглотительная способность почвы.

Почва постоянно загрязняется различными отбросами, выделениями человека и животных, мертвыми растениями и животными. Огромная роль в процессах самоочищения почвы и в круговороте веществ в природе принадлежит микроорганизмам. В превращении органических веществ, поступающих в почву и образующихся в ней, принимают участие различные группы микробов: гнилостные, нитрифицирующие, азотфиксирующие, денитрифицирующие и др.

Патогенные микроорганизмы попадают в почву с испражнениями, мочой, гноем, мокротой, слюной и другими выделениями, с трупами людей и животных, погибших от инфекционных заболеваний. Попадая в почву, значительная часть патогенных микроорганизмов, не образующих спор, рано или поздно погибает. Сроки выживания в почве возбудителей кишечных инфекций (дизентерии, брюшного тифа, холеры), чумы, бруцеллеза, туляремии, туберкулеза широко варьируют и составляют от нескольких часов до нескольких месяцев. Отмирание патогенных бактерий в почве зависит от ряда причин: высушивания; отсутствия необходимых питательных субстратов; действия антибиотических веществ, вырабатываемых почвенными бактериями и грибами; солнечных лучей; бактериофагов и т. п. Значительно дольше в почве сохраняются спорообразующие патогенные бактерии – аэробные (споры B. anthracis сохраняются в почве свыше 15 лет) и анаэробные – возбудители столбняка, газовой гангрены, ботулизма (их споры также сохраняются в почве многие годы, а при благоприятных условиях прорастают и бактерии размножаются, поддерживая тем самым свое существование в почве). Поэтому почва играет основную роль в эпидемиологии столбняка, газовой гангрены (особенно в военных условиях) и ботулизма, она является основным резервуаром возбудителей этих заболеваний.

Микрофлора воды

Вода, как и почва, является естественной средой обитания для многих видов микроорганизмов всех царств жизни. Разнообразные микроорганизмы обитают как в воде открытых водоемов, так и в грунтовых водах: палочки, кокки, вибрионы, спириллы, спирохеты, различные фотосинтезирующие бактерии, грибы, простейшие, вирусы и плазмиды. Многие виды галофильных бактерий обитают в морских водах. Численность микроорганизмов в воде определяется главным образом содержанием в ней органических веществ, которые под влиянием микроорганизмов подвергаются совершенно таким же превращениям, как и в почве. В 1 мл воды количество микробов может превышать несколько миллионов. Грунтовые подземные воды чище, так как, просачиваясь через почву, вода подвергается своеобразной фильтрации, в результате которой большинство микробов задерживается в фильтрующем слое. Численность микроорганизмов в воде открытых водоемов подвержена колебаниям и зависит от климатических условий, времени года, а главным образом, от степени загрязнения рек, озер и морей сточными и канализационными водами и отходами промышленных, агропромышленных и других предприятий. В реки, озера, моря из прибрежных городов и других населенных пунктов выбрасывается такое количество сточных вод, несущих мириады микробов и содержащих огромное количество органических веществ, что вода не успевает самоочищаться.

В результате возникла и сохраняется серьезная глобальная экологическая проблема.

По степени микробного загрязнения различают три категории воды (или зоны водоема):

1. Полисапробная зона – наиболее сильно загрязненная вода, бедная кислородом, богатая органическими веществами. В 1 мл воды содержание микроорганизмов достигает 1 млн и более, преобладают E. coli и анаэробные бактерии, вызывающие процессы гниения и брожения.

2. Мезосапробная зона – вода, загрязненная умеренно, в ней активно происходит минерализация органических веществ с интенсивными процессами окисления и нитрификации. Содержание микроорганизмов в 1 мл воды – сотни тысяч бактерий, количество E. coli значительно меньше.

3. Олигосапробная зона – зона чистой воды, количество микроорганизмов в 1 мл воды – десятки или сотни, не более; E. coli отсутствует или встречается в количестве нескольких клеток на 1 л воды.

Питьевая вода считается хорошей, если общее количество бактерий в 1 мл – не более 100; сомнительной – 100 – 150; загрязненной, – если содержание бактерий в 1 мл 500 и более. Количество микроорганизмов в придонном слое ила озер и рек варьирует в пределах от 100 до 400 млн на 1 г.

Вода играет исключительно важную роль в эпидемиологии многих инфекционных заболеваний, особенно кишечных (брюшного тифа, дизентерии, сальмонеллезов, холеры, вирусных гепатитов, полиомиелита и т. п.), возбудители которых выделяются вместе с испражнениями от больных и носителей и вместе со сточными водами поступают в воду открытых водоемов, а оттуда нередко и в питьевую воду. Хотя патогенные бактерии слабо приспособлены к существованию в воде, где на них оказывают неблагоприятное действие солнечный свет и различные другие факторы, включая конкурентную водную микрофлору, многие из них могут достаточно длительное время сохраняться в воде. Более того, в летнее время при наличии в воде органических веществ, щелочной рН и благоприятной температуры некоторые из них, в том числе холерный вибрион, могут даже размножаться. Заразиться можно и через лед, в котором патогенные бактерии могут сохраняться в течение нескольких недель и даже месяцев.

Загрязненная вода – главный источник заражения холерой, дизентерией, брюшным тифом и другими кишечными инфекциями, а также лептоспирозом и, нередко, туляремией.

Микробиологические методы исследования воды сводятся к определению общего количества микроорганизмов в 1 мл воды и выявлению тех или иных видов патогенных бактерий (особенно холерного вибриона). Кроме того, поскольку прямое выделение патогенных бактерий из воды требует специальных исследований, существуют косвенные методы, позволяющие дать количественную оценку степени фекального загрязнения воды (см. раздел «Санитарная микробиология и ее значение», гл. 16).

Микрофлора воздуха

Воздух как среда обитания для микроорганизмов менее благоприятен, чем почва и вода, так как в нем не содержится или содержится очень мало питательных веществ, необходимых для размножения микроорганизмов. Кроме того, на них сильнее действуют такие неблагоприятные факторы, как высушивание и ультрафиолетовые лучи солнечного света. Тем не менее, попадая в воздух, многие микроорганизмы могут сохраняться в нем более или менее длительное время. Воздух особенно загрязнен вблизи земной поверхности, а с высотой он становится все более чистым. На степень загрязнения воздуха микробами влияют и климато-географические условия. Больше всего микробов в атмосфере содержится летом, меньше всего – зимой. Главным источником загрязнения воздуха является почва, в меньшей степени – вода.

В воздухе в естественных условиях обнаруживаются сотни видов сапрофитных микроорганизмов, представленных кокками (в том числе сарцинами), споровыми бактериями и грибами, отличающимися большой устойчивостью к высушиванию и к другим неблагоприятным воздействиям внешней среды, например действию солнечных лучей. Нужно различать воздух открытых пространств (он относительно чист, так как сказывается действие солнечных лучей, высушивания и других факторов) и воздух закрытых помещений. В последних факторы самоочищения действуют слабее, поэтому и загрязненность может быть значительно больше. В воздухе закрытых помещений, особенно если они плохо проветриваются, накапливается микрофлора, выделяемая через дыхательные пути человека. Патогенные микроорганизмы попадают в воздух из мокроты и слюны при кашле, разговоре и чихании. Даже здоровый человек при каждом акте чихания выделяет в воздух 10 000 – 20 000 микробных тел, а больной – иногда во много раз больше.

Заслуга выяснения механизма передачи возбудителей заболеваний через воздух принадлежит П. Н. Лащенкову. Он одним из первых установил, что при чихании, кашле и разговоре в воздух выбрасывается множество капелек жидкости, внутри которых содержатся микроорганизмы. Особенно важно, что эти мельчайшие капельки могут часами удерживаться в воздухе во взвешенном состоянии, т. е. образуют стойкие аэрозоли. В этих капельках за счет влаги микроорганизмы выживают дольше. Таким воздушно-капельным способом происходит заражение многими острыми респираторными заболеваниями, в том числе гриппом и корью, а также коклюшем, дифтерией, легочной чумой и т. д. Этот путь распространения возбудителей – одна из основных причин развития не только эпидемий, но и крупных пандемий гриппа, а в прошлом и легочной чумы.

Помимо капельного способа, распространение патогенных микробов через воздух может осуществляться «пылевым» путем. Находящиеся в выделениях больных (мокроте, слизи и т. п.) микроорганизмы окружены белковым субстратом, поэтому они более устойчивы к высыханию и другим факторам. Когда такие капли высыхают, они превращаются в своеобразную бактериальную пыль (внутри белкового субстрата сохраняются и выживают многие патогенные бактерии). Частички бактериальной пыли имеют обычно диаметр от 1 до 100 мкм. У частиц диаметром более 100 мкм сила тяжести превышает сопротивление воздуха, и они быстро оседают. Скорость переноса бактериальной пыли зависит от интенсивности сил воздушных перемещений. Пылевой путь играет особенно важную роль в эпидемиологии туберкулеза, дифтерии, туляремии и других заболеваний.

Количество микробов в воздухе варьирует в больших диапазонах – от нескольких бактерий до десятков тысяч их в 1 м3. В 1 г пыли может содержаться до 1 млн бактерий. Большое значение имеет чистота воздуха в операционных, реанимационных и перевязочных отделениях хирургических госпиталей. Общее количество микробов в операционной до операции не должно превышать 500 в 1 м3, а после операции – 1000 в 1 м3.

Для исследования микрофлоры воздуха используют различные методы: седиментационный (метод Коха), фильтрационный (воздух продувают через воду) и методы, основанные на принципе ударного действия воздушной струи с использованием специальных приборов (В. С. Киктенко, Л. М. Соколинского [и др.]). Последние методы наиболее надежны, так как позволяют точно определить количественное загрязнение воздуха микроорганизмами и изучить их видовой состав.

В настоящее время в биотехнологической промышленности широко используются различные микробы-продуценты, в том числе генетически модифицированные формы их. Поскольку эта технология связана с неизбежными периодическими выпусками (интродукциями) в открытую систему (воздух, вода, почва) генетически измененных форм микроорганизмов, возникает важный вопрос об их дальнейшей судьбе и о возможном влиянии на биосферу и человечество. Несомненно, этот вопрос как часть общего вопроса охраны окружающей среды должен решаться в глобальном плане.

Роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе

Предполагается, что в предбиологический период атмосферные газы находились в восстановленном состоянии: азот – в форме аммиака (NH3); кислород – в составе воды (H2O); углерод – в форме метана (СН4). Современное их состояние в виде окисленных форм: азота и кислорода в форме простых газов (N2 и О2), а углерода в виде оксида углерода (СО2) – в значительной степени является следствием активности живых организмов, в том числе микробов. Количественное содержание в атмосфере N2, O2 и СО2, других химических элементов, обнаруженных на поверхности Земли и необходимых для жизни, отражает равновесие между их образованием и использованием в биологических и геологических процессах. Эти превращения происходят во всей биосфере, т. е. в той тонкой оболочке жизни на поверхности Земли, которая охватывает океаны, моря, пресные водоемы, почву континентов и нижнюю часть атмосферы и в которой только и содержатся живые организмы. Общего количества главных химических элементов, необходимых для жизни, в частности углерода и азота, имеющихся в атмосфере, при их одностороннем потреблении вряд ли хватило бы на миллионы лет.

Биосфера находится в более или менее устойчивом состоянии благодаря непрерывному притоку солнечной энергии и постоянному круговороту углерода, кислорода, азота, серы и фосфора. В целом эти процессы выглядят так. С помощью солнечной энергии фотосинтезирующие организмы превращают СО2 и другие неорганические вещества в глюкозу и другие органические соединения, которые прямо или косвенно служат источником энергии для всех других организмов. В свою очередь фотосинтезирующие организмы – одноклеточные водоросли (в основном, диатомовые и динофлагелляты), обитающие в океане, и высшие растения, растущие на суше, – служат источником питания для животных. Поэтому основные биологически важные элементы сохраняются в органическом состоянии в ходе превращений, которые приводят к включению этих элементов в клетки и ткани животных. Чтобы снова стать доступными для фотосинтезирующих организмов, органические вещества должны снова перейти в неорганическую форму, т. е. подвергнуться минерализации. Эти превращения происходят из-за разложения (гниения) растительных и животных остатков, осуществляемого главным образом микроорганизмами. Подсчитано, что минерализация 90 % органического углерода, т. е. превращение его в СО2, осуществляется микроорганизмами. Остальные 10 % СО2 образуются в результате дыхания других организмов, а также за счет сгорания топлива и других материалов. Микроорганизмы, благодаря легкости их расселения по воздуху и воде, распространены по всей биосфере, и вследствие их чрезвычайно высокой метаболической активности они играют главную роль в химических превращениях, которые происходят на поверхности Земли. Подсчитано, что метаболический потенциал микроорганизмов в верхнем 15-сантиметровом слое одного гектара хорошо удобренной почвы в любой момент времени эквивалентен метаболическому потенциалу нескольких десятков тысяч людей.

Другим важным фактором, определяющим роль микроорганизмов в природе, является высокая скорость их размножения при благоприятных условиях.

Под круговоротом веществ в природе понимают циклические превращения химических элементов, из которых построены живые существа, происходящие вследствие разнообразия и гибкости метаболизма микроорганизмов. По-видимому, в природе нет таких органических веществ, которые не разрушались бы теми или иными микроорганизмами.

Круговорот азота и микробы, участвующие в нем

Запасы азота в природе очень велики. Он входит в состав всех организмов на Земле. Общее содержание его в организмах составляет более 25 млрд тонн, большое количество азота находится также в почве. Но еще более грандиозен запас азота в атмосфере: над каждым гектаром почвы поднимается столб воздуха, содержащий около 80 000 тонн молекулярного азота. Ежегодно на образование вновь вырастающих растений требуется около 1,5 млрд тонн азота в форме, доступной для усвоения растениями. Имеющегося в воздухе и почве азота хватило бы для обеспечения урожая, даже при одностороннем использовании, на несколько миллионов лет. Однако растения часто дают низкие урожаи именно из-за недостатка азота в почве. Это объясняется тем, что только небольшая группа азотистых соединений может быть быстро усвоена растениями. Не только свободный азот, но и многие формы связанного азота не могут служить источником азотного питания для растений. Азот, поступающий в виде белковых веществ в почву вместе с остатками растений и животных, совсем не годится для этих целей, он должен быть подвергнут минерализации, а образующийся при этом аммиак должен быть окислен в соли азотистой и азотной кислот. В основе процессов круговорота азота лежат следующие биохимические процессы: гниение белков, разложение мочевины, нитрификация, денитрификация и фиксация атмосферного азота.

Гниение, или аммонификация белков, – микробиологический процесс, при котором под воздействием гнилостных микроорганизмов происходит гидролитическое расщепление белков, поступающих в почву с трупами животных и отмирающими растениями, с образованием промежуточных продуктов (альбумоз, пептонов, амино– и амидокислот), а также дурно пахнущих веществ – индола, сероводорода, меркаптана, летучих жирных кислот.

Конечным продуктом гидролиза белков и дезаминирования аминокислот является NH3, почему этот процесс и называется аммонификацией белка. Таким образом, при гниении происходит минерализация белковых веществ, которая в зависимости от химического состава белков субстрата, вида гнилостных бактерий и условий их жизнедеятельности может быть полной или не доведенной до конца. При полной минерализации белка образуются H2O, CO2, NH3, H2S и минеральные соли. При широком доступе кислорода продукты гидролиза белков подвергаются полному окислению, зловонных веществ образуется значительно меньше, чем при анаэробных условиях. Такой процесс называется тлением.

Гниение – преимущественно анаэробный процесс, при котором полного окисления некоторых продуктов, например жирных кислот, не происходит. Гнилостные микробы широко распространены в почве, воде, воздухе, в животных и растительных организмах. Поэтому любой продукт, не защищенный от них, быстро подвергается гниению. Его вызывают как анаэробные, так и аэробные микроорганизмы, причем они могут действовать и преемственно, и одновременно. Наиболее энергичными возбудителями гниения, сопровождающегося глубоким распадом белка и образованием азотистых и безазотистых соединений (индола, скатола, жирных кислот, NH3, H2, H2S и др.), являются Bacillus mycoides, B. subtilis, B. mesentericus, бактерии семейства Enterobacteriaceae (Proteus, Escherichia и др.), а также Clostridium putrificum, C. sporogenes. Последние два – анаэробы, содержатся в кишечнике и после смерти вызывают зловонное разложение трупов.

Процессы гниения протекают только при наличии условий, благоприятных для жизнедеятельности их возбудителей (влажность, температура и т. п.). В сухой песчаной почве трупы подвергаются мумификации (высушиванию без гниения). Гнилостные процессы происходят и в организме человека, в частности в кишечнике; причиной их являются E. coli и другие микробы. По мнению И. И. Мечникова, продукты гниения (скатол, индол и др.), постоянно образующиеся в организме, вызывают хроническую интоксикацию и являются одной из причин преждевременного старения.

Гнилостные процессы протекают также при газовой гангрене: ткани, омертвевшие под влиянием образуемых возбудителями этой болезни экзотоксинов, заселяются гнилостными аэробными и анаэробными бактериями и подвергаются распаду. Некоторые гнилостные процессы используются в промышленности с полезной целью, например при выработке кожи для отделения от нее шерсти – швицевании.

Исключительное значение процессов гниения заключается в том, что они играют важную роль в естественном самоочищении почвы и воды. Этим пользуются при строительстве специальных очистных сооружений (полей ассенизации, орошения и т. п.) для биологической переработки и обезвреживания фекальных нечистот и сточных вод, содержащих много мертвых белковых субстратов. Гниение ведет к обогащению почвы азотистыми продуктами.

Большое количество связанного азота поступает в почву также в виде мочевины (диамида угольной кислоты) – NH2– CO – NH2. Ежегодно люди и животные выделяют ее около 20 млн тонн. Но мочевина не может быть непосредственно использована в качестве азотного продукта для питания растений. Она подвергается также аммонификации, которую вызывают различные уробактерии. При этом вначале образуется нестойкая углеаммиачная соль, которая далее расщепляется с образованием NH3, CO2 и H2O.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Мочевая кислота, выделяемая в почву птицами и рептилиями, также быстро минерализуется особыми группами микроорганизмов с образованием NH3 и CO2.

Следующим важным этапом круговорота азота вслед за образованием NH3 является процесс нитрификации, т. е. окисление NH3 вначале в азотистую, а затем в азотную кислоту, соли которых наиболее пригодны для азотного питания растений. Процесс нитрификации вызывается двумя группами открытых С. Н. Виноградским нитрифицирующих бактерий. Нитрозобактерии окисляют NH3 до азотистой кислоты:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

а нитробактерии окисляют азотистую кислоту в азотную:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Нитрифицирующие бактерии – строгие аэробы, хемолитотрофы. Энергию окисления они используют для восстановления CO2 в гексозу. Благодаря нитрифицирующим бактериям в почве могут образовываться огромные скопления солей азотной кислоты в виде селитры (в Чили, Перу). Завершая процесс минерализации белковых веществ, нитрифицирующие бактерии играют исключительно важную роль и в процессах самоочищения почвы и воды, и в санитарно-гигиенических устройствах (поля орошения и т. п.). Таким образом, нитрифицирующие бактерии способствуют повышению урожайности почвы благодаря накоплению в ней азотнокислых солей.

Однако в почве происходят и противоположные процессы, т. е. денитрификации, или восстановления микроорганизмами солей азотной кислоты в соли азотистой кислоты и в другие простые азотистые соединения, вплоть до свободного азота, который уходит в атмосферу.

Способностью восстанавливать нитраты в нитриты обладает большое количество видов бактерий и грибов. Денитрификация протекает в три фазы:

1) 2HNO3 → 2HNO2 + O2;

2) 2HNO2 → промежуточные соединения + О2;

3) промежуточные соединения → N2 + H2O + O2.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 52. Круговорот азота (по Р. Стейнеру и [др.])

Окисление азота показано сплошными стрелками; восстановление – точечными стрелками; реакции без изменения валентности – пунктирными стрелками


Денитрифицирующие бактерии (в частности, некоторые виды Pseudomonas) в анаэробных условиях используют денитрификацию как основную форму дыхания. Для них соли азотной и азотистой кислот служат источниками азота. Энергию для своей специфической деятельности денитрифицирующие бактерии получают из органических веществ, которыми богата почва. Денитрифицирующие бактерии наносят вред сельскому хозяйству, так как способствуют обеднению почвы минеральным азотом и переходу свободного азота в атмосферу. Особенно энергично процессы денитрификации развиваются в слежавшейся, плохо аэрируемой почве. Однако убыль азота из почвы, вызванная активностью денитрифицирующих бактерий, компенсируется деятельностью свободноживущих аэробных и анаэробных и клубеньковых азотфиксирующих бактерий. Более 90 % азота связывают азотфиксирующие бактерии: на каждый гектар почвы ежегодно от 25 до 300 кг азота привносят только они.

Так, при самом активном участии многих видов микроорганизмов, происходит непрерывный круговорот азота, поддерживающий существование жизни на Земле (рис. 52).

Круговорот углерода

Процессы распада безазотистых органических веществ обусловлены по преимуществу жизнедеятельностью микроорганизмов, а процессы созидательные – фотосинтезом зеленых растений, водорослей и фотосинтезирующих бактерий. Ежегодно зеленые растения потребляют около 60 млрд тонн углекислого газа (или 20 млрд тонн углерода), а в атмосфере содержится около 600 млрд тонн углерода. Таким образом, его при одностороннем использовании хватило бы всего на 30 лет. Только благодаря непрерывному круговороту сохраняется равновесие между потреблением углерода и его выделением в атмосферу. В основе процессов распада безазотистых органических веществ лежат различные формы брожения, которые постоянно происходят в природе. Брожение – анаэробное дыхание, при котором микроорганизмы используют выделяющуюся энергию для своей жизнедеятельности.

Спиртовое брожение углеводов вызывают дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), некоторые виды бактерий (Sarcina ventriculi) и отдельные представители мукоровых грибов рода Mucor. При спиртовом брожении молекула гексозы распадается на этанол и углекислый газ:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Это уравнение отражает лишь конечный результат. В ходе брожения образуется много промежуточных продуктов – гексозомонофосфат, фруктозодифосфат, фосфотриозы, фосфоглицериновая кислота, фосфопировиноградная кислота, пировиноградная кислота, уксусный альдегид и, наконец, этиловый спирт.

Спиртовое брожение широко используется в промышленности для производства вина и пива, а также в хлебопечении. Для этих целей применяют определенные расы дрожжей в виде чистых культур. Дрожжи для заквашивания теста впервые были использованы около 6000 лет назад в Египте, а затем этот способ получения хлеба постепенно распространился по всему свету. Способ перегонки спирта был открыт, согласно литературным данным, в Китае или арабских странах. Винокуренные заводы в Европе появились в середине VII в. Вначале спирт использовали только для приготовления напитков, а затем в связи с развитием промышленности он стал широко применяться как растворитель и химическое сырье.

При содержании в сбраживаемом растворе более чем 30 % сахара часть его остается неиспользованной, так как при этих условиях образуется до 15 % спирта, а при такой концентрации спирт подавляет жизнедеятельность дрожжей. Поэтому натуральные вина содержат не более 15 % спирта. Главное преимущество чистых культур дрожжей заключается в том, что брожение виноградного сока протекает и заканчивается быстро, а отсутствие посторонней микрофлоры позволяет получать вина хорошего вкуса и аромата (с хорошим «букетом»).

По окончании брожения молодое вино стабилизируют и дают ему созреть. Эти процессы занимают несколько месяцев, а при изготовлении высококачественных красных вин – даже несколько лет.

В течение первого года во многих красных винах происходит второе, спонтанное брожение – яблочно-молочнокислое, которое вызывается рядом молочнокислых бактерий (Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus). В результате этого яблочная кислота винограда превращается в молочную кислоту и СО2, т. е. дикарбоновая кислота превращается в монокарбоновую, и кислотность вина уменьшается, оно становится высококачественным. Игристые вина типа шампанского подвергают второму спиртовому брожению под давлением, добавляя в вино сахар. Образующийся СО2 газирует вино. Второе брожение вызывается различными винными дрожжами, которые после брожения образуют комки и легко удаляются. Вино типа «Херес» крепят добавлением спирта до 15 % и выдерживают на воздухе; на его поверхности интенсивно размножаются определенные дрожжи, что придает вину специфический вкус. В некоторых районах Франции для приготовления десертных вин виноград заражают грибом Botrytis cinerea, а к виноградному суслу добавляют глюкофильные дрожжи, которые сбраживают глюкозу, но не разрушают более сладкой фруктозы, и получается сладкое десертное вино.

Распространенные в природе дикие расы дрожжей рода Torula часто причиняют вред бродильной промышленности, вызывая помутнение и горький вкус напитков.

Уксуснокислое брожение – биологический окислительный процесс, при котором с помощью уксуснокислых бактерий спирт окисляется в уксусную кислоту. Если какуюлибо жидкость, содержащую небольшое количество спирта (вино, пиво), оставить открытой, то в ней постепенно появляются уксусная кислота и кожистая пленка (уксусная матка) на поверхности. Уксуснокислые бактерии объединены в род Acetobacter, содержащий ряд видов и подвидов. Этиловый спирт под влиянием уксуснокислых бактерий подвергается окислению, в результате которого вначале образуется уксусный альдегид, а затем – уксусная кислота. При использовании специальных рас уксуснокислых бактерий максимальный выход уксуса достигает 14,5 %. Уксуснокислые бактерии превращают ряд многоатомных спиртов в сахар. Одна из таких реакций используется для получения сорбозы из сорбитола. Сорбоза – промежуточный продукт синтеза аскорбиновой кислоты. Она применяется в качестве суспендирующего агента при изготовлении многих лекарственных препаратов. Уксуснокислые бактерии могут наносить вред в виноделии и пивоваренной промышленности, вызывая прокисание вина и пива.

Молочнокислое брожение – широко распространенное биохимическое явление, давно известное на примере скисания молока. Под влиянием молочнокислых бактерий (семейство Lactobacillaceae) лактоза расщепляется на составляющие ее гексозы – глюкозу и галактозу, которые затем специфическими ферментами превращаются в молочную кислоту. Свертывание молока происходит вследствие того, что молочная кислота отщепляет кальций от казеина, белок превращается в параказеин и выпадает в осадок. Молочнокислые бактерии широко распространены в природе. Они обнаруживаются в молоке, воздухе, на коже, шерсти, в тонком и толстом кишечнике и представлены большим количеством видов палочковидных и кокковидных бактерий, различающихся не только по морфологии, но и по физиологическим свойствам (по использованию различных источников углерода и азота). Различают две группы возбудителей молочнокислого брожения:

1) возбудители типичного молочнокислого брожения (гомоферментативного брожения):


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

2) возбудители нетипичного (гетероферментативного) молочнокислого брожения:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

К первой группе относятся бактерии, которые образуют значительное количество молочной кислоты, превращение сахара в молочную кислоту происходит без образования побочных продуктов (или образуются только следы их). Образование молочной кислоты происходит быстро и интенсивно, а белки гидролизуются до аминокислот. Возбудители типичного молочнокислого брожения – Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus caucasicus, Lactobacillus acidophilus и другие виды. С помощью чистых культур истинных молочнокислых бактерий получают высококачественные сорта молочнокислых продуктов.

Наряду со спиртовым молочнокислое брожение имеет большое значение в пищевой промышленности. Целый ряд молочнокислых, спирто-молочнокислых и кислоовощных продуктов получают благодаря жизнедеятельности молочнокислых бактерий или их комбинации с дрожжами:

обыкновенная простоквашаS. lactis;

мечниковская простоквашаS. lactis + L. bulgaricus;

ацидофильное молокоL. acidophilus;

кефирL. caucasicus + S. lactis + дрожжи (Torula) (молочнокислое и спиртовое брожение, содержание спирта до 0,2 %);

кумыс – из сырого кобыльего молока – L. bulgaricus + S. lactis + Torula (молочнокислое и спиртовое брожение, содержание молочной кислоты около 1 %, спирта до 2,5 %);

йогу́ртL. bulgaricus + Streptococcus thermophilus;

сыры – первичное молочнокислое брожение при температуре 35 °C – S. lactis или S. cremoris, при температуре 42 °C – различные термофильные молочнокислые бактерии, в основном Lactobacillus. Получение сливочного масла также связано с микробиологическим процессом, так как вначале происходит молочнокислое брожение молока, вызываемое L. bulgaricus, а затем для отделения жира в процессе сбивания необходимо предварительное скисание сливок, которое вызывают стрептококки молока. Они образуют небольшое количество ацетоина, который спонтанно окисляется до диацетила, обусловливающего вкус и запах масла.

Сметана, творог, квашеная капуста, хлебный квас и другие продукты получают при участии молочнокислых бактерий.

К возбудителям нетипичного (гетероферментативного) молочнокислого брожения относятся E. coli, Enterobacter aerogenes и другие бактерии. Наряду с молочной кислотой (она получается в небольших количествах и медленно) эти бактерии образуют и другие продукты брожения: углекислый газ, водород, уксусную, пропионовую кислоты и другие соединения. Эти бактерии осуществляют более глубокое расщепление белков, вплоть до органических соединений и аммиака. Гетеромолочнокислому брожению принадлежит большая роль при силосовании зеленых кормов. Маслянокислое брожение также широко встречается в природе. Возбудитель маслянокислого брожения был открыт Л. Пастером. На примере маслянокислого брожения Л. Пастер разработал учение об анаэробах. Типичный представитель бактерий маслянокислого брожения – азотфиксирующий Clostridium pasteurianum. Маслянокислые бактерии в больших количествах встречаются в почве, навозе, на растениях, в молоке, сыре. Многие из них являются анаэробами и относятся к роду Clostridium.

Маслянокислое брожение – сложный биохимический процесс расщепления углеводов, в ряде случаев жиров и белков, на масляную кислоту, углекислоту и воду:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

При этом образуется много побочных продуктов – уксусная, молочная, пропионовая и другие кислоты.

Из числа других форм брожения чрезвычайно важным является брожение целлюлозы (клетчатки), в которой заложены огромные запасы углерода. Разложение целлюлозы, которая в количественном отношении представляет собой один из основных компонентов растительных тканей, осуществляется главным образом высоко специализированными в отношении питания аэробными и анаэробными микроорганизмами. Среди аэробных бактерий, расщепляющих целлюлозу, наиболее важны скользящие бактерии рода Cytophaga. Целлюлоза – единственное вещество, которое они могут использовать в качестве источника углерода. Цитофаги быстро растворяют и окисляют целлюлозу.

Общая схема важнейших типов брожения представлена на рис. 53. Факультативные анаэробы, в том числе представители семейства Enterobacteriaceae, образуют при брожении в первую очередь органические кислоты: уксусную, муравьиную, янтарную и молочную, а также этанол, глицерин, ацетоин; 2,3-бутандиол, CO2 и H2. Основные продукты брожения углеводов, которые образуют строгие спорообразующие анаэробы, – масляная кислота, бутанол, ацетон, изопропанол, другие органические кислоты и спирт. Процессы брожения используют для промышленного производства некоторых из этих продуктов, например бутандиола.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 53. Суммарная схема важнейших типов брожения (по Г. Шлегелю)


Участие микроорганизмов в круговороте серы, фосфора и железа

Сера – составная часть некоторых белков. Одним из конечных продуктов гниения белков является H2S. Сероводород не усваивается высшими растениями. Биохимические превращения серы восстановительного и окислительного порядка осуществляются серобактериями. Для них H2S является источником энергии. Серобактерии окисляют H2S с выделением свободной серы, которая отлагается у них в цитоплазме в виде капель:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

В клетках бактерий сера окисляется далее до серной кислоты:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Образующиеся сульфаты (соли H2SO4) служат прекрасным питательным веществом для высших растений. H2S в серную кислоту окисляют различные виды пурпурных серобактерий:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Наряду с такими сульфурирующими бактериями в природе не менее широко распространены и десульфурирующие микробы (аналоги денитрифицирующих бактерий), они восстанавливают сульфаты, вызывая образование H2S. Выделение H2S десульфурирующими бактериями происходит в глубинах морей, поэтому в Черном море на глубине 2500 м содержание H2S доходит до 6,5 мл в 1 л воды. Значительное накопление H2S в результате биологического восстановления серы наблюдается в целебных грязях, в лиманах и других водоемах. В санитарном отношении серобактерии являются важными агентами начальной стадии биологического очищения сточных вод и разложения органических отбросов, содержащих серу. Большинство серобактерий принадлежит к родам Thiobacillus, Sulfolobus и Thiospira. Общая схема круговорота серы представлена на рис. 54. Кроме биологического круговорота серы в атмосфере происходят небиологические превращения ее газообразных форм. Согласно некоторым подсчетам, в атмосферу ежегодно выделяется около 90 млн тонн серы в виде H2S, образующегося биологическим путем. Кроме того, еще 50 млн тонн поступает в атмосферу в виде SO2, образующейся при сжигании топлива, и около 0,7 млн тонн в форме H2S и SO2, возникающих в результате действия вулканов. В атмосфере H2S быстро окисляется до SO2 атомарным (О) и молекулярным (О2) кислородом или озоном (О3). SO2 может растворяться в воде с образованием H2SO3 или окисляться медленно до SO3, которая при растворении в воде превращается в H2SO4. Основная масса H2SO4 вместе с неокисленной H2SO3 возвращается на землю в форме кислоты, которая становится причиной разрушения различных каменных строений, в том числе многих каменных скульптур.

С химической стороны круговорот фосфора достаточно прост, поскольку он встречается в живых организмах только в пятивалентном состоянии в виде свободных фосфатных ионов (РО43 —) или в составе органических фосфатных компонентов клетки. Бактерии не способны поглощать большинство органических фосфорсодержащих соединений, свои потребности в фосфоре они удовлетворяют путем поглощения фосфатных ионов, из которых затем синтезируют органические фосфатные соединения. При разложении гнилостными бактериями белковых веществ одновременно с минерализацией азота происходит превращение органического фосфора в фосфатные ионы. Поскольку большая часть фосфатов, несмотря на быстрый круговорот фосфора, находится в виде нерастворимых солей кальция, железа или алюминия, фосфаты также служат


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 54. Круговорот серы (по Р. Стейнеру [и др.])

Окисление атома серы показано сплошными стрелками; восстановление – точечными стрелками; реакции без изменения валентности – пунктирными стрелками


фактором, ограничивающим рост растений. Растворимые фосфаты постоянно переносятся из почвы в море вследствие выщелачивания. Этот перенос имеет однонаправленный характер. Лишь небольшая часть фосфатов возвращается на сушу, главным образом в виде отложений гуано морскими птицами. Поэтому доступность фосфатов для растений зависит от непрерывного перевода в раствор нерастворимых фосфатных отложений – процесса, в котором важную роль играют микроорганизмы. Образуемые ими кислые продукты метаболизма (органические кислоты, а также азотная и серная) растворяют фосфат кальция, а образуемый ими H2S способствует растворению фосфата железа. В круговороте в природе железа большую роль играют железобактерии, для которых железо служит источником окислительного дыхания (донором электронов). Железобактерии окисляют закисные соединения в окисные, а освобождающуюся энергию используют для усвоения углерода из СО2 или карбонатов. Окисление протекает по формуле:


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Из железобактерий лучше других изучена не образующая спор подвижная палочка Thiobacillus ferroxidans, которая окисляет и серу. К железобактериям относятся некоторые нитчатые бактерии из рода Leptothrix, а также Gallionella, состоящая из спиральных, закрученных в виде пучков тонких (0,01 – 0,3 мкм) нитей, образующих стебелек, на поверхности которого откладывается гидрат окиси железа. Нитчатые железобактерии в водоемах прикрепляются к различным подводным предметам. Нити бактерий одеты слизистым влагалищем, которое пропитывается гидратом окиси железа. Размножаясь в некоторых озерах в огромных количествах, железобактерии образуют накопления железной руды (например, в Карелии). При размножении в водопроводах железобактерии могут вызывать закупорку просвета труб.

Этапы круговорота различных элементов осуществляются микроорганизмами разных групп. Непрерывное существование каждой отдельной их группы зависит от химических превращений элементов, осуществляемых другими группами микроорганизмов. Разрыв цикла в какой-либо одной точке привел бы к прекращению жизни на Земле. Жизнь непрерывна на Земле потому, что все основные элементы, необходимые для ее проявления (C, N, H, O, P, S), подвергаются циклическим превращениям, во многом благодаря деятельности микроорганизмов.

Глава 16

Микрофлора человека и ее значение

Ребенок развивается в полости матки в стерильных условиях и рождается стерильным. Но уже с первых минут после рождения он вступает в контакт с микрофлорой окружающей среды, и в течение короткого времени его кожные покровы и слизистые оболочки, сообщающиеся с внешней средой, заселяются разнообразными микроорганизмами из воздуха, а также в результате контакта с матерью, обслуживающим персоналом родильного дома и предметами ухода. В результате этого формируется новая экологическая система – организм человека + населяющая его микрофлора. Эта система очень динамична, так как взаимоотношения в ней – симбиоз микроорганизмов с макроорганизмом – могут носить характер мутуализма, комменсализма или паразитизма.

Под мутуализмом понимаются такие взаимоотношения, которые имеют взаимовыгодный характер, т. е. микроорганизмы питаются за счет своего хозяина, но не только не причиняют ему никакого вреда, а, напротив, приносят пользу, например синтезируют для него витамины.

Комменсализм – форма сосуществования, при которой микроорганизмы питаются за счет своего хозяина, не нанося ему особого ущерба. Но при известных условиях комменсалы, которыми обычно являются условно-патогенные бактерии, могут стать виновниками различных, чаще всего гнойно-воспалительных, заболеваний (стафилококки, стрептококки, грамотрицательные бактерии).

Паразитизм – существование микроорганизмов за счет хозяина, сопровождающееся нанесением ему серьезного ущерба в виде того или иного заболевания.

Нормальная, т. е. в условиях здорового организма, микрофлора в количественном и качественном отношении представлена на различных участках тела неодинаково. Причина этого – неодинаковые условия обитания на коже и слизистых оболочках разных органов. Заселение тела человека микроорганизмами происходит в результате оседания пыли и проникновения их вместе с вдыхаемым воздухом, принимаемой пищей и т. д. Общее количество микроорганизмов, обнаруживаемых у взрослого человека, достигает 1014, что почти на порядок больше числа клеток всех тканей человека. В разных участках человеческого тела в соответствии с условиями обитания формируются ассоциации (биотопы) микроорганизмов, состоящие из разнообразных видовых сочетаний. На слизистых оболочках, особенно желудочно-кишечного тракта, представители нормальной микрофлоры обитают в виде двух форм: часть из них располагается в просвете, другая часть заключена в высокогидратированный матрикс, который состоит из экзополисахаридномуциновых компонентов, образуя своеобразную биопленку. Заключенные в эту биопленку микроорганизмы обладают по сравнению с просветными более высокой устойчивостью к действию физических, химических и биологических факторов. В случае, когда эти факторы подавляют компенсаторные возможности экологической системы (хозяин и его микрофлора), могут возникать микроэкологические нарушения, результатом которых могут быть различные патологические состояния и другие неблагоприятные последствия (формирование антибиотикоустойчивых и атипичных штаммов, образование новых микробных биотопов и т. п.).

Микрофлора кожи. Кожные покровы обильно заселены микроорганизмами, особенно места, защищенные от действия света и высыхания (подмышечные впадины, межпальцевые и паховые складки, промежность). Количество бактерий на 1см2 варьирует от нескольких единиц до сотен тысяч особей. По расчетам П. Ремленже, общее число микробов на коже одного человека колеблется от 100 млн до 1 млрд клеток. Существенное значение имеет гигиеническое содержание кожных покровов. Наиболее постоянен состав микрофлоры не на поверхности кожи, где он нередко имеет случайный характер, а в глубоких слоях ее, в области устьев сально-волосяных фолликулов. Наиболее частыми представителями кожной микрофлоры являются Staphylococcus epidermidis, S. saprophyticus и грибы рода Candida, реже встречаются дифтероиды, микрококки. На кожных покровах условия для размножения бактерий не очень благоприятны, так как на них губительно действуют высыхание, десквамация эпителия, образующиеся перекиси, кислая рН и другие антимикробные факторы. При нормальном состоянии кожных покровов человек не ощущает присутствия на них микроорганизмов, но при травмах, потертостях, потливости, экзематозных поражениях они тотчас же дают о себе знать, вызывая процессы гнилостного разложения, отторжения эпидермиса, воспаление сальных и потовых желез и нагноительные процессы. Сдвиг пропорции микрофлоры кожи в сторону увеличения доли грамотрицательных бактерий служит указанием на нарушение ее нормального состава.

Микрофлора верхних дыхательных путей представлена стрептококками, дифтероидами, моракселлами, псевдомонадами. Основная масса микрофлоры ротои носоглотки приходится на долю зеленящего стрептококка (до 99 % всех микроорганизмов). Постоянно, но в меньшем количестве, встречаются нейссерии, коринебактерии (дифтероиды) и стафилококки. На состав микрофлоры оказывают влияние бактерицидные вещества слюны (лизоцим, ингибин), фагоцитарная активность лейкоцитов, адсорбционные свойства слизи и ресничек эпителиальных клеток. При спокойном дыхании человек с каждым вдохом поглощает от 1500 до 14 000 и более микробных клеток, но все они задерживаются в верхних отделах дыхательных путей (это было доказано исследованиями плеврального воздуха при естественном пневмотораксе). Слизистая оболочка гортани, трахеи, бронхов и альвеолы здорового человека не содержат микроорганизмов.

Микрофлора мочеполового тракта менее обильна, но по видовому составу разнообразна и представлена стафилококками, дифтероидами, стрептококками, микобактериями, бактероидами, фузобактериями. В наружных отделах половых органов и мочевыводящих путей чаще всего обнаруживаются микобактерии смегмы и фузобактерии. Во влагалище здоровых женщин преобладают молочнокислые палочки Додерлейна и дифтероиды, значительно реже встречаются стрептококки, стафилококки, пептострептококки, клостридии и грамотрицательные палочки. Число бактерий в мочеполовом тракте значительно уменьшается по мере удаления от его наружных отделов. Полость матки, фаллопиевы трубы и мочевой пузырь здоровых людей обычно микробов не содержат. На состав микрофлоры мочеполового тракта оказывают влияние бактерицидные свойства секретов половых путей, а у женщин – высокая кислотность влагалищного секрета (рН 4,0 – 4,6), которая регулируется молочнокислой палочкой Додерлейна (разные виды рода Lactobacillus) за счет образуемой ею молочной кислоты при расщеплении углеводного компонента слизи, прежде всего гликогена. Кислая среда угнетает рост стафилококков и грамотрицательных бактерий.

Микрофлора желудочно-кишечного тракта. Микрофлора полости рта представлена многочисленными видами аэробных и анаэробных микроорганизмов, так как для них здесь имеются вполне благоприятные условия – щелочная реакция слюны, наличие пищевых остатков, благоприятная для размножения температура (37 °C). Сразу после рождения ребенка в его ротовой полости формируется аэробная флора – кокки, палочки; с прорезыванием зубов появляются анаэробные бактерии, в том числе вибрионы, спириллы, спирохеты, клостридии. В полости рта происходит непрерывное загрязнение микробами и самоочищение под влиянием лизоцима, ингибина и других факторов, вследствие чего формируется более или менее постоянная микрофлора, наиболее частыми представителями которой являются стафилококки, стрептококки, грибы Candida, лактобактерии, нейссерии, спирохеты, вибрионы, постоянно присутствуют анаэробы – вейллонеллы, бактероиды, пептострептококки. Иногда из слюны здоровых людей выделяют простейших, аспергиллы, дрожжи и другие микроорганизмы (см. также гл. 73).

Пищевод у здоровых людей обычно свободен от микроорганизмов или заселен ими очень мало.

Желудок. В связи с кислой реакцией среды, неблагоприятной для развития микроорганизмов, в желудке прижилась специфическая микрофлора: дрожжи, сарцины, грибы, лактобактерии, стафилококки, стрептококки, кампилобактерии и др., но не гнилостные бактерии (всего до 30 видов). Изменение состава микрофлоры, в частности появление гнилостных бактерий, – признак нарушения нормальной функции желудочной секреции.

Тонкий кишечник. Микрофлора не обильная и довольно однообразная: лактобактерии, энтерококки, бифидумбактерии, E. coli и некоторые другие. Размножению бактерий препятствуют бактериостатическое действие желчи, секретов слизистой оболочки и секреторные иммуноглобулины класса IgAs. В ряде случаев, например в связи с нарушением желудочной секреции или с повреждением слизистой оболочки кишечника в результате радиационного облучения, или вследствие заболевания печени, желчных путей и поджелудочной железы, или иммунодефицита, у людей развивается синдром избыточной колонизации тонкого кишечника. Он заключается в том, что в тонкой кишке резко увеличивается концентрация бактериальной популяции, аналогичной по видовому и количественному составу микрофлоре толстого кишечника. Такое накопление в тонком кишечнике необычной для него микрофлоры может привести к различным нарушениям его функции и к явлениям энтеральной недостаточности.

Микрофлора толстого кишечника наиболее обильна и многообразна. Особенности условий обитания для микроорганизмов в толстом кишечнике состоят в том, что это орган не секреторный, а экскреторный, в нем отсутствует лизоцим, лимфоидная ткань представлена менее мощно, в то же время здесь благоприятные рН, температура, обилие питательных веществ и т. п. Формирование микрофлоры толстого кишечника начинается с первым вздохом ребенка, но в первые три дня, пока ребенок питается молозивом (молоко, обогащенное иммуноглобулинами матери), в толстом кишечнике размножаются разнообразные, в том числе гнилостные, бактерии. Как только он начинает питаться грудным молоком матери, гнилостные бактерии исчезают и формируется постоянная микрофлора, в которой преобладают бактерии, образующие при ферментации глюкозы молочную кислоту. В толстом кишечнике обнаружено более 260 видов бактерий, общая биомасса их составляет около 1,5 кг.

Микрофлору толстого кишечника можно разделить на четыре следующие группы:

• Основную массу микрофлоры составляют строгие анаэробы, не образующие спор: грамположительные бактерии рода Bifidobacterium и грамотрицательные бактерии семейства Bacteroidaceae. На долю бифидобактерий и бактероидов приходится до 96 – 99 % всей микрофлоры толстого кишечника. Они выделяются из испражнений даже при разведении 10– 12– 10– 10 степени.

• Вторую группу составляют факультативные анаэробы, представленные главным образом грамотрицательной E. coli и грамположительными энтерококками и молочнокислыми палочками рода Lactobacillus (спор не образуют). На их долю приходится 1 – 4 % всей микрофлоры.

• Третью группу составляет так называемая остаточная микрофлора, на которую приходится 0,001 – 0,01 % всех микроорганизмов толстого кишечника. К этой группе принадлежат: Staphylococcus, Proteus, Candida, Clostridium, Pseudomonas.

• К четвертой группе относятся различные другие представители семейства Enterobacteriaceae, которые могут временно или постоянно обнаруживаться в кишечнике и вызывать кишечные инфекции (Salmonella, Shigella, Enterobacter и другие роды).

Таким образом, кожные покровы и слизистая оболочка организма заселены различными видами микроорганизмов, которые образуют с макроорганизмом единую целостную экологическую систему. Состав и состояние микрофлоры зависят от макроорганизма, но, в свою очередь, и микрофлора, особенно толстого кишечника, оказывает существенное и многообразное влияние на макроорганизм. Ее воздействие на макроорганизм проявляется в следующем:

1. Она является одним из важных факторов естественной резистентности организма, так как проявляет высоко антагонистическое действие по отношению к другим, в том числе патогенным, бактериям, препятствуя их размножению в организме. На это обстоятельство давно указывал И. И. Мечников: «Природа пользуется конкуренцией безобидных микробов, чтобы помешать поселению патогенных микробов». И. И. Мечникову принадлежит идея употребления в пищу молочнокислых продуктов с целью подавления развития в кишечнике гнилостных бактерий и продления жизни человека.

2. Микрофлора своими антигенными факторами стимулирует развитие лимфоидной ткани организма и таким образом также способствует развитию неспецифической и опосредованной специфической резистентности.

3. Микрофлора, особенно толстого кишечника, участвует в процессах пищеварения, в том числе в обмене холестерина и желчных кислот.

4. Важная роль микрофлоры заключается также в том, что она обеспечивает организм человека различными витаминами, которые синтезируются ее представителями (витамины В1, В2, В6, В12, К, никотиновая, пантотеновая, фолиевая кислоты и др.). Эти витамины обеспечивают бZольшую часть потребностей в них организма. Однако представители нормальной микрофлоры не всегда приносят только пользу. При определенных условиях, в частности при воздействии факторов, снижающих естественную резистентность, особенно в результате ионизирующего облучения, практически все представители нормальной микрофлоры, за исключением бифидумбактерий, могут стать виновниками различных эндогенных инфекций, чаще всего гнойно-воспалительных заболеваний с различной локализацией: ангины, менингиты, циститы, отиты, сепсисы, нефриты, аппендициты, абсцессы, флегмоны и т. п. Нередко после перенесенных кишечных заболеваний и особенно после длительного и нерационального применения антибиотиков возникают дисбактериозы.

Дисбактериоз – изменение количественного соотношения и состава нормальной микрофлоры организма, главным образом кишечника, при котором происходит уменьшение количества или исчезновение обычно составляющих ее микроорганизмов и появление в большом количестве редко встречающихся или не свойственных ей микробов. Обычно это соотношение изменяется в сторону увеличения количества факультативно-анаэробной или остаточной микрофлоры, главным образом грамотрицательных палочек, стафилококков, дрожжеподобных грибов Candida или Clostridium. Причиной дисбактериоза очень часто бывает бесконтрольное применение антибиотиков, особенно с широким спектром действия. Подавляя жизнедеятельность нормальной микрофлоры кишечника, они способствуют колонизации его другими видами антибиотикоустойчивых бактерий, что и служит причиной диарей, а иногда и очень тяжелых форм дисбактериоза и заболеваний различной этиологии (стафилококковый сепсис, псевдомембранозный колит и др.). Для лечения и профилактики дисбактериоза и других диарей, улучшения функционирования желудочнокишечного тракта во многих странах мира все в большем количестве начинают применять в различных формах эубиотики, пробиотики, пребиотики, синбиотики и другие биологически активные вещества.

Эубиотики – микроорганизмы, участвующие в формировании естественного, исторически сложившегося микробиоценоза в кишечнике (главным образом в толстом). К ним относятся прежде всего лактобациллы и бифидумбактерии, метаболическая активность которых определяет положительное влияние микрофлоры кишечника на организм человека.

Пробиотики – эубиотики, добавляемые к молочным продуктам (йогурт, кефир, молоко и т. д.) или используемые в виде чистых культур, жидких или таблетированных (бифидумбактерин, лактобактерин, колибактерин и др.), или в виде различных комбинаций (бификол – смесь бифидумбактерин + E. coli М-17, обладающая выраженным антагонистическим действием в отношении ряда других бактерий). В качестве пробиотиков используют также и некоторые споровые бактерии (Bacillus cereus, B. subtilis).

Пребиотики – неперевариваемые ингредиенты продуктов питания, которые селективно стимулируют рост и метаболическую активность эубиотиков, способствуют улучшению здоровья человека (низкомолекулярные углеводы, лактулоза и др.). Пребиотики содержатся в артишоке, луке репчатом, цикории, чесноке, кукурузных хлопьях, горохе, фасоли, овсяной крупе и других продуктах.

Синбиотики – смеси пробиотиков и пребиотиков.

Дисбактериозы развиваются потому, что антибиотики, особенно с широким антимикробным спектром, действуют не только на возбудителя заболевания, но и на чувствительных к ним представителей нормальной микрофлоры, угнетая их размножение. В этих условиях те микроорганизмы, на которые антибиотики не действуют, начинают беспрепятственно размножаться, особенно если понижена и естественная резистентность организма. Чаще всего устойчивыми являются стафилококки, грибы Candida и различные грамотрицательные палочки (кишечная палочка, протей, псевдомонады). Это и приводит к развитию дисбактериозов. Наиболее тяжелыми формами дисбактериозов, представляющими уже самостоятельные заболевания, являются стафилококковые пневмонии, стафилококковые сепсисы, кандидомикозы (в том числе генерализованные) и антибиотико-ассоциированные колиты, особенно стафилококковый и псевдомембранозный колит, вызываемый Clostridium difficile. Для лечения дисбактериозов кишечника и колитов рекомендуется применение специальных бактерийных препаратов, способствующих восстановлению нормальной микрофлоры: колибактерин (высушенная взвесь живых бактерий антагонистически активного в отношении шигелл Флекснера и Зонне штамма E. coli M-17), бифидумбактерин (высушенная взвесь живых бифидобактерий), лактобактерин (высушенная взвесь антагонистически активных штаммов лактобактерий), бификол (высушенная взвесь живых антагонистически активных бифидобактерий и E. coli M-17), бактисубтил или других, сходных по назначению и составу биопрепаратов.

Санитарная микробиология и ее значение

Микрофлору окружающей среды и обусловливаемые ее жизнедеятельностью процессы, которые могут оказать влияние на здоровье человека, изучает санитарная микробиология. Это самостоятельная наука со своими целями, задачами и методами исследования. Она сформировалась на стыке трех дисциплин: микробиологии, эпидемиологии и гигиены. Санитарная микробиология призвана решать следующие задачи:

1. Разработка, совершенствование и оценка методов микробиологических исследований разнообразных объектов внешней среды (воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов, предметов обихода и т. п.).

2. Оценка путей воздействия человека и животных на окружающую среду, которые могут стать причиной загрязнения ее опасными для здоровья микроорганизмами, включающая изучение: а) естественного взаимообмена микрофлорой между людьми, животными и средой их обитания; б) различных сторон общественной и индивидуальной деятельности людей, которые могут стать причиной накопления опасных микроорганизмов и загрязнения ими различных объектов; в) тех производственных и бытовых процессов, которые приводят к нарушению естественного самоочищения и обеззараживания окружающей среды.

3. Разработка государственных санитарных стандартов, а также других нормативов, определяющих соответствие микрофлоры объектов внешней среды гигиеническим требованиям, включая микробиологические показатели.

4. Разработка рекомендаций и мероприятий по оздоровлению объектов внешней среды путем воздействия на их микрофлору и проверка эффективности этих мероприятий.

5. Охрана окружающей среды. Эта задача является одной из главных задач санитарной микробиологии и гигиены. В ее основе лежат всестороннее изучение закономерностей взаимодействия человека с факторами внешней среды и разработка научно обоснованных рекомендаций по сохранению здоровья человека.

Санитарно-микробиологические исследования объектов внешней среды должны прежде всего решать вопрос о наличии или отсутствии в них патогенных для человека микроорганизмов (бактерий, вирусов и грибов). Однако непосредственное обнаружение их в объектах окружающей среды сопряжено с рядом трудностей. Поэтому санитарная микробиология использует свой особый, непрямой способ оценки санитарного благополучия объектов внешней среды. Способ основан на том, что главным источником возбудителей инфекционных болезней являются люди и теплокровные животные, выделяющие патогенные микроорганизмы в окружающую среду, главным образом фекальным и воздушно-капельным путем. Поэтому, чем обильнее загрязнены объекты внешней среды этими выделениями, тем вероятнее, что эти объекты заражены и соответствующими патогенами.

Для многих видов микроорганизмов кишечник – биотоп, т. е. единственная естественная среда их обитания. Следовательно, обнаружение в исследуемом материале представителей микрофлоры кишечника служит непосредственным доказательством фекального загрязнения объекта и указанием на возможное присутствие в нем возбудителей кишечных инфекций (брюшного тифа, холеры и т. п.). Полость рта – биотоп для многих других микроорганизмов. Обнаружение их в исследуемом материале служит указанием на возможное заражение объекта возбудителями капельных инфекций (дифтерии, скарлатины и т. п.). Выделяемые в этих случаях микроорганизмы выступают в роли показателей санитарного неблагополучия, т. е. потенциальной эпидемиологической опасности исследуемых объектов, поэтому они получили название «санитарно-показательных». Однако в качестве таковых выступают не все представители нормальной микрофлоры тела человека или животного, а только те из них, которые отвечают следующим требованиям (Кочемасова З. Н. [и др.], 1987):

1. Они должны постоянно содержаться в выделениях человека или теплокровных животных и выделяться в окружающую среду в больших количествах.

2. Они не должны иметь другого природного резервуара, кроме организма человека или животного.

3. После выделения в окружающую среду они должны сохранять жизнеспособность в течение сроков, близких к срокам выживания патогенных микробов, выводимых из организма теми же путями.

4. Они не должны активно размножаться в окружающей среде.

5. Они не должны сколько-нибудь значительно изменять свои биологические свойства в окружающей среде.

6. Они должны быть достаточно типичными, чтобы их дифференциальная диагностика осуществлялась без особого труда.

7. Обнаружение, идентификация и количественный учет должны производиться современными, простыми, легко доступными и экономичными микробиологическими методами.

8. Рост санитарно-показательных микроорганизмов на питательных средах должен быть свободен от влияния других присутствующих микробов.

9. В объекте внешней среды они должны быть распределены по возможности равномерно. В случае исследования плотных пищевых объектов последние подвергаются гомогенизации для равномерного распределения микробов.

10. Санитарно-показательные микроорганизмы должны встречаться как в организме своего хозяина, так и во внешней среде в количествах, значительно больших, чем соответствующие патогенные микроорганизмы.

Чем большему числу указанных требований удовлетворяет тот или иной представитель нормальной микрофлоры тела человека или животного, тем в большей степени он соответствует функции санитарно-показательного микроорганизма.

Наиболее важными показателями фекального загрязнения во всем мире признаются бактерии группы кишечной палочки (БГКП). Под этим общим понятием объединяют бактерии семейства Enterobacteriaceae, родов Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella. К категории БГКП относят грамотрицательные, не образующие спор и не обладающие оксидазной активностью палочки, ферментирующие лактозу и глюкозу до кислоты и газа при температуре 37 °C в течение 24 ч. Эти бактерии выделяются в окружающую среду только с испражнениями человека и теплокровных животных.

Среди БГКП выделяют лактозоположительные палочки (колиформные по международной классификации), которые ферментируют лактозу при температуре 37 °C с образованием кислоты и газа, а из этой группы – фекальные кишечные палочки (ФКП), ферментирующие лактозу при температуре 44,5 °C. Из ФКП к E. coli относятся только бактерии, не способные расти на среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии цитрат. Эти бактерии являются показателями свежего фекального загрязнения. К показателям фекального загрязнения относят, помимо БГКП, энтерококки (разновидность S. faecalis), клостридии (C. perfringens), бактерии рода Proteus и колифаги. Перспективными для этих целей могут быть и бифидобактерии, но их трудно культивировать (строгие анаэробы) и идентифицировать. Поскольку энтерококки выживают во внешней среде относительно недолго, их обнаружение, как и обнаружение E. coli, служит показателем свежего фекального загрязнения.

Для оценки санитарно-гигиенических показателей безопасности питьевой воды, продовольственного сырья и пищевых продуктов, воды минеральной питьевой, лечебной и лечебно-столовой, вод поверхностных стоков, открытых водоемов и морей, всех категорий сточных вод, лечебных грязей и почвы используются унифицированные методы анализа, предусмотренные соответствующими нормативными документами, ГОСТами, методическими указаниями и другими актами санитарного законодательства страны.

Например, в соответствии с этими актами, нормативы микробиологических показателей питьевой воды таковы:

1. Общее микробное число (количество микроорганизмов в 1 мл воды) – не более 100.

2. Число бактерий группы кишечной палочки (коли-индекс) – количество БГКП в 1000 мл воды – не более 3.

3. Эшерихии (показатель свежего фекального загрязнения) – количество эшерихий в 1000 мл воды – отсутствие.

4. Колифаги – количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1000 мл воды – отсутствие.

Кроме того, в 25 л питьевой воды должны отсутствовать патогенные простейшие (цисты лямблий, дизентерийных амеб, балантидий) и яйца гельминтов.

Для оценки бактериального загрязнения почвы санитарно-показательными микроорганизмами служат БГКП, энтерококки, клостридии (C. perfringens), термофилы; воздуха – стафилококки и стрептококки; предметов обихода – БГКП, стафилококки, энтерококки; пищевых продуктов – БГКП, энтерококки, стафилококки, бактерии группы протея.

Микробиологические нормативы для стерилизованных продуктов детского питания: не допускается в массе 10 см3 продукта наличия БГКП, E. coli, S. aureus, и в массе 100 см3 – патогенных бактерий, в том числе сальмонелл. Допускается в1см3 продукта не более 100 КОЕ (колониеобразующих единиц) мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Для кисломолочных продуктов детского питания не допускается в массе 3 см3 продукта БГКП, в 10 см3E. coli и S. aureus, в 50 см3 – патогенных бактерий, в том числе сальмонелл. В пастообразных продуктах (творог), готовых кашах и напитках не допускается в 1 г продукта содержания БГКП, E. coli и S. aureus; патогенных бактерий, в том числе сальмонелл – в 50 г.

С 1 сентября 2002 г. вступило в силу новое Постановление СанПиН 2.3.2.1078-01, утвержденное Главным государственным санитарным врачом РФ от 14.11.2001 г.

№ 36, дополненное и измененное в 2008 г. СанПиН 2.3.2.2401-08.

Часть четвертая

УЧЕНИЕ ОБ ИНФЕКЦИИ

Глава 17

Инфекция, факторы инфекционного процесса и основные формы инфекций

Слово «инфекция» происходит от латинского «inficio» – вношу что-либо вредное, заражаю, и позднелатинского «infectio» – заражение. Однако буквальный перевод слова не вполне отвечает вкладываемому в это понятие содержанию. В обиходе это слово употребляют, вкладывая в него три различных понятия. Очень часто термин «инфекция» отождествляется с понятием «инфекционное заболевание». В других случаях под инфекцией понимают заразное начало (т. е. инфект – возбудитель заболевания); наконец, под инфекцией понимают сам процесс заражения. В действительности, под термином «инфекция» правильнее понимать процесс взаимодействия между микро– и макроорганизмом, протекающий в конкретных условиях внешней среды (в том числе социальной). При таком самом широком понимании термина «инфекция» учитываются все три варианта его толкования.

Инфекционное заболевание есть одна из форм инфекции, самая крайняя (тяжелая), но не единственная форма ее проявления. Вместе с тем именно при таком подходе к понятию инфекция становится ясным, какие факторы обусловливают инфекцию и в чем заключается сущность инфекционного процесса.

На заре развития микробиологии господствовала так называемая триада Генле – Коха, которая подчеркивала главную, ведущую роль в развитии инфекционного процесса микроорганизма – возбудителя заболевания. В соответствии с ней: 1) микроорганизм всегда должен встречаться при данной болезни и не встречаться у здоровых людей и у больных другими болезнями; 2) микроорганизм должен быть выделен от больного в чистой культуре; 3) чистая культура микроорганизма должна вызвать то же самое заболевание. Однако многочисленные наблюдения со временем привели к пересмотру этой доктрины. Стало очевидным, что развитие болезни зависит не только от свойств возбудителя, но во многом и от состояния макроорганизма, которое, в свою очередь, зависит от условий его существования. Вместе с тем было бы ошибочно сущность инфекционного процесса рассматривать без учета роли микроорганизма – возбудителя данного заболевания. Задача науки в том и состоит, чтобы раскрыть и показать роль того и другого участника этого очень сложного процесса взаимодействия и обеспечить правильное воздействие на развитие и исход инфекционного заболевания. Врач должен эффективно влиять на возбудителя, назначая рациональное антибактериальное лечение, и на организм человека, мобилизуя его защитные механизмы.

Вот почему основным положением современного учения об инфекции является признание того непреложного факта, что возникновение, развитие и исход инфекции как процесса взаимодействия между микро– и макроорганизмом зависят от свойств того и другого участников этого конкурентного взаимодействия и от условий внешней среды, в которых оно происходит. Инфекции принято разделять на две основные группы: а) манифестная инфекция, т. е. инфекционная болезнь, которая может протекать типично, атипично, хронически и т. п.; б) бессимптомная инфекция (носительство, латентная, абортивная, дремлющая и т. п.).

В зависимости от свойств главных факторов инфекционного процесса (т. е. возбудителя и макроорганизма) различают следующие основные формы инфекции:

1. Абортивная. Возбудитель проникает в организм, но не размножается в нем или в связи с надежной естественной резистентностью, или с приобретенным специфическим иммунитетом, подавляющим возбудителя. Таким образом, инфекционный процесс обрывается, и возбудитель рано или поздно погибает или удаляется из организма.

2. Латентная (инаппарантная). Возбудитель проникает в организм, размножается в нем, макроорганизм отвечает на него соответствующими иммунобиологическими реакциями, ведущими к формированию приобретенного иммунитета и удалению возбудителя из организма. Однако никаких внешних клинических проявлений этой инфекции нет, она протекает скрыто (латентно). Нередко в такой латентной форме люди переносят полиомиелит, бруцеллез, некоторые вирусные гепатиты и другие болезни.

3. Дремлющая инфекция. Бессимптомное пребывание возбудителя в организме может сохраняться долгое время после латентной инфекции или после перенесенного заболевания, например легочного туберкулеза, закончившегося формированием первичного комплекса (см. главу 65). Под влиянием условий, понижающих сопротивляемость организма, сохраняющиеся в нем живые микроорганизмы активизируются и вызывают заболевание или его рецидив. Таким образом, патогенные микробы находятся некоторое время как бы в «дремлющем» состоянии. Такие «дремлющие» микробы могут проникать в организм из внешней среды или быть результатом перехода в «дремлющее» состояние микробавозбудителя, подавленного в своей активности, но сохранившего жизнеспособность и потенциальную готовность к активации при благоприятных для него условиях. Поэтому они получили название «микробов, готовых к выходу» (франц. «microbes de sortie»). В тех случаях, когда «дремлющие» в организме микробы сосредоточены в местном ограниченном очаге, откуда они могут распространяться и вызывать заболевание, применяют термин «фокальная» инфекция (например, заглохший воспалительный процесс в кариозном зубе, в котором его возбудитель – стрептококк – сохраняется в «дремлющем» состоянии до поры до времени).

4. Типичная для данного возбудителя форма инфекции. Возбудитель проникает в организм, активно в нем размножается, вызывая характерные (типичные) для данной болезни клинические проявления, которые также характеризуются определенной цикличностью.

5. Атипичная форма. Возбудитель проникает в организм, активно в нем размножается, организм отвечает соответствующими иммунобиологическими реакциями, которые приводят к формированию активного иммунитета, но клинические симптомы болезни носят невыраженный, стертый или атипичный характер. Чаще всего это связано либо со слабыми патогенными свойствами возбудителя, либо с высокой естественной резистентностью организма, либо с эффективным антибактериальным лечением, либо с действием всех этих трех факторов.

6. Персистентная (хроническая). Возбудитель проникает в организм, размножается в нем, вызывает активную форму болезни, но под влиянием иммунных систем организма и химиопрепаратов подвергается L-трансформации. Поскольку L-формы бактерий не чувствительны ко многим антибиотикам и химиопрепаратам, чей механизм действия связан с нарушением синтеза клеточной стенки, а также к антителам, они могут длительное время переживать (персистировать, англ. persistence – живучесть) в организме. Возвращаясь в свою исходную форму, возбудитель восстанавливает патогенные свойства, размножается и вызывает обострение (рецидив) болезни. Типичным примером такой хронической инфекции является туберкулез. Сохраняющиеся в организме больного L-формы туберкулезной палочки являются главной причиной хронического течения этой болезни, а превращение L-форм туберкулезных палочек в исходные Mycobacterium tuberculosis – главная причина обострения и рецидивов ее.

7. Медленные инфекции. Возбудитель проникает в организм и может долгое время – месяцы, годы – сохраняться в нем внутриклеточно в латентном состоянии. В силу ряда биологических особенностей возбудителей медленных инфекций организм не в состоянии от них избавиться, а при благоприятных для возбудителя условиях он начинает беспрепятственно размножаться, заболевание протекает все тяжелее и тяжелее и, как правило, заканчивается смертью больного. Медленные инфекции характеризуются длительным инкубационным периодом, длительным прогрессирующим развитием болезни, слабым иммунным ответом и тяжелым исходом. Типичным примером медленной инфекции является СПИД.

8. Бактерионосительство. Очень часто после либо латентной инфекции, либо перенесенного заболевания организм человека не в состоянии полностью освободиться от возбудителя. При этом человек, будучи практически здоровым, становится его носителем в течение многих месяцев или даже лет. Являясь источником заражения для других лиц, бактерионосители играют большую роль в эпидемиологии многих заболеваний (брюшного тифа, дифтерии и др.), поскольку они выделяют их возбудителей в окружающую среду, заражают воздух, воду, пищевые продукты. Около 5 – 8 % людей, переболевших брюшным тифом, становятся хроническими (на срок более 3 мес.) носителями S. typhi и служат основным их резервуаром в природе.

Существуют понятия реинфекции, суперинфекции, микст-инфекции, вторичной инфекции.

Реинфекция – повторное заражение и развитие инфекции, вызванной тем же возбудителем, обычно в форме клинически выраженной инфекционной болезни, так как после заболевания напряженный иммунитет не вырабатывается.

Суперинфекция – инфицирование организма болеющего тем же возбудителем до наступления выздоровления.

Микст-инфекция (коинфекция) – одновременное возникновение двух инфекционных процессов, вызванных различными микроорганизмами. Противоположное понятие – моноинфекция.

Вторичная инфекция – возникает как следствие ослабления иммунитета на фоне первичного инфекционного заболевания и может вызываться различными возбудителями (бактериями, вирусами, грибами). Вторичные инфекции, вызванные малопатогенными или непатогенными для здорового человека микроорганизмами, у страдающего иммунодефицитом человека принято называть оппортунистическими.

Аутоинфекция – развитие инфекционного процесса, вызванного собственной (как правило, условно-патогенной) микрофлорой, населяющей кожу и слизистые оболочки, при попадании ее в другие биотопы (например, в рану) в результате самозаражения.

Различают также инфекцию экзогенную и эндогенную (в том числе аутоинфекцию), очаговую (локальную) и генерализованную.

Динамика развития инфекционной болезни

Развитие инфекционной болезни характеризуется определенной цикличностью, сменой периодов. Различают инкубационный и продромальный периоды, периоды развития (расцвета) болезни и выздоровления (реконвалесценции).

Инкубационный период – период от момента заражения до появления первых признаков заболевания. В течение этого периода в организме происходит активное размножение и накопление возбудителя и его токсинов до определенного порогового количества, после которого организм начинает отвечать теми или иными клиническими проявлениями, т. е. наступает следующий, продромальный период. Продолжительность инкубационного периода варьирует в среднем от нескольких дней до нескольких недель, но он может быть равен и нескольким часам и длиться несколько месяцев, а при лепре – несколько лет. Это зависит от ряда причин – величины заражающей дозы и степени патогенности возбудителя, а также от состояния резистентности организма.

Продромальный период, или период предвестников. Он характеризуется обычно неспецифическими, общими проявлениями – слабость, разбитость, головная боль, общее недомогание, повышение температуры и т. п. Его продолжительность варьирует в пределах 24 – 48 ч.

Период развития (расцвета) болезни. Он также часто характеризуется известной цикличностью. Различают стадию нарастания симптомов (стадия incrementum), расцвета болезни (стадия acme) и период угасания симптомов (стадия decrementum). При типичной форме болезни этот период характеризуется проявлением специфических для данной болезни симптомов, а также и некоторыми общими симптомами, в частности, лихорадкой, интоксикацией, воспалением, иногда появлением сыпи.

Период выздоровления, или реконвалесценции. Клиническое выздоровление наступает обычно раньше патологоанатомического и бактериологического выздоровления. Человек практически здоров, но на месте локализации процесса еще остаются какие-либо патологоанатомические изменения (например, после перенесенной дизентерии на слизистой оболочке толстой кишки). Реконвалесценция может быть полной: все процессы заканчиваются полностью без каких-либо отягощающих последствий. Однако некоторые болезни оставляют тяжелые последствия, например паралич мышц после полиомиелита, энцефалита; цирроз печени после вирусного гепатита В и т. п. Особо следует принимать во внимание бактериологическое выздоровление после инфекционного заболевания, т. е. полное освобождение организма от возбудителя. При различных инфекционных заболеваниях срок бактериологического выздоровления варьирует, и это учитывается при выписке таких больных из больницы. Например, при брюшном тифе до 80 % реконвалесцентов в течение первых двух недель являются бактерионосителями. Бактериологическое выздоровление контролируют лабораторными бактериологическими анализами. Об эпидемиологическом значении бактерионосительства сказано выше.

Глава 18

Патогенность бактерий. Факторы патогенности и особенности их генетического контроля

Патогенность и вирулентность

Термин «патогенность» означает способность микроорганизмов вызывать заболевания. Он состоит из двух греческих слов: pathos – страдание, болезнь, и genes – рождающий. Патогенными, т. е. болезнетворными, являются далеко не все бактерии. Поэтому закономерным является вопрос, как они возникли или чем определяется их патогенность. Однозначного ответа на него дать невозможно, так как патогенность разных бактерий определяется их особыми свойствами. Одним из объяснений происхождения патогенных бактерий служит допущение того факта, что их появление связано с приспособлением к паразитическому существованию и приобретением в связи с этим таких биологических свойств, которые обеспечивают им способность противостоять защитным механизмам макроорганизма. Как уже отмечалось, между микро– и макроорганизмом существуют различные формы симбиоза: мутуализм, комменсализм и паразитизм. Переход от комменсализма к паразитизму вполне логичен. Это положение подтверждает наличие в природе так называемых микробов-двойников. Например, есть микобактерии, патогенные для человека и теплокровных животных, патогенные для холоднокровных и растений, и микобактерии непатогенные (например, Mycobacterium smegmatis – представитель микрофлоры слизистой оболочки мочеполовых путей человека). Вероятнее всего предположение, что патогенные микобактерии обособились в разные группы в результате адаптации к паразитизму за счет соответствующих организмов. Вместе с тем возбудители таких заболеваний, как ботулизм и столбняк, постоянно существуют во внешней среде: естественной средой обитания для них служит почва. Их патогенность для человека и теплокровных животных связана со способностью вырабатывать сильнейшие токсины. Однако не ясно, какую роль токсинообразование играет в жизни и экологии этих бактерий.

Другой механизм превращения непатогенных бактерий в патогенные связан с получением первыми дополнительных генов от бактериофагов либо плазмид. Например, дифтерию у человека вызывают только патогенные Corynebacterium diphtheriae, а способность синтезировать дифтерийный экзотоксин они приобретают в результате лизогенной конверсии (см. главу 47). Иначе говоря, болезнетворность этих бактерий зависит от передачи им генов токсигенности от особых токсигенных коринефагов. Интегрируясь в хромосому непатогенных коринебактерий, такие фаги привносят в них свои гены, которые и превращают непатогенные коринебактерии в возбудители дифтерии. В свою очередь, многие варианты диареегенных кишечных палочек возникли в результате приобретения ими плазмид, в составе которых имеются гены, превращающие непатогенную E. coli в патогенную, способную вызывать различные формы эшерихиозов.

Наконец, в природе существуют различные виды бактерий, способных с помощью сенсорно-регуляторных систем перестраивать свой метаболизм в зависимости от того, в каких условиях они существуют – во внешней среде или в организме теплокровных животных. Эти бактерии (легионеллы, иерсинии и др.) получили название сапронозных, так как естественной средой их обитания являются почва и растительные организмы. Однако, попадая в организм человека или животных, они изменяют свой метаболизм в сторону, способствующую их размножению и в этих условиях, т. е. при более высокой температуре в живом организме с его механизмами самозащиты.

Патогенность, или способность вызывать заболевание, не является абсолютной.

Ее обусловленность находит свое выражение в следующих фактах:

1. Патогенность микробов проявляется всегда по отношению к определенному виду (видам) животных. Есть бактерии, патогенные только для человека, есть патогенные только для животных, но есть патогенные и для человека, и для животных (возбудители чумы, бруцеллеза, туляремии и др.).

2. Непатогенный в одних условиях (естественных) для макроорганизма возбудитель может стать патогенным в других, измененных условиях. Например, в естественных условиях куры не болеют сибирской язвой, но если температуру их тела искусственно понизить, они ею заболевают.

3. Микроорганизмы, являющиеся непатогенными или условно-патогенными для физиологически здоровых организмов, могут стать патогенными при ослаблении их естественной резистентности, особенно под влиянием радиационного облучения.

Патогенность – способность вызывать заболевание – видовое свойство бактерий, присущее виду в целом, но она может проявляться в разной степени у разных представителей данного вида. Поэтому для оценки степени патогенности используют термин вирулентность. Патогенность и вирулентность (лат. virulentus – ядовитый) означают одно и то же – способность вызывать заболевание, но под вирулентностью понимают количественную оценку, т. е. меру, степень патогенности. Вирулентность может быть усилена (повышена) и ослаблена (понижена). Это достигается разными способами воздействия на соответствующего возбудителя. Но так как все признаки патогенности контролируются генами, то фактически получение авирулентных или высоковирулентных штаммов возбудителей сводится к селекции таких вариантов, всегда имеющихся в каждой популяции, т. е. к созданию благоприятных для их отбора условий. Л. Пастер получил вакцину против сибирской язвы путем выращивания ее возбудителей при высокой температуре (42 °C), которая способствовала утрате плазмид (плазмиды), определяющих патогенность этого возбудителя. Вакцину против бешенства он получил путем селекции штамма вируса бешенства, высоковирулентного для кроликов, но безвредного для человека. А. Себин получил живую вакцину против полиомиелита путем селекции невирулентных вариантов всех трех типов полиовируса.

Для количественного выражения вирулентности микроорганизмов используют три метода: определение Dlm, Dcl и Dl50. Dlm (Dosis letalis minima) – минимальная смертельная доза микроорганизмов или их токсинов, способная вызвать гибель животного за определенный срок, – величина относительная, зависит от вида животного. Dlm для кролика, собаки и морской свинки будет различной. Dcl (Dosis certа letalis) – безусловно смертельная доза, т. е. доза, вызывающая гибель любого животного; она также является относительной. Поэтому статистически наиболее достоверной летальной дозой принято считать дозу (количество микроорганизмов или их токсинов), вызывающую гибель 50 % зараженных животных, – Dl50. Она устанавливается на основании статистической обработки полученных результатов по методу Рида и Менча.

Факторы патогенности (вирулентности)

Патогенность как биологический признак бактерий реализуется через их три свойства: инфекциозность, инвазивность и токсигенность (или токсичность).

Под инфекциозностью (или инфективностью) понимают способность возбудителей проникать в организм и вызывать заболевание, а также «способность ми-кробов передаваться с помощью одного из механизмов передачи, сохраняя в этой фазе свои патогенные свойства и преодолевая поверхностные барьеры (кожу и слизистые)» (Королюк А. М., 1995). Она обусловлена наличием у возбудителей факторов, способствующих их прикреплению к клеткам организма и колонизации.

Под инвазивностью понимают способность возбудителей преодолевать защитные механизмы организма, размножаться, проникать в его клетки и распространяться в нем. Это свойство также связано с наличием у патогенных микроорганизмов большой группы факторов патогенности, которые наделяют их способностью к внедрению в клетки и размножению в них; факторов, подавляющих фагоцитоз и препятствующих ему; большой группы ферментов «агрессии и защиты».

Токсигенность бактерий обусловлена выработкой ими экзотоксинов. Токсичность обусловлена наличием эндотоксинов. Экзотоксины и эндотоксины обладают своеобразным действием и вызывают глубокие нарушения жизнедеятельности организма.

Инфекциозные, инвазивные (агрессивные) и токсигенные (токсические) свойства относительно слабо связаны друг с другом, они по-разному проявляются у разных микроорганизмов. Существуют микроорганизмы, у которых на первый план выходят агрессивные (инвазивные) свойства. К ним относится, например, возбудитель чумы. Хотя Y. pestis и образует экзотоксин («мышиный» токсин), однако основными факторами его патогенности служат те, которые подавляют защитные силы организма, обеспечивая быстрое внутриклеточное размножение возбудителя и распространение его по организму.

В то же время возбудители столбняка, дифтерии и ботулизма, обладая слабыми инфекциозными свойствами, продуцируют сильнейшие экзотоксины, которые и обусловливают развитие болезни, ее патогенез и клинику.

Следовательно, такое сложное биологическое свойство, как патогенность, обусловлено наличием у патогенных бактерий конкретных факторов патогенности, каждый из которых ответствен за проявление определеннных свойств. К ним относятся следующие факторы:

1. Хемотаксис и подвижность (у бактерий, имеющих жгутики). С помощью хемотаксиса бактерии ориентируются в отношении своих клеток-мишеней, а наличие жгутиков ускоряет их приближение к клеткам.

2. Ферменты, разрушающие субстраты слизи, которая покрывает эпителиальные клетки слизистых оболочек. Протеазы, нейраминидазы, лецитиназы и другие ферменты, разрушая слизь, способствуют высвобождению рецепторов, с которыми взаимодействуют микроорганизмы.

3. Факторы адгезии и колонизации, с помощью которых бактерии распознают рецепторы на мембранах клеток, прикрепляются к ним и колонизируют клетки. У бактерий функцию факторов адгезии выполняют различные структуры клеточной стенки: фимбрии, белки наружной мембраны, ЛПС и другие компоненты. Адгезия является пусковым механизмом реализации патогенности. Бактерии могут размножаться либо в клетках, либо на поверхности клеток слизистой (на их мембранах) либо проходить через них и далее распространяться по организму. Поэтому ни один возбудитель, в том числе и вирусы, не может реализовать свою патогенность, если он не способен прикрепиться к клетке (адсорбироваться на ней). В свою очередь и токсины, до тех пор, пока они не свяжутся с рецепторами мембран клеток-мишеней, также не смогут реализовать токсические функции. Поэтому адгезия и колонизация – начальные, пусковые механизмы развития болезни.

4. Факторы инвазии, т. е. факторы, с помощью которых бактерии проникают в клетку. Обычно они сопряжены с факторами, подавляющими клеточную активность и способствующими внутриклеточному размножению бактерий. Факторы инвазии у грамотрицательных бактерий обычно представлены белками наружной мембраны.

5. Факторы, препятствующие фагоцитозу, т. е. защищающие от фагоцитоза. Они также связаны с компонентами клеточной стенки и либо маскируют бактерии от фагоцитов, либо подавляют их активность. Такие факторы есть у многих бактерий. Они представлены либо капсулой из гиалуроновой кислоты, которая не распознается фагоцитами как чужеродная, так как химически не отличается от таковой организма, либо капсулами другой химической природы (у B. anthracis, Y. pestis и т. д.); различными белками, тормозящими фагоцитоз, – белок А (у стафилококков), М-белок (у стрептококков), антиген FraI у возбудителя чумы; пленка из фибрина, образующаяся у стафилококков, имеющих плазмокоагулазу; к их числу относятся также пептидогликан, тейхоевые кислоты и другие компоненты клеточной стенки.

6. Факторы, подавляющие фагоцитоз, например V-W-антигены у Y. pestis. Наличие таких факторов обусловливает незавершенный характер фагоцитоза. Чаще всего он связан с образованием бактериями веществ, которые подавляют «окислительный взрыв» фагоцитов. Незавершенный фагоцитоз – одна из важных причин хронизации течения болезни (хрониосепсис).

7. Ферменты «защиты и агрессии» бактерий. С помощью таких ферментов, как фибринолизин, лецитиназа, гиалуронидаза, протеазы и т. п., бактерии реализуют (наряду с факторами, подавляющими фагоцитоз и защищающими от него) свои агрессивные свойства. Эти ферменты способствуют их распространению в тканях организма. Одним из главных ферментов защиты (например, у стафилококков) является плазмокоагулаза. Превращая фибриноген в фибрин, этот фермент образует своеобразную белковую пленку вокруг клеток, которая и защищает их от фагоцитоза. Патогенность может быть связана и с другими ферментами бактерий, например с аминопептидазами, подавляющими хемотаксис фагоцитов, а также с продуктами жизнедеятельности бактерий, обладающими токсическими свойствами (птомаины и т. п.).

8. Токсины микробов. Различают эндотоксины и экзотоксины. Эндотоксины имеются только у грамотрицательных бактерий. Они представлены липополисахаридами и связанными с ними белками. Особенность эндотоксинов в том, что они термостабильны и высвобождаются из бактериальных клеток после их разрушения. Эндотоксины, в отличие от экзотоксинов, не обладают специфичностью действия. Их токсичность и пирогенность обусловлены липидом А, входящим в состав ЛПС и имеющим сходную структуру у разных грамотрицательных бактерий. Пирогенное действие эндотоксинов не связано с их непосредственным действием на терморегулирующие центры головного мозга. Они индуцируют выброс какого-то пирогенного вещества из полиморфно-ядерных лейкоцитов. Эндотоксины являются воспалительными агентами: они увеличивают проницаемость капилляров и оказывают разрушающее действие на клетки. Их воспалительное и пирогенное действие неспецифично. Многообразие проявлений отравления эндотоксином обусловлено не только самим ЛПС, но и высвобождением многочисленных биологически активных соединений, синтез которых он индуцирует в организме человека и животных (гистамин, серотонин, простагландины, лейкотриены и др., всего более 20). Эти вещества и обусловливают нарушения в различных органах и тканях.

Все три компонента ЛПС – липид А, ядро полисахарида и его боковая цепочка из повторяющихся сахаров – обладают выраженными антигенными свойствами. ЛПС стимулирует синтез интерферонов, активизирует систему комплемента по классическому пути, оказывает митогенное действие на лимфоциты, а также аллергенное действие. Его токсические свойства, в отличие от экзотоксинов, не снимаются при обработке формалином, и ЛПС не превращается в анатоксин.

Экзотоксины. Их продуцируют как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии. У грамположительных бактерий экзотоксины активно секретируются через ЦМ и клеточную стенку в окружающую среду с использованием специальных секретирующих систем. У грамотрицательных бактерий (холерный вибрион, токсигенные кишечные палочки, сальмонеллы) некоторые экзотоксины (энтеротоксины) синтезируются только при определенных условиях непосредственно в инфицированном организме и нередко сохраняются в цитоплазме, освобождаясь из клетки только после ее разрушения.

Основные свойства экзотоксинов

Все известные бактериальные экзотоксины – белки, среди них есть термолабильные и термостабильные. С белковой природой экзотоксинов связаны их основные свойства: они обладают высокой силой действия (самые сильные токсины в природе – микробного происхождения), высокой избирательностью и связанной с ней специфичностью действия (картина столбняка у лабораторных животных одинакова, как при заражении их возбудителем, так и его экзотоксином), которое они проявляют после некоторого латентного периода. Экзотоксины являются сильными антигенами, а некоторые – даже суперантигенами. Они индуцируют образование в организме антител, т. е. антитоксинов, которые нейтрализуют их действие. При обработке формалином экзотоксины обезвреживаются и превращаются в анатоксины. Анатоксины лишены токсических свойств, но сохраняют свою способность индуцировать синтез антитоксинов, поэтому широко используются для создания искусственного иммунитета против дифтерии, столбняка, ботулизма и других заболеваний.

По молекулярной организации различают две основные группы экзотоксинов:

1. Экзотоксины, состоящие из двух фрагментов – А и В. Каждый фрагмент сам по себе не активен. Свойствами токсина они обладают, будучи связанными друг с другом. При этом фрагмент В выполняет две функции – акцепторную (распознает рецептор на мембране и связывается с ним) и формирования внутримембранного канала. Фрагмент А проникает через него в клетку и проявляет в ней токсическую активность, воздействуя на различные процессы метаболизма клетки. Такую структуру имеют, например, энтеротоксины холерного вибриона и патогенных грамотрицательных бактерий.

2. «Разрезанные» токсины. Эти экзотоксины синтезируются в бактериальных клетках в виде единой неактивной полипептидной цепи. В активную форму протоксин превращается в результате разрезания его протеазой. Образующийся при этом активный токсин состоит из двух связанных между собой дисульфидными связями пептидных цепей. Активация токсина (разрезание полипептидной цепи) может осуществляться либо собственной бактериальной протеазой, либо протеазами кишечного тракта макроорганизма. Такой тип экзотоксинов синтезируют Clostridium tetani и C. botulinum, причем в их токсинах содержатся дополнительные белки с иными, нетоксическими свойствами.

Вероятно, существуют микробные экзотоксины и с иной химической структурой. По характеру токсического действия экзотоксины также отличаются друг от друга. Например, экзотоксины с мембрано-повреждающим механизмом действия разрушают эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, базофилы, мастоциты и другие клетки, а также клетки культур тканей, протопласты и сферопласты.

Механизм действия других экзотоксинов связан с нарушением жизненно важных процессов в клетке: подавлением биосинтеза белка (дифтерийный экзотоксин) и переноса электронов по цепи («мышиный» токсин Y. pestis).

Энтеротоксины холерного вибриона и патогенных грамотрицательных бактерий, воздействуя на аденилатциклазную систему энтероцитов, вызывают выход ионов и воды из тканей в кишечник, что и обусловливает патогенез холеры и других форм диареи. Экзотоксин C. botulinum подавляет выделение ацетилхолина в нервно-мышечном синапсе и блокирует передачу нервного импульса на мышечное волокно. Механизм действия экзотоксина C. tetani также связан с торможением передачи синаптических медиаторов (γ-аминомасляной кислоты, ацетилхолина, норадреналина и др.).

Особым образом проявляют свое действие энтеротоксины, продуцируемые стафилококками. Эти белки обладают свойствами суперантигенов, т. е. антигенов, которые стимулируют синтез излишнего количества Т-лимфоцитов. Последние начинают вырабатывать огромное количество интерлейкина-2, а это и приводит к токсическому эффекту. Таким образом, свое отравляющее действие на организм стафилококковые энтеротоксины реализуют через индуцируемый ими синтез интерлейкина-2.

Особенности генетического контроля синтеза факторов патогенности бактерий

У бактерий обнаружено два типа генов, контролирующих синтез факторов патогенности: гены собственной хромосомы клетки и гены, привнесенные в хромосому так называемыми мобильными генетическими элементами. Эта вторая группа включает в себя умеренные конвертирующие фаги, фаги-транспозоны, плазмиды и транспозоны. Мобильными их называют потому, что они содержат собственные генетические компоненты, кодирующие транспозазу, интегразу, а также сайт-специфические участки, которые взаимодействуют со специфическими сайтами хромосомы клетки и обеспечивают интеграцию в нее.

Включение генома (или части генома) профага приводит к образованию в составе хромосомы бактерий островов патогенности (англ. pathogenicity islands), которые содержат ген или кассету генов, контролирующих продукцию основных факторов патогенности. Например, в хромосоме холерного вибриона есть два острова патогенности. В одном из них расположены гены умеренного профага CTXϕ, а в другом – фага VPIϕ. Как правило, гены патогенности, содержащиеся в островах патогенности, регулируются координированно, т. е. функционируют как самостоятельный геном патогенности в составе хромосомы клетки. В результате рекомбинации умеренных фагов с хромосомой бактерий возникли многие патогенные бактерии (Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, EHEC и др.), а в результате переноса генов патогенности плазмидами – Bacillus anthracis, Yersinia pestis, ETEC, EIEC, EPEC и др. Во всяком случае, острова патогенности в форме мобильных генетических элементов обнаружены у многих видов патогенных бактерий, но их нет у близкородственных непатогенных бактерий.

Глава 19

Основные источники инфекции. Пути и способы заражения человека

Основные источники инфекции

Существуют три основных возможных источника инфекции: человек (больной, реконвалесцент, бактерионоситель), животные и объекты внешней среды, служащие естественной средой обитания некоторых патогенных бактерий или контаминированные выделениями от больных людей или животных. В соответствии с этим различают болезни: антропонозные (ими болеют только люди, например, брюшной тиф, дизентерия, холера и др.); зоонозные (греч. zoon – животное и nosos – болезнь, ими болеют только животные, например, чума рогатого скота, чума свиней и др.); зооантропонозные (ими болеют и животные, и заражающиеся от них люди). Существует около 100 зооантропонозных болезней (чума, туляремия, бруцеллез, лептоспироз и др.), некоторые их них – в виде естественных природных очагов. Чаще всего это связано с тем, что переносчиками возбудителей заболеваний являются кровососущие членистоногие, в организме которых возбудитель может сохраняться продолжительное время, иногда пожизненно, и даже трансовариально передаваться потомству. Такие природные очаги, например некоторых риккетсиозов, туляремии, вирусных энцефалитов и других заболеваний, при которых переносчиками являются различные виды иксодовых, гамазовых, краснотелковых клещей и других кровососущих членистоногих, имеются в различных странах мира. Их длительное существование объясняется тем, что в дополнение к инфицированным позвоночным животным присутствует второй длительно действующий резервуар возбудителя – инфицированные членистоногие, для которых позвоночные являются прокормителями. В других случаях передача возбудителя в природных очагах от больного животного к здоровому может происходить при их совместном содержании с помощью прямого или непрямого контакта (например, в очагах лептоспирозов, Ку-лихорадки и т. п.). Таким образом, в природных очагах, благодаря постоянно действующей цепи передачи возбудителя: больное животное → кровососущие членистоногие (или различные факторы внешней среды) → здоровое животное – сложились естественные резервуары возбудителей многих заболеваний. Человек, включаясь в эту цепь, может заразиться либо через укусы кровососущих переносчиков, либо путем прямого или непрямого контакта с инфицированными животными. Особенно большая опасность заражения в постоянно действующих природных (эндемических) очагах существует для вновь прибывающих в эти очаги людей, так как лица, постоянно в них проживающие, нередко переносят эти заболевания в раннем возрасте и приобретают к ним иммунитет.

Третьим постоянным источником заражения человека является сама внешняя среда, главным образом, почва и вода. В почве постоянно находятся патогенные бактерии из рода Clostridium – возбудители раневых инфекций и ботулизма, может долго сохраняться возбудитель сибирской язвы. Кроме того, нормальными обитателями почвы и некоторых водоемов являются возбудители сапронозных заболеваний (греч. sapros – гнилой и nosos – болезнь, т. е. болезни, вызываемые возбудителями, средой обитания которых служат гниющие растения) – легионеллы, иерсинии и др. Обитателями прибрежной морской воды и разнообразных морских организмов являются некоторые виды вибрионов, способные вызывать заболевание человека. Особенно важную роль в эпидемиологии кишечных инфекций играют инфицированные вода и пищевые продукты.

Пути заражения человека

Заражение человека патогенными микроорганизмами может произойти только через поврежденную кожу и слизистые оболочки глаза, дыхательных, пищеварительных и мочеполовых путей. Заражение через неповрежденную кожу если и возможно, то происходит исключительно редко, так как кожа для большинства микроорганизмов трудно проницаема. Однако даже самые ничтожные повреждения ее (укус насекомого, укол иглой, микротравмы и т. п.) могут стать причиной заражения. Место проникновения возбудителя в организм человека или животного называется входными воротами инфекции. В случае, если ими является слизистая оболочка, возможны три типа инфекции: размножение возбудителя на поверхности эпителиальных клеток; проникновение его в клетки с последующим внутриклеточным размножением; проникновение возбудителя через клетки и распространение его по организму.

Способы заражения

Заражение человека происходит одним из следующих способов:

1. Воздушно-капельным или воздушно-пылевым.

2. Фекально-оральным. Возбудитель выделяется с испражнениями или мочой, заражение происходит через рот при употреблении инфицированных пищевых продуктов или воды.

3. Трансмиссивным, т. е. через укусы кровососущих членистоногих.

4. Контактным – прямой контакт с больным, реконвалесцентом, бактерионосителем или через загрязненные предметы обихода, т. е. непрямым контактом.

5. Половым путем.

6. При использовании нестерильных медицинских приборов, особенно шприцев и т. п.

7. Вертикальным, т. е. от матери ребенку через плаценту, во время родов или сразу после них.

Способ заражения, от которого зависит локализация входных ворот возбудителя, имеет немаловажное значение для развития болезни, так как некоторые возбудители могут проникать в организм разными способами. Например, в случае заражения Y. pestis через укусы насекомых (блох) чума протекает в относительно более легкой бубонной форме, а при заражении воздушно-капельным путем развивается наиболее тяжелая форма этой болезни – легочная чума. Точно так же, в зависимости от способа заражения, наблюдаются различные клинические формы туляремии: бубонная или язвенно-бубонная (при трансмиссивном заражении через укусы кровососущих членистоногих), глазо-бубонная (при заражении через слизистую глаза), легочная (при воздушно-пылевом заражении) и т. д.; сибирской язвы (кожная, легочная, кишечная).

Однако для других возбудителей, например ВИЧ, способ заражения не имеет значения: заболевание развивается в одинаковой степени тяжело. В то же время для многих возбудителей существуют преимущественные способы заражения макроорганизма, так, для возбудителей кишечных инфекций – фекально-оральный; возбудителей респираторных заболеваний – воздушно-капельный и др.

Распространение проникших в организм возбудителей может происходить по-разному, в зависимости от свойств возбудителя и имеющихся в клетках ткани рецепторов для них: контактным путем, т. е. от клетки к клетке, лимфогенным или гематогенным путем; некоторые возбудители распространяются по нервным путям.

Кровь здорового человека и животного стерильна, ибо она обладает сильным антимикробным свойством, обусловленным наличием в ней системы комплемента и различных иммунокомпетентных клеток. Однако почти при всех инфекционных процессах в крови появляются и циркулируют в течение различного срока возбудитель заболевания или его токсин, а также образующиеся при распаде возбудителя антигены. Через кровь очень часто происходит распространение возбудителя по организму, т. е. генерализация инфекционного процесса. Выход возбудителя или его антигенов в большом количестве в кровь, как правило, сопровождается лихорадкой, которая не только служит сигналом попадания возбудителя в кровь, но и имеет защитное значение.

Для характеристики явлений, связанных с проникновением в кровь возбудителя, его токсина и антигенов, введены следующие понятия: антигенемия, бактериемия, вирусемия, сепсис, септикопиемия, септицемия, токсемия, токсинемия.

Антигенемия (антиген + греч. haima – кровь) – циркуляция в крови чужеродных антигенов и аутоантигенов. При наличии в крови антител к данному антигену формируются циркулирующие иммунные комплексы – ЦИК (антиген + антитело), способствующие очищению организма от антигенов. С помощью ЦИК антигены выводятся из организма. Выявляют антигены и ЦИК в крови с помощью различных серологических реакций, например, при бруцеллезе – с помощью реакции агрегат-гемагглютинации.

Бактериемия – наличие в циркулирующей крови бактерий – возникает в результате проникновения возбудителя в кровь через естественные барьеры макроорганизма, а также при трансмиссивных инфекциях после укуса кровососущих членистоногих. При заболеваниях, которые передаются членистоногими (сыпной тиф, возвратный тиф, чума, туляремия, риккетсиозы и т. д.), бактериемия – главная и обязательная стадия патогенеза болезни. Она обеспечивает передачу возбудителя другому хозяину, т. е. сохраняет его как вид. Причиной бактериемии могут быть хирургические вмешательства, травмы, лучевая болезнь, злокачественные опухоли, различные тяжелые формы заболеваний, вызванные условно-патогенными бактериями, и т. п. В отличие от сепсиса и септикопиемии, бактерии в крови только циркулируют, но не размножаются. Таким образом, бактериемия – симптом болезни и одна из ее стадий. Диагноз бактериемии ставится путем выделения гемокультуры возбудителя или заражения кровью больного лабораторного животного.

Вирусемия – состояние организма, при котором в его крови циркулируют вирусы.

Сепсис, или гнилокровие (греч. sepsis – гниение) – тяжелое генерализованное острое или хроническое лихорадочное заболевание человека, обусловленное непрерывным или периодическим поступлением в кровь возбудителя из очага гнойного воспаления. Для сепсиса характерно несоответствие тяжелых общих расстройств местным изменениям и частое образование новых очагов гнойного воспаления в различных тканях и органах.

В отличие от бактериемии, при сепсисе из-за снижения бактерицидных свойств крови возбудитель размножается в кровеносной и лимфатической системах.

Чаще всего сепсис является следствием генерализации локализованных гнойных очагов. Этиология сепсиса разнообразна. Наиболее частые его возбудители – стафилококки, стрептококки, грамотрицательные бактерии из семейств Enterobacteriaceae и Pseudomonadaceae, менингококки, другие бактерии, в том числе условно– и слабопатогенные, и некоторые грибы. В зависимости от локализации первичного гнойного очага и места входных ворот возбудителя различают пуэрперальный (послеродовый), отогенный, одонтогенный, послеабортный, перитонеальный, раневой, ожоговый, пупочный, ротовой (стоматогенный), уросепсис и другие формы болезни. Может наблюдаться сепсис новорожденных (неонатальный сепсис), обусловленный инфицированием плода при родах или в период внутриутробного развития. Кроме того, бывает сепсис криптогенный, при котором первичный очаг гнойного воспаления остается нераспознанным.

Септикопиемия – форма сепсиса, при которой наряду с интоксикацией организма происходит образование гнойных метастатических очагов в различных тканях и органах, сочетающееся с присутствием и размножением возбудителя в лимфатической и кровеносной системах.

Септицемия – форма сепсиса, при которой не происходит образования метастатических очагов гнойного воспаления, а единственным местом обитания и размножения возбудителя в организме служат его кровеносная и лимфатическая системы.

Токсемия – состояние организма человека или животного, при котором в его крови циркулируют бактериальные эндотоксины. Наблюдается при тяжелых формах заболеваний, вызванных грамотрицательными бактериями, имеющими эндотоксин (ЛПС), например при сальмонеллезах, эшерихиозах, менингококковых и иных инфекциях. Нередко сочетается с бактериемией и сепсисом.

Токсинемия – состояние организма, при котором в кровеносной системе циркулирует бактериальный экзотоксин или другой токсин. Возбудитель при этом в крови, как правило, отсутствует, а токсин через кровеносную или нервную систему проникает в клетки-мишени. Наблюдается при заболеваниях, возбудители которых продуцируют экзотоксины (ботулизм, дифтерия, столбняк, анаэробная инфекция и др.; поэтому эти болезни называют токсинемическими).

Отдельные виды патогенных микроорганизмов могут поражать любые органы и ткани (возбудитель туберкулеза, патогенные стафилококки и др.). В то же время есть возбудители, для которых характерна органотропность, т. е. способность избирательно поражать определенные ткани. Так, возбудитель туберкулеза чаще всего поражает легочную ткань, гонококки – слизистую уретры и конъюнктиву глаза, вирусы гепатитов – клетки печени, вирус гриппа – слизистую верхних дыхательных путей и т. д. Избирательностью действия обладают и бактериальные экзотоксины. Такая органотропность возбудителей и их токсинов определяется, по-видимому, тремя обстоятельствами. Во-первых, наличием для возбудителей и их экзотоксинов соответствующих рецепторов на мембранах клеток. Во-вторых, особенностями метаболизма микроорганизмов, в соответствии с которыми они находят оптимальные условия для размножения в определенных клетках (или на определенных клетках). В-третьих, это зависит от наличия или отсутствия в данной ткани антимикробных веществ типа лизоцима, ингибина, интерферона и других, подавляющих размножение возбудителя. Локализацией возбудителя в организме определяются и пути его выделения – с испражнениями, мочой, гнойно-воспалительным материалом, мокротой, слюной, слизью и т. п. Эти выделения, а также кровь, спинномозговая жидкость, пунктат лимфоидной ткани и служат чаще всего материалом для бактериологической диагностики инфекционных заболеваний. Знание источников инфекции, свойств возбудителя, путей и способов заражения при инфекционных заболеваниях лежат в основе организации и проведения всех противоэпидемических мероприятий, а также в выборе методов микробиологической диагностики.

Места обитания в организме человека основных возбудителей бактериальных инфекций приведены в табл. 6 (Покровский В. И. [и др.], 1991).


Таблица 6

Преимущественные места обитания в организме человека основных возбудителей бактериальных инфекций и микозов

Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Примечание: +обнаруживаются часто; ± наличие возможно; – обнаруживаются редко.


Глава 20

Микробиологические основы химиотерапии инфекционных заболеваний

На современном этапе развития медицины антибиотики – наиболее эффективные препараты для лечения заболеваний, вызываемых микроорганизмами.

Понятие «антибиотики» предложено С. Ваксманом. Под антибиотиками он понимает такие «химические вещества, образуемые микроорганизмами, которые обладают способностью подавлять рост или даже разрушать бактерии и другие микроорганизмы».

Однако З. В. Ермольева дала более широкое толкование этому понятию: «Антибиотики – вещества природного происхождения, обладающие выраженной биологической активностью. Они могут быть получены из микробов, растений, животных тканей и синтетическим путем».

Каждый антибиотик обладает специфическим избирательным действием на определенные виды микробов. Благодаря такому избирательному действию многие антибиотики способны подавлять жизнедеятельность патогенных микробов в безвредных для организма концентрациях. Такие антибиотики широко используют для лечения различных инфекционных болезней.

Основными продуцентами антибиотиков служат микроорганизмы, обитающие в почве и воде, где они постоянно вступают между собой в самые разнообразные взаимоотношения. Последние могут быть нейтральными, взаимовыгодными (например, деятельность гнилостных бактерий создает условия для деятельности нитрифицирующих бактерий), но очень часто они являются антагонистическими. И это понятно. Только таким путем в природе могло сложиться сбалансированное сосуществование громадного числа видов живых существ. Антагонистические взаимоотношения между бактериями наблюдал еще Л. Пастер. И. И. Мечников предложил использовать антагонизм между бактериями на пользу человеку. Он, в частности, рекомендовал подавлять активность гнилостных бактерий в кишечнике человека, продукты жизнедеятельности которых, по его мнению, сокращают жизнь человека, молочнокислыми бактериями.

Механизмы микробного антагонизма различны. Они могут быть связаны с конкуренцией за кислород и питательные вещества, с изменением рН среды в сторону, неблагоприятную для конкурента, и т. д.

Одним из универсальных механизмов микробного антагонизма является синтез химических веществ-антибиотиков, которые либо подавляют рост и размножение других видов микроорганизмов (бактериостатическое действие), либо убивают их (бактерицидное действие).

Источники антибиотиков в природе неисчерпаемы. Их обнаружены тысячи, но далеко не все из них могут быть использованы в медицине. Чтобы быть хорошим лечебным средством, антибиотик должен иметь по крайней мере некоторые обязательные свойства.

1. При низкой концентрации (10 – 30 мкг/мл) он должен убивать возбудителя болезни или подавлять его рост и размножение.

2. Активность антибиотика не должна существенно снижаться под действием жидкостей организма.

3. Он должен быстро воздействовать на микроорганизм, чтобы за короткий срок прервать его жизненный цикл.

4. Антибиотик не должен вредить макроорганизму. Аллергенность и токсичность и после введения разовой дозы, и после многократного введения должны отсутствовать.

5. Антибиотик не должен препятствовать процессу выздоровления.

6. Антибиотик не должен снижать и тем более подавлять иммунологические реакции. Он не должен наносить никакого ущерба иммунной системе организма.

Правда, здесь есть исключения. Речь идет о поиске таких антибиотиков, которые бы подавляли трансплантационный иммунитет. К числу последних относится циклоспорин А, который обладает мощным иммуносупрессивным действием. Однако его широкому применению препятствует цитотоксическое действие на почки. Поэтому поиск иммуносупрессивных антибиотиков, лишенных токсических свойств, представляет большой интерес.

Наконец, исключительное значение представляет поиск таких антибиотиков, которые бы обладали способностью стимулировать противоопухолевый иммунитет. К сожалению, успехи в этом направлении пока очень скромны, хотя и не безнадежны.

Наступлению эры антибиотикотерапии предшествовал длительный период разработки эффективных методов химиотерапии. Медицину всегда привлекала идея таких химических препаратов, которые бы избирательно, не нанося вреда макроорганизму, воздействовали на возбудителя какой-либо болезни, а еще лучше – на многих возбудителей.

Датой зарождения научной химиотерапии следует считать 1891 г., когда русский врач Д. А. Романовский впервые доказал возможность воздействия лекарственного средства на возбудитель в организме человека (хинина на малярийный плазмодий) и впервые сформулировал основные принципы химиотерапии инфекционных болезней вообще.

Эти принципы получили дальнейшее использование и развитие в классических работах П. Эрлиха, который применил метод химической вариации исходных антибактериальных веществ и ввел понятие химиотерапевтического индекса для оценки качества лечебных препаратов. Индекс представляет собой отношение максимальной переносимой дозы к минимальной лечебной дозе и не должен быть менее 3.

В результате для лечения инфекционных болезней стали применять самые различные препараты, в том числе мышьяковистые – сальварсан, новарсенол и другие для лечения сифилиса, возвратного тифа и других болезней; висмута – для лечения энтероколитов, а сейчас и язвы желудка и двенадцатиперстной кишки; производные сурьмы, ртути, акридина, препараты нитрофуранового ряда (фуразолидон, фурадонин и др.); различные противомалярийные средства (акрихин, плазмоцид, бигумаль, хлоридин, хиноцид и др.); производные парааминосалициловой кислоты (ПАСК) и изоникотиновой кислоты, которые применяют для лечения туберкулеза, а также различные другие химические соединения.

Большую роль в развитии химиотерапии сыграли работы Г. Домагка, в результате которых в 1932 г. был открыт путь к созданию большого семейства сульфаниламидных препаратов (стрептоцид, норсульфазол, сульфазин, метилсульфазин, сульфадимезин, фталазол, сульгин и др.).

Сульфаниламидные препараты оказались весьма эффективным средством для лечения различных гнойно-воспалительных заболеваний, пневмонии, дизентерии и других болезней.

Однако поистине революционное значение для медицины имело открытие антибиотиков, которые по своей антибактериальной эффективности превзошли все применявшиеся ранее химиопрепараты.

История открытия антибиотиков связана с именами английского ученого А. Флеминга и американских ученых Г. Дюбо и С. Ваксмана. А. Флеминг в 1929 г. установил, что фильтрат культуры плесневого гриба Penicillium notatum содержит какое-то вещество, угнетающее рост стафилококка. Это вещество и получило название пенициллина. Однако в чистом виде препарат был получен лишь в 1940 г., после чего стало возможным установить его химическую природу, а затем и наладить промышленное производство этого препарата, оказавшегося истинным королем антибиотиков по силе воздействия на бактерии и относительной безвредности для человека. Г. Дюбо выделил из культуры Bacillus brevis два антибиотика – тироцидин и грамицидин, однако они не получили столь широкого применения, как пенициллин. Последний оказался очень эффективным для лечения гнойно-воспалительных заболеваний, вызываемых стафилококками, которые по своей частоте всегда занимали ведущее место среди прочих бактериальных инфекций. Вместе с тем пенициллин оказался эффективным средством и против других видов грамположительных бактерий.

С. Ваксман открыл ряд антибиотиков, продуцентами которых были различные виды актиномицетов, и в том числе в 1944 г. – стрептомицин; его продуцентом является Actinomyces griseus.

Значение открытия стрептомицина заключается в том, что он и его производные оказались очень эффективными препаратами для лечения туберкулеза и чумы. Кроме того, стрептомицин оказался гораздо более эффективным, чем пенициллин, против грамотрицательных бактерий.

В связи с открытием пенициллина и стрептомицина стало возможным успешно лечить б^ольшую часть бактериальных инфекций. Фактически в течение двух десятилетий (с 1940 по 1960 гг.) были открыты все наиболее часто применяемые антибиотики: стрептомицин (1944); хлорамфеникол, полимиксин (1947); хлортетрациклин (1948); бензилпенициллин, неомицин (1949); нистатин (1950); эритромицин, циклосерин (1952); новобиоцин (1953); олеандомицин (1954); канамицин (1955); леворин (1959). Темпы изыскания новых и совершенствования препаратов на основе старых антибиотиков не снижаются. Возникла и развивается быстрыми темпами промышленность, в том числе на основе биологической технологии, производящая антибиотики в огромном количестве. Если в 1943 г. было произведено всего 13 кг пенициллина, то сейчас ежегодно выпускаются десятки тысяч тонн антибиотиков все новых и новых поколений. Одних только антибиотиков пенициллинового ряда (бета-лактамные антибиотики) выпускается около 100 наименований препаратов. Они по-прежнему занимают доминирующее положение в клинике.

Результаты применения антибиотиков в медицине оказались исключительно впечатляющими. Они во много раз сократили смертность, особенно детскую, от инфекционных болезней, смягчили тяжесть их течения, уменьшили количество постинфекционных осложнений. В результате применения антибиотиков уже к концу 50-х гг. XX в. средняя продолжительность жизни людей на Земле, особенно в развивающихся странах, заметно выросла. Не менее важную роль сыграли и играют антибиотики и в сельском хозяйстве, особенно в животноводстве и птицеводстве, для лечения и профилактики инфекционных заболеваний среди поголовья скота и птиц.

Широкое применение сульфаниламидных препаратов и особенно антибиотиков породило новую сложную проблему – проблему лекарственной устойчивости микроорганизмов. Ее последствия и меры борьбы с ней лучше всего можно проследить на примере антибиотиков пенициллинового ряда.

Пенициллины – это сложные соединения, основу молекул которых составляет бета-лактамное кольцо, общая структура их представлена на рис. 55. Буквой R обозначен радикал, который может иметь различное строение, в соответствии с которым известно большое число природных типов пенициллинов. Наиболее активным из них оказался бензилпенициллин с радикалом С6Н5– СН2– .

До 1945 г. процент стафилококков, устойчивых к пенициллину, не превышал 5 – 10 %. Однако по мере все более широкого использования антибиотиков возрастало и количество устойчивых к нему штаммов, и к началу 1960-х гг. оно уже достигло 75 – 80 %. Это повлекло за собой и резкое снижение эффективности лечения пенициллином. Стали искать пути преодоления резистентности к нему. Решению этой проблемы помогло изучение путей биосинтеза пенициллина. В качестве продукта его биосинтеза в 1959 г. была выделена 6-аминопенициллановая кислота (рис. 56).


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 55. Структура пенициллинов


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 56. 6-Аминопенициллановая кислота (6-АПК)


C открытием 6-АПК как основной бициклической системы, которая входит в состав молекулы антибиотика, появилась возможность синтеза путем ацилирования свободной аминной группы пенициллинов нового поколения – полусинтетических пенициллинов: метициллина, ампициллина, оксациллина, клоксациллина и т. д. Их преимущество перед бензилпенициллином заключается в том, что, обладая сходным с бензилпенициллином спектром антибактериального действия, они оказались активными в отношении пенициллинрезистентных штаммов, за исключением ампициллина, но зато последний оказался активным в отношении многих грамотрицательных бактерий. Однако постепенно и к этим новым пенициллинам появились резистентные штаммы стафилококков и других бактерий.

Их резистентность, как и резистентность к бензилпенициллину, оказалась связанной с образованием ферментов, разрушающих бета-лактамное кольцо, – бета-лактамаз. Следующим шагом на пути преодоления устойчивости к пенициллиновым антибиотикам стало получение антибиотиков цефалоспоринов, продуцентами которых служат грибы рода Cephalosporium. Цефалоспорины по биологическим свойствам и химическому строению принадлежат к пенициллинам, но несколько отличаются от них. Ядро молекулы цефалоспоринов составляет 7-аминоцефалоспорановая кислота, которая послужила основой для получения новых препаратов цефалоспоринов (рис. 57). Они, в отличие от пенициллинов, обладают значительно меньшей аллергической активностью и более широким спектром действия, подавляют развитие как грамположительных (в том числе устойчивых к пенициллинам), так и грамотрицательных бактерий.

Например, цефтриаксон – цефалоспорин третьего поколения – устойчив к беталактамазам, имеет широкий спектр действия – подавляет грамположительные и грамотрицательные бактерии, аэробные и некоторые анаэробные. Но и к цефалоспоринам появились резистентные штаммы бактерий, обладающие бета-лактамазами, способными разрушать молекулу цефалоспорина. Бета-лактамазы – один из главных факторов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам большинства бактерий. Существуют различные классы бета-лактамаз, продуцируемых разными видами бактерий и отличающихся друг от друга по специфичности действия в отношении различных пенициллинов и цефалоспоринов. При этом инактивация последних происходит либо вне клетки, либо внутри ее. Бета-лактамазы гидролизуют пенициллины и цефалоспорины, в результате чего они не успевают проявить свое антимикробное действие. Гены, контролирующие синтез бета-лактамаз, могут быть хромосомными или плазмидными. Бета-лактамазы хромосомного происхождения могут быть конститутивными или индуцибельными.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 57. 7-Аминоцефалоспорановая кислота (7-АЦК)


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 58. Клавулановая кислота


Для преодоления устойчивости к бета-лактамным антибиотикам использован принципиально новый подход. Он заключается в поиске таких антибиотиков, которые бы разрушали бета-лактамазу. Наиболее мощным ингибитором бета-лактамаз 2 – 5-го классов оказалась клавулановая кислота (рис. 58).

Ее продуцентом является один из видов Streptomyces. Подобно пенициллинам и цефалоспоринам, клавулановая кислота содержит бета-лактамное кольцо, но сама по себе – слабый антибиотик. Зато ее молекула способна проникать в активный центр беталактамазы и вызывать реакции, в результате которых молекула бета-лактамазы ацилируется, и фермент утрачивает свою активность.

На основе амоксициллина – пенициллина широкого спектра действия – и клавулановой кислоты (ингибитора бета-лактамазы) синтезирован комбинированный антибиотик – аугментин. Использование амоксициллина, а не ампициллина, обусловлено тем, что амоксициллин обладает более сильным бактерицидным действием и лучше проникает в ткани и жидкости организма. Резистентные к амоксициллину бактерии также являются чувствительными к аугментину. По своей антибактериальной активности аугментин превосходит большинство антибиотиков широкого спектра. Он активен в отношении грамположительных и грамотрицательных, аэробных и анаэробных бактерий, в том числе и тех, которые вырабатывают беталактамазу. Поэтому он незаменим при инфекциях, где имеется ассоциация разных возбудителей, например при различных гнойно-воспалительных заболеваниях, септицемиях, в случае смешанных аэробно-анаэробных инфекций, а также для эмпирического лечения в тех случаях, когда возбудитель болезни еще не установлен.

Другим примером комбинированного препарата является сулациллин, который состоит из сульбактама – ингибитора бета-лактамаз грамположительных и грамотрицательных бактерий – и ампициллина.

Таким образом, арсенал бета-лактамных антибиотиков по мере появления резистентных к ним форм бактерий пополняется все новыми и новыми препаратами.

Основные группы антибиотиков

По направленности (или объекту) действия все антибиотики можно разделить на следующие основные группы:

1) противобактериальные препараты;

2) противогрибковые препараты;

3) противовирусные препараты;

4) противоопухолевые антибиотики.

Некоторые авторы относят к антибиотикам не только те химические вещества, которые синтезируются микроорганизмами, но и неприродные соединения, синтезируемые химическими способами, полагая, что дело не столько в происхождении препарата, сколько в его антимикробной активности и полезности для человека.

Противобактериальные антибиотики

Наиболее обширную группу составляют антибактериальные препараты. К ним относятся:

1. Бета-лактамные антибиотики, включающие природные пенициллины, несколько поколений полусинтетических пенициллинов (метициллин, оксациллин, ампициллин, аугментин, карбенициллин, амоксициллин, сулациллин и др.), несколько поколений цефалоспоринов (цефалоридин, цефаметин, цефиксим, цефетамин, цефтриаксон, цефоперазон и др.), нетрадиционные бета-лактамы (карба– и оксапенемы; карба– и оксацефемы и др.). Всего группа бета-лактамных антибиотиков включает в себя около 100 препаратов, активных против многих грамположительных и грамотрицательных, аэробных и анаэробных бактерий.

2. Стрептомицины и стрептомициноподобные антибиотики, активные против возбудителей туберкулеза, особо опасных инфекций и ряда грамотрицательных бактерий.

3. Макролиды – антибиотики, содержащие в своем составе макроциклическое лактонное кольцо, связанное с углеводными остатками. К этой группе относятся эритромицин, олеандомицин, карбомицин. Макролиды активны в отношении грамположительных бактерий (стафилококки, стрептококки и др.), а также в отношении некоторых грамотрицательных бактерий (бруцеллы, холерный вибрион, риккетсии и др.).

4. Аминогликозиды – антибиотики олигосахаридной или псевдоолигосахаридной природы: гентамицин, неомицин, канамицин, мономицин, а также тобрамицин, амикацин, сизомицин, нетилмицин. Гентамицин обладает широким спектром действия, подавляет рост многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, высокоактивен против псевдомонад, протея. Антимикробные спектры мономицина, неомицина и канамицина близки к спектру гентамицина, но они уступают ему по активности.

5. Тетрациклины. Основой молекулы этих антибиотиков является полифункциональное соединение – тетрациклин. К этой группе относятся антибиотики с широким спектром действия, активные против многих грамположительных и грамотрицательных бактерий: хлортетрациклин, окситетрациклин, тетрациклин и их производные.

6. Гликопептиды – высокомолекулярные соединения, содержащие углеводы и аминокислоты: ванкомицин, ристомицин, линкомицин, клиндамицин, эремомицин и др. Действуют на многие грамположительные кокки и палочки, неактивны в отношении грамотрицательных бактерий. Ванкомицин применяют для лечения псевдомембранозного колита, вызванного Clostridium difficile. Этот колит часто возникает на фоне применения антибиотиков – антибиотикоассоциированный колит. Для его лечения хорош также эремомицин.

7. Хлорамфеникол (левомицетин) также является антибиотиком широкого спектра действия, активен в отношении многих видов грамотрицательных, включая риккетсии и спирохеты, и грамположительных бактерий. Большинство штаммов бактерий, устойчивых к пенициллинам, стрептомицинам и другим антибиотикам, сохраняет чувствительность к левомицетину.

8. Противотуберкулезные антибиотики. Как уже отмечалось, противотуберкулезной активностью обладают производные парааминосалициловой кислоты (препараты ПАСК), изоникотиновой кислоты (изониазиды), а также стрептомицин и его производные. Они составляют препараты первого ряда. К противотуберкулезным препаратам второго ряда относятся флоримицин, циклосерин и рифампицины. К рифампицинам высоко чувствительны также стафилококки, стрептококки, грамотрицательные кокки, многие не образующие спор анаэробы, сальмонеллы, возбудители особо опасных инфекций и другие бактерии – внутриклеточные паразиты.

9. Фосфомицины – антибиотики из группы фосфоновой кислоты. Фосфомицин обладает сильным бактерицидным действием на грамотрицательные бактерии (Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Serratia, Salmonella, Shigella и другие роды).

10. Неприродные соединения – фторхинолоны. В клинике уже применяют около десяти фторхинолоновых препаратов (ципрофлоксацин, нефлоксацин, офлоксацин, ципробан и др.). Они обладают бактерицидным действием на многие грамотрицательные бактерии, в том числе на возбудителей самых тяжелых заболеваний. По своей эффективности фторхинолоны не уступают цефалоспоринам 3-го и 4-го поколений.

Пять групп антибиотиков обладают наиболее широким спектром антимикробного действия: бета-лактамы, фторхинолоны, аминогликозиды, тетрациклины и хлорамфеникол.

К препаратам, обладающим противогрибковым действием, относятся леворин, нистатин, амфотерицин В и некоторые другие полиеновые (содержащие сопряженные двойные связи) антибиотики, а также гризеофульвин, низорал, 5-фторцитозин (флуцитозин) – препараты группы имидазолов.

Противовирусные препараты

К этой группе относятся прежде всего интерфероны. Они активны против ДНКи РНК-содержащих вирусов. Других препаратов, которые бы обладали широким противовирусным действием, пока не найдено. В связи с этим все бo^льшая роль придается синтетическим индукторам эндогенных интерферонов. Наиболее активны два из них – амиксин и арбидол. Синтезированы также препараты, обладающие прямым антивирусным действием, – альгирем (римантадин), ацикловир, азидотимидин и др. Жизненный цикл вирусов настолько тесно связан с жизнью клетки, что найти или синтезировать такое химическое вещество, которое бы избирательно действовало только на вирус и не влияло на жизнь клетки-хозяина, оказалось значительно труднее. Однако поиски таких препаратов интенсивно ведутся.

Противоопухолевые антибиотики

Исследованы тысячи образцов антибиотиков для выявления таких, которые бы обладали высокой противоопухолевой эффективностью. Однако для клинического использования пока допущено всего лишь несколько антибиотиков: из группы антрациклинов – доксорубицин (адриамицин), акларубицин и рубомицин (даунорубицин); из группы актиномицинов – актиномицины С и Д; из группы ауреоловой кислоты – оливомицин; из группы стрептонигрина – брунеомицин.

Механизм действия антибиотиков

Всем антибиотикам свойственна избирательность действия. Их относительная безвредность для человека определяется прежде всего тем, что они специфически подавляют такие метаболические процессы в микробной клетке или у вируса, которые отсутствуют в эукариотной клетке или не доступны для них. В этом отношении уникален механизм действия бета-лактамных антибиотиков. Мишенями для них являются транспептидазы, которые завершают синтез пептидогликана клеточной стенки. Поскольку клеточная стенка есть только у прокариот, в эукариотной клетке нет мишеней для бета-лактамных антибиотиков. Транспептидазы представляют собой набор белков-ферментов, локализованных в цитоплазматической мембране бактериальной клетки. Отдельные бета-лактамы различаются по степени сродства к тому или иному ферменту, которые получили название пенициллинсвязывающих белков. Поэтому биологический эффект бета-лактамных антибиотиков различен – от бактериостатического до бактерицидного, литического.

Кроме бета-лактамных антибиотиков, синтез клеточной стенки нарушают такие антибиотики, как бацитрацин, фосфомицин, циклосерин, ванкомицин, ристомицин, однако иным путем, чем пенициллин. Все они, кроме циклосерина, вызывают бактерицидный эффект.

Механизм действия таких антибиотиков, как хлорамфеникол, тетрациклины, стрептомицин, аминогликозиды, эритромицин, олеандомицин, спирамицин и другие макролиды, линкозамиды, фузидиевая кислота, пуромицин, связан с угнетением синтеза белка на уровне рибосом 70S. Хотя бактериальные рибосомы 70S имеют такую же в принципе структуру, как рибосомы 80S эукариотных клеток, их белки и белковые факторы, участвующие в работе белоксинтезирующей системы, отличаются от таковых рибосом 80S. Этим и объясняется избирательность действия указанных антибиотиков на белковый синтез бактерий.

Антибиотики по-разному блокируют синтез белка. Тетрациклины блокируют связывание аа-тРНК на А-участке рибосомы 70S. Хлорамфеникол подавляет пептидилтрансферазную реакцию. Стрептомицины препятствуют превращению инициаторного комплекса в функционально активную рибосому. Эритромицин блокирует реакцию транслокации. Пуромицин, присоединяясь к растущему концу синтезируемой полипептидной цепи, вызывает преждевременное отделение ее от рибосомы. Механизм действия фторхинолонов связан с избирательным подавлением ими бактериальных ферментов ДНК-гираз, участвующих в репликации ДНК. Фторхинолоны связываются со специфическими участками ДНК, которые создаются под воздействием ДНК-гиразы, и подавляют ее активность.

Рифампицины угнетают активность ДНК-зависимых РНК-полимераз, вследствие чего у бактерий подавляются процессы транскрипции.

Активность противоопухолевых антибиотиков связана с тем, что они либо подавляют синтез ДНК (брунеомицин), либо подавляют активность ДНК в системе ДНК-зависимой РНК-полимеразы, т. е. блокируют транскрипцию (антрациклины, актиномицины, оливомицин).

Лекарственная устойчивость бактерий

Существуют два типа лекарственной устойчивости бактерий: естественная, или природная, и приобретенная.

Естественная лекарственная устойчивость является видовым признаком. Она присуща всем представителям данного вида и не зависит от первичного контакта (контактов) с данным антибиотиком, в ее основе нет никаких специфических механизмов. Чаще всего эта резистентность связана с недоступностью мишеней для данного антибиотика, обусловленной очень слабой проницаемостью клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, или какими-либо другими причинами. Если низкая проницаемость свойственна нескольким антибиотикам, то она будет обусловливать полирезистентность таких бактерий.

Приобретенная лекарственная устойчивость возникает у отдельных представителей данного вида бактерий только в результате изменения их генома. Возможны два варианта генетических изменений. Один из них связан с мутациями в тех или иных генах бактериальной хромосомы, вследствие которых продукт атакуемого гена перестает быть мишенью для данного антибиотика. Это происходит либо вследствие изменения структуры белка, либо потому, что он становится недоступным для антибиотика.

В другом случае бактерии становятся устойчивыми к антибиотику или даже сразу к нескольким антибиотикам благодаря приобретению дополнительных генов, носителями которых являются R-плазмиды. Никаких других механизмов приобретенной лекарственной устойчивости не существует. Однако, приобретая устойчивость к антибиотику, а тем более сразу к нескольким антибиотикам, такие бактерии получают наивыгоднейшие преимущества: благодаря селективному давлению антибиотиков происходит вытеснение чувствительных к ним штаммов данного вида, а антибиотикоустойчивые варианты выживают и начинают играть главную роль в эпидемиологии данного заболевания. Именно они и становятся источниками формирования тех клонов бактерий, которые обеспечивают эпидемическое распространение возбудителя. Решающую роль в распространении лекарственной устойчивости, в том числе множественной, играют R-плазмиды благодаря способности их к самопереносу.

Биохимические основы антибиотикорезистентности

Можно выделить следующие пять биохимических механизмов формирования резистентности:

1. Разрушение молекулы антибиотика. Такой механизм лежит главным образом в основе формирования устойчивости к бета-лактамным антибиотикам. Бета-лактамазы, разрушая структуру пенициллинов и цефалоспоринов, обеспечивают устойчивость к ним бактерий.

2. Модификация структуры молекулы антибиотика, в результате которой утрачивается ее биологическая активность. Гены, содержащиеся в R-плазмидах, кодируют белки, которые вызывают различные модификации молекул антибиотика путем их ацетилирования, фосфорилирования или аденилирования. Именно таким путем инактивируются аминогликозиды, макролиды, хлорамфеникол, клиндамицин и другие антибиотики. Существуют целые семейства генов, определяющих инактивацию того или иного антибиотика даже по одному из указанных выше механизмов. Например, среди клинических штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий обнаружены различные изоферменты аминогликозидфосфо-, – ацетил– и – аденилтрансфераз, обеспечивающие устойчивость бактерий к различным спектрам аминогликозидных антибиотиков.

3. Изменение структуры чувствительных к действию антибиотиков мишеней. Изменение структуры белков рибосом 70S лежит в основе устойчивости к стрептомицину, аминогликозидам, макролидам, тетрациклинам и другим антибиотикам. Изменение структуры бактериальных гираз в результате мутации приводит к формированию устойчивости к хинолонам; РНК-полимераз – к рифампицину; пенициллинсвязывающих белков (транспептидаз) – к бета-лактамам и т. п.

4. Образование бактериями «обходного» пути метаболизма для биосинтеза белка-мишени, который оказывается нечувствительным к данному химиопрепарату, – механизм, который лежит в основе резистентности к сульфаниламидным препаратам. 5. Формирование механизма активного выведения из клетки антибиотика, в результате чего он не успевает достичь своей мишени (один из вариантов устойчивости к тетрациклинам).

Необычный механизм устойчивости к изониазиду обнаружен у Mycobacterium tuberculosis. Действие изониазида на туберкулезную палочку зависит от наличия у последней плазмиды, в составе которой имеется особый ген. Продукт этого гена превращает неактивный изониазид в активную форму, которая разрушает бактериальную клетку. Утрата этого гена обусловливает устойчивость M. tuberculosis к изониазиду.

В некоторых случаях инактивацию антибиотиков, которая лежит в основе резистентности к ним, бактерии могут осуществлять разными механизмами. Так, например, существует три механизма, ответственных за формирование устойчивости к бета-лактамным антибиотикам: слабая проницаемость наружной мембраны клеточной стенки грамотрицательных бактерий, обеспечивающая природную устойчивость; изменение структуры пенициллинсвязывающих белков в результате мутаций, которое приводит к утрате их сродства к антибиотику; продукция бета-лактамаз, разрушающих антибиотик. Существует три типа устойчивости и к тетрациклинам: 1) устойчивость, определяемая выносом тетрациклина из клетки белком цитоплазматической мембраны; 2) устойчивость, определяемая изменением структуры белка-мишени рибосом; 3) устойчивость, определяемая модификацией тетрациклина в неактивную форму.

Возможно, у бактерий существуют и другие механизмы формирования устойчивости к лекарственным препаратам.

Таким образом, в ответ на мощный натиск, который предпринял человек на бактерии с помощью антибиотиков, они ответили уникальными биологическими реакциями, сила которых не уступает силе атаки. На каждый новый антибиотик бактерии давали адекватный ответ: появлялись резистентные к нему штаммы, которые и сводили на нет биологическую активность этого препарата. Так было и так будет всегда. С этим нельзя не считаться и этого нельзя не учитывать. Поэтому следует постоянно искать пути преодоления этого препятствия, ибо пока существуют инфекционные болезни, их надо уметь эффективно лечить. Пути преодоления устойчивости к лекарственным препаратам будут рассмотрены ниже.

Возникает вопрос: каковы возможности и пути образования лекарственной устойчивости у бактерий? Поскольку они формируются только на генетическом уровне, то возникает и другой вопрос: откуда появляются новые гены лекарственной устойчивости? Устойчивость, возникающая как следствие мутации, объяснима и понятна, но не она играет основную роль. Основная роль принадлежит генам, которые содержатся в R-плазмидах, а они ведь не могут возникать сразу, de novo. Следовательно, в природе должен существовать своеобразный фонд генов лекарственной устойчивости, откуда бактерии могут постоянно «захватывать» те гены, которые необходимы для них в данной ситуации. Наиболее вероятно, что такой фонд образуется за счет генов, имеющихся у продуцентов антибиотиков. Каждый из них защищен от синтезируемого им антибиотика. Эта самозащита контролируется соответствующим геном. Следовательно, сколько бы ни было в природе антибиотиков, против каждого из них должен быть и ген самозащиты, ген устойчивости к этому антибиотику. В природе, особенно в почве, а также в кишечнике человека и животных, микроорганизмы сосуществуют в столь тесных взаимоотношениях, что это обеспечивает им постоянную возможность обмена генетическим материалом с помощью различных механизмов, в том числе с помощью конъюгации. Поскольку многие гены лекарственной устойчивости несут в себе транспонируемые элементы, это обеспечивает им высокую мобильность. Они могут перемещаться внутри хромосомы, переходить из хромосом в плазмиды, формировать новые варианты плазмид и подвергаться другим превращениям. Таким образом, обмен генами лекарственной устойчивости между микроорганизмами в естественных условиях, очевидно, вполне возможен. Решающую роль в их распространении среди возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных начинает играть уже сам антибиотик. Опыт показывает, что раньше всего гены лекарственной устойчивости к каждому новому антибиотику появляются у клинических штаммов, а затем начинается их дальнейшая циркуляция в природе. Обладая определенной мобильностью, эти гены сами подвергаются модификации, мутациям, а в результате образуют группы, семейства генов, определяющих устойчивость к различным вариантам модифицированного антибиотика. Хотя многое еще придется изучить в этом плане, но общая тенденция и масштабы развития у бактерий лекарственной устойчивости уже вполне объяснимы.

Каковы же возможные перспективы поиска новых антибиотиков, иначе говоря, какими новыми свойствами должны обладать новые антибиотики, чтобы преодолеть известные у бактерий механизмы защиты от них?

Желателен поиск таких антибиотиков, которые бы:

1) имели иную молекулярную структуру и иные мишени в бактериальной клетке, отсутствующие (или, по крайней мере, хорошо защищенные от данного антибиотика) в эукариотной клетке;

2) обладали новым механизмом транспорта в бактериальную клетку;

3) были бы нечувствительны к защитным ферментам и не индуцировали бы их синтез;

4) отвечали бы всем остальным требованиям, предъявляемым к антибиотикам.

Способы определения чувствительности (резистентности) бактерий к химиопрепаратам

Чувствительными к антибиотикам и химиопрепаратам в клинической практике считаются те микроорганизмы, на которые препарат в концентрации, достигаемой в очаге инфекции, оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие. Поэтому критерии чувствительности возбудителя зависят от концентрации лечебного препарата в очаге инфекции, величины максимальной терапевтической дозы химиопрепарата, его фармакокинетики и токсичности.

Существуют различные способы определения чувствительности бактерий к антибиотикам, но чаще всего используются два из них: метод диффузии в агар с применением стандартных дисков, пропитанных антибиотиком, и метод серийных разведений антибиотика.

Первый из них заключается в использовании заранее приготовленных из фильтровального картона дисков диаметром 6 ± 0,5 мм. В России выпускается более 20 стандартных дисков. Содержание антибиотика в диске указано на этикетке и соответствует рекомендациям ВОЗ. Содержание антибиотика в диске варьирует в зависимости от его терапевтической дозы и выражается в мкг/мл или в единицах действия (ЕД). Диски одного наименования содержат одну дозу антибиотика; она составляет: 5 мкг/мл (рифампицин), 6 мкг/мл или 10 мкг/мл (бензилпенициллин), 10 мкг/мл (ампициллин, метициллин, оксациллин, гентамицин, сизомицин, доксициклин, фузидин), 15 мкг/мл (эритромицин, линкомицин, олеандомицин), 25 мкг/мл (карбенициллин), 30 мкг/мл (цефалексин, цефалотин, неомицин, стрептомицин, канамицин, мономицин, тетрациклин, левомицетин, ристомицин), 300 ЕД (полимиксин). Диски с различными антибиотиками отличаются друг от друга по цвету (белые, зеленые, желтые и т. д.) или коду, который представляет собой первую букву названия антибиотика, вытисненную на диске.

Поскольку определяемая in vitro степень чувствительности микробов к антибиотикам зависит от условий опыта, для получения достоверных и воспроизводимых результатов необходимо точное соблюдение правил, регламентированных соответствующими методическими указаниями, а также использование стандартных питательных сред и дисков. Оценка результатов определения чувствительности основана на установлении зависимости между размером зон подавления роста исследуемых культур вокруг дисков с антибиотиками и значениями минимальных подавляющих концентраций (МПК) соответствующих антибиотиков в отношении тех или иных культур. Установление такой зависимости в соответствии с методическими указаниями позволяет придать оценке результатов полуколичественный характер и отнести исследуемые культуры бактерий к одной из трех категорий: устойчивые, умеренно устойчивые, чувствительные.

Для испытания чувствительности диски с антибиотиками наносят на поверхность агара, на который перед этим засевают исследуемую культуру. На одну чашку помещают не более 6 дисков. Чашки инкубируют в термостате в течение 18 – 20 часов при температуре 35 – 37 °C. После этого с помощью линейки измеряют диаметр зон задержки роста вокруг дисков (включая диаметр самих дисков) с точностью до 1 мм (рис. 59). Оценку результатов проводят с помощью специальной таблицы, имеющейся в «Методических указаниях по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков» (1983). Эта таблица содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов. Перечень основных микроорганизмов, подлежащих эпидемиологическому наблюдению, и их кодовые наименования приведены в табл. 7.

Более точным является количественный метод, позволяющий определить минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика, выраженную в мкг/мл. С этой целью делают серийные разведения антибиотика и добавляют их в жидкую или плотную питательную среду, а затем определяют, при какой минимальной концентрации антибиотика произошло подавление роста исследуемого штамма возбудителя.


Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Рис. 59. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам с помощью стандартных дисков



Таблица 7

Основные микроорганизмы – возбудители инфекционно-воспалительных заболеваний

Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Примечание. Кодовые наименования соответствуют протоколу ВОЗ.


Бактериологические анализаторы. С целью совершенствования методов бактериологической диагностики инфекционных заболеваний и одновременного определения чувствительности возбудителя к антибиотикам разработаны и широко внедряются в практику различные автоматические и полуавтоматические бактериологические анализаторы, которые позволяют избавить бактериолога от значительной части рутинной работы, в широких пределах проводить идентификацию культуры и изучать ее чувствительность к антибактериальным препаратам, быстро получая достоверные результаты. В комплект автоматического бактериологического анализатора (например, серии WalkAway компании Dade AG) входят автоматический анализатор с поддержанием постоянной температуры и влажности, персональный компьютер с программным обеспечением, принтер для нанесения штриховых кодов и принтер для распечатки результатов, прибор для стандартизации мутности. С помощью инокулятора-регидратора суспензия первично выделенной культуры переносится в панели с ячейками, содержащими различные тест-субстраты (более 30), с помощью которых за короткий срок удается дифференцировать многие виды бактерий по их биохимическим свойствам. Кроме того, имеются панели с ячейками, содержащими антибиотики (более 40 препаратов в 30 различных комбинациях). Идентификация и проверка чувствительности к антибиотикам осуществляются за 2 – 3,5 ч спектрофотометрическим и флуоресцентным методами. Система позволяет идентифицировать более 300 видов микроорганизмов, в том числе грамположительные, грамотрицательные, грибы, анаэробы и др. Программное обеспечение позволяет выбирать наиболее эффективный лекарственный препарат с учетом путей его введения, контролировать проводимую антибиотикотерапию, осуществлять ее стоимостный анализ, а также решать вопросы эпидемиологического анализа и контроля, сохранять и обрабатывать полученную информацию.

Побочные реакции, наблюдаемые при антибиотикотерапии

Хотя к антибиотикам предъявляются жесткие требования в отношении их безвредности для человека, в некоторых случаях, особенно при неоднократном или длительном применении, наблюдаются нежелательные реакции, которые можно разделить на следующие 4 группы: аллергические, токсические, эндотоксические и дисбактериозы. Аллергические реакции наблюдаются в тех случаях, когда антибиотик выступает в качестве аллергена. Они не зависят от дозы введенного препарата, могут наступать за первым введением его, но обычно возникают в результате постепенной сенсибилизации при повторных применениях антибиотика. Могут носить характер крапивницы, дерматита, сыпи, ринита и т. п. Наибольшую опасность представляет пенициллиновый шок – реакция гиперчувствительности немедленного типа.

Токсические реакции возникают чаще всего в связи с органотропным фармакодинамическим действием антибиотика и при продолжительном лечении. Проявляются в виде поражения вестибулярного аппарата (неомицин, канамицин, стрептомицин, флоримицин и некоторые другие), почек (полимиксин, бацитрацин, неомицин, мономицин, канамицин, стрептомицин, амфотерицин В и некоторые другие), периферических нервов, различных поражений ЦНС (циклосерин, неомицин, полимиксин, гризеофульвин, пенициллин, стрептомицин и некоторые другие) и других нарушений.

Наиболее тяжелым бывает токсическое воздействие на кровь: агранулоцитоз, апластическая анемия (левомицетин).

Эндотоксические реакции развиваются в тех случаях, когда под влиянием антибиотика происходит массовое разрушение грамотрицательных бактерий, сопровождающееся выделением и поступлением в кровь их эндотоксина (липополисахарида).

Одним из самых частых осложнений, особенно при длительном применении антибиотиков с широким антимикробным спектром, являются дисбактериозы. Они развиваются в результате того, что применяемый антибиотик действует не только на возбудителя, но и на нормальную микрофлору, угнетая ее. Это ведет к тому, что беспрепятственно начинают размножаться те микроорганизмы, которые к этому антибиотику нечувствительны. Чаще всего это стафилококки, дрожжеподобные грибы Candida, клостридии, некоторые грамотрицательные палочки (псевдомонады, протей и др.). Наиболее тяжело протекают генерализованный кандидоз (кандидосепсис); стафилококковый энтероколит; псевдомембранозный колит, вызываемый Clostridium difficile; вторичные пневмонии, вызываемые стафилококком и грамотрицательными палочками.

Некоторые принципы рациональной антибиотикотерапии

Рациональное лечение антибиотиками должно строиться на основе знания индивидуальных особенностей пациента, течения заболевания, биологии возбудителя и его отношения к антибиотикам, а также свойств назначаемого препарата (препаратов). По мнению С. М. Навашина, необходимо придерживаться следующих основных принципов рациональной антибиотикотерапии:

1) выделение и идентификация возбудителя, изучение его антибиотикограммы;

2) выбор наиболее активного и наименее токсичного препарата;

3) определение оптимальных доз и методов введения на основе знания особенностей кинетики антибиотика в организме больного для создания в крови, жидкостях и тканях организма терапевтических концентраций, превышающих в 2 – 3 раза минимальную подавляющую концентрацию для данного возбудителя;

4) своевременное начало лечения и проведение курсов антибиотикотерапии необходимой продолжительности вплоть до полного закрепления терапевтического эффекта;

5) знание характера и частоты побочных явлений при назначении антибиотиков, особенно в условиях нарушения их распределения в организме больного при некоторых патологических состояниях, например почечно-печеночной недостаточности;

6) комбинирование антибиотиков между собой и с другими препаратами с целью усиления антибактериального эффекта, улучшения их фармакокинетики и снижения частоты побочных явлений.

Эффективность антибиотикотерапии может быть значительно повышена при комбинированном применении препаратов. При сочетании бактерицидных антибиотиков в большинстве случаев действие их усиливается. Комбинация антибиотиков с бактериостатическим действием вызывает суммирование эффекта или не оказывает дополнительного влияния на возбудителя. Сочетание же бактерицидных и бактериостатических антибиотиков нежелательно, так как может привести к их антагонизму (например, пенициллин + тетрациклины). Наиболее эффективными признаны сочетания антибиотиков, которые оказывают синергидный эффект – резкое усиление терапевтической активности:

пенициллины + аминогликозиды,

тетрациклины + макролиды,

пенициллины + сульфаниламиды.

Ни в коем случае нельзя комбинировать антибиотики с идентичным характером побочных реакций (например, ото-, нефро-, гепато-, гемотоксичность).

В тех случаях, когда необходимо прибегать к эмпирическому лечению антибиотиком (т. е. до выделения возбудителя и определения его антибиотикограммы), лучше всего применять тот препарат, который обладает широким антимикробным спектром и к которому еще нет резистентности, например аугментин.

Часть пятая

УЧЕНИЕ ОБ ИММУНИТЕТЕ

Глава 21

Основные этапы развития учения об иммунитете

Давно было известно, что человек, перенесший опасную заразную болезнь, как правило, второй раз ею не болеет. Об этом писал в своей «Истории» древнегреческий историк Фукидид (около 460 – 400 лет до н. э.). Описывая Пелопоннесскую войну, он отмечал, что во время эпидемии никто не заболевал дважды и что уход за больными осуществляли переболевшие.

Не менее древними были и попытки использовать эти наблюдения с целью обезопасить себя от заразных заболеваний, в особенности от такой тяжелой болезни, как оспа. В Китае еще в XI в. до н. э. был разработан метод предупреждения заболевания оспой, получивший название вариоляции. Он заключался в том, что оспенные корочки (струпья) растирали в порошок и вносили в нос. В Индии натирали кожу до ссадин и прикладывали к ней ткань, пропитанную оспенным гноем. Все это делалось для того, чтобы вызвать легкую форму оспы и уберечься от тяжелой формы болезни. Метод вариоляции сохранился до XVIII в. н. э. Он был далеко не безопасен, так как при этом наблюдались и тяжелые формы оспы, а такие лица оставались источником заражения для других. Однако вариоляция наглядно доказала возможность искусственного воспроизведения иммунитета путем перенесения заболевания в легкой форме и подготовила общественную мысль к восприятию идеи вакцинации, предложенной в 1798 г. Э. Дженнером. Убедившись после многолетних наблюдений в том, что лица, перенесшие коровью оспу, не болеют натуральной оспой, Э. Дженнер в 1796 г. во время вспышки заболевания привил мальчику Джеймсу Фиббсу коровью оспу – вакцину (лат. vacca – корова) от молочницы С. Нельмс, а затем через 1,5 месяца заразил его содержимым из пустулы больного оспой, и ребенок оспой не заболел. Эти опыты Э. Дженнер повторил много раз и в 1798 г. опубликовал результаты своих наблюдений. Его метод, несмотря на многие препятствия, стал быстро распространяться. Уже через два года было привито более 100 тыс. человек. В России первая прививка против оспы по методу Дженнера была сделана в 1801 г. мальчику из сиротского дома Антону Петрову, получившему после этого фамилию Вакцинов.

Открытие Э. Дженнера было величайшим достижением в борьбе с оспой. Оспа на Земле была ликвидирована с помощью вакцинации в 1974 г. Однако это открытие в течение многих лет мало способствовало развитию иммунологии, для ее развития нужно было знать природу заразных заболеваний. Поэтому только после работ Л. Пастера, выяснившего природу этих болезней, открытие Дженнера предстало в новом свете и оказало несомненное влияние на последующее становление и развитие иммунологии и прежде всего на работы самого Л. Пастера в этой области. Его собственные опыты с возбудителями куриной холеры, сибирской язвы и бешенства доказали возможность искусственного получения вакцин (Л. Пастер сохранил этот термин и сделал его нарицательным) путем ослабления (аттенуации) патогенных свойств возбудителя. Поэтому с именем Л. Пастера связывается первый период в истории иммунологии.

Л. Пастер научно обосновал основной принцип борьбы с инфекционными болезнями – создание искусственного коллективного иммунитета против них. Однако сам Пастер не занимался изучением сущности явления иммунитета. Основными творцами учения об иммунитете стали русский ученый И. И. Мечников со своими многочисленными учениками и последователями и немецкий ученый П. Эрлих со своими последователями и сотрудниками. Именно их работами был заложен фундамент новой науки – иммунологии – и определены основные направления ее развития.

И. И. Мечников, изучая воспалительные процессы у различных групп животных, обратил внимание на то, что вводимое в их организм инородное тело всегда окружалось подвижными амебовидными клетками мезодермы, способными его заглатывать. Такие клетки являются непременными участниками воспалительных процессов как у животных, имеющих кровеносную систему, так и у организмов, лишенных ее. Процесс поглощения чужеродных элементов этими клетками И. И. Мечников назвал фагоцитозом (греч. phagein – пожирание), а сами клетки – фагоцитами. Изучив подробно фагоцитоз, И. И. Мечников показал, что у простейших он служит целям питания, а у многоклеточных – целям их защиты. Свои классические опыты для доказательства защитных функций фагоцитов И. И. Мечников произвел над маленькими пресноводными рачками (Daphnia), наблюдения над которыми облегчались их прозрачностью. Дафнии заража